Name: 의 감각 뉴런의 분리 군소 californica 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 Aplysia 감각 뉴런 분리 및 패치 클램프 기법을 이용한 이온 전류 측정 방법. 효소 소화와 단기 배양을 통해 신경 생물학 연구에 활용할 수 있는 전기생리학적 특성을 분석합니다.

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NIH P40 OD010952, Korein 재단, SLC 마이애미 원정대의 대학과 공격력 MAYTAG 휄로우 십. 저자는 기꺼이 군소뿐만 아니라, 로렌 Simonitis과 그림에 대한 현미경을 제공 한나 펙을위한 국가 자원의 직원을 인정합니다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 1 일에, 무게와 동물을 마취. <ol><li> 30 G-1kg 동물의 무게. 등장 MgCl : 1시 1분 해수의 5-10 동물의 볼륨을 마취. 이러한 연결 airstone와 전기 수족관 공기 펌프로 통기와 함께 1 시간 동안 6H 2 0. </li></ol></li><li> 해부 용품을 준비합니다. <ol><li> 같은 패브릭 핀으로 스테인레스 스틸 직선 핀, 깨끗 해부 트레이를 조립합니다. + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 여러 배양 인공 해수를 포함하는 요리 (표 1 및 3 참조 ASW)을 조립 </li><li> 준비 저전력 현미경이있다. 깨끗한 절개 악기와 같은 늑골이있는 코와 미세 수술 집게로 준비하고, 정밀하고 큰 수술 가위있다. 사용하기 전에 70 % isopropol 알코올과 악기를 스프레이하고 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 절개 트레이에 위치 동물입니다. <ol><li> 절개 트레이에 위치 동물의 복부 측면 아래로. 핀 동물신체 벽 parapodial 테두리 만 등의 표면을 노출, 꼬리와 머리를 방지하고 성기 홈의 가장자리를 통해 </li><li> 실행 속도가 느린 차가운 수돗물 등의 표면을 씻어. 성기 홈을 따라 스퀴즈 병 및 머리의 정상에 70 % isopropol 알코올의 빛 스트림을 적용합니다. </li></ol></li><li> 초기 절개를합니다. <ol><li> 얕은을 자르기에있는 동안 저전력 현미경을 사용하여 (표 2 참조) 성기 홈이 전방 쉘 여백에서 유래 점을 관찰 할 수 빛의 반사, tautly, 늑골 코 집게이 원점의 왼쪽에 조직의 배 홀드 잘 각도 가위로 성기 홈의 오른쪽에 몸을 벽의 부드럽고 평평한 지역을 통해 모든 방법을 구멍입니다. </li><li> 혈 림프는 때때로 그것으로 복부 신경절과 위장을 들고 구멍에서 부어 관찰해야한다. </li></ol></li><li> 절개를 확장합니다. <ol><li> 일을 확장하는 큰 가위를 사용하여전방 rhinophores 사이의 지점에 전자 절개, 낮은 블레이드 위쪽으로 당기면서하면 직감을 새김 눈 방지 할 수 있습니다. 내부 장기를 절개 밖으로 유출 관찰됩니다. </li></ol></li><li> 신경을 제거합니다. <ol><li> 트레이를 옮기고 머리 지역에 현미경을 재조명. </li><li> 깨끗한 포셉 및 미세 가위를 사용하여 한 지점에서 그룹으로 흉막 페달과 대뇌 신경을 제거하는 식도 주위에 반지에 머리 신경절을 형성하는 신경을 절단하는으로 머리 신경절을 제거합니다. </li><li> 식도의 복부 측면을 준수 구강 신경절을 제거합니다. </li><li> 이 신경절에서 4 큰 신경 접속사가 문제를 절단하여 복부 신경절을 제거합니다. </li></ol></li><li> 관심 신경절을 분리합니다. <ol><li> 신경절의 최소 직경과 동일합니다 그 각각의 신경절에 연결 접속사의 길이를 떠나, 떨어져 머리를 신경 트림,이 효소 지체 과다 소화다음 단계에 대한 관심의 세포. </li><li> ASW의 2 헹굼 + 깨끗한 포셉 린스 간 이동 P / S를 통해 각 대상 신경절을 넣어. </li><li> PVC 세포를 대상으로하는 경우, 오른쪽 페달 hemiganglion에 연결된 오른쪽 흉막 hemiganglion을두고 마찬가지로 왼쪽 페달 hemiganglion에 연결된 왼쪽 흉막 hemiganglion을 둡니다. </li><li> 불필요한 신경 및 허용 연구 방법에 따라 동물의 나머지를 버린다. </li></ol></li><li> 효소 신경을 소화. <ol><li> 각 신경절의 경우, 3.75 MG 디스 파제 (dispase), 1 밀리그램 히알루 및 ASW의 ML 당 0.3 g 콜라 유형 XI로 구성된 효소 용액 1 ㎖를 준비하고 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 + P / S. </li><li> 장소는 효소 용액에 신경을 씻어서 뚜껑을 꼭 부착합니다. 약 23에서 하룻밤 13-5 시간 동안 느린 속도로 회전하는 셰이커 (표 2 참조)에 자사의 측면에 튜브를 놓습니다 ° C (실내 온도). </li></ol></li><li> 준비배양 접시. <ol><li> microdissection을하기 전에 (2 일), 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 조직 문화 후드에서 배양 접시를 준비합니다. ~ 25 분 35 밀리미터 접시의 중앙에 ~ 0.5 ML PDL를 (0.2 ㎎ / 멸균 ml의 물)를 추가합니다. </li><li> 멸균 물을 3 배 PDL을 씻어. 건조하도록 허용합니다. 접시를 UV-소독. </li></ol></li><li> 하루에 2 뉴런을 분리합니다. <ol><li> PDL 코팅과 달리 건조 그릇 안에 미디어의 섬을 만들 ASW + P / S의 약 0.5 ml의 살균 UV 있었다 35mm 요리의 중심을 입력합니다. 이 조직 문화 후드 외부 벤치에 수행 할 수 있습니다. 한 접시 hemiganglion에서 발생하는 각 셀의 클러스터에 대해 준비를해야합니다. </li><li> 실 가드 코팅에 의해하고 (표 3 참조) 핀 및 프로브로 사용되는 여러 가지 크기의 미세 해부 핀으로 장착 5mm 깊이 해부 표면을 경화 준비 100 mm 직경 해부 접시가있다. ASW와 + P / S, 그리고 마지막으로 인터넷 다음, 70 % isopropol의 알코올이 요리를 씻어그것은 ASW + P / S로 어떠냐 </li></ol></li><li> 소화 신경의 microdissection을 준비합니다. <ol><li> 해부 접시에 소화 흉막 페달 및 구강 신경절을 포함하는 효소 용액을 붓는다. </li><li> 반사 조명 아래 검은 색 표면에 대한 현미경의 무대에서 접시를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 결합 조직을 사용하여 각 흉막 페달 hemiganglion의 등쪽면을 아래로 핀. 조직 부드러운 스트레칭의 관용 될 것입니다. </li></ol></li><li> PVC 신경을 Microdissect. <ol><li> 깨끗한 미세 집게 2 쌍을 사용하고 프로브 등 포셉 한 쌍의 미세 절개 핀을 들고, 흉막 hemiganglion에서 PVC 세포를 분리. 효소 분해 제거 또는 PVC 클러스터를 덮고있는 결합 조직 칼집 떨어져 깨진, 아직 세포가 서로를 준수 할 것. </li><li> 페달 흉막 결합 18에서 이러한 세포를 분리하기 위해 프로브를 사용하여, 다음 해부의 바닥에 세포 클러스터 떨어지게요리. </li></ol></li><li> 문화 요리에 신경을 전송합니다. <ol><li> 부드럽게 공기 방울을 도입하지 않도록주의하고, 그 문화 접시에 매체 섬으로 천천히 분배, 약간 불 광택 일회용 유리 파스퇴르 피펫의 끝으로 클러스터를 빨아들이 준비한 35mm 배양 접시에 세포 클러스터 전송 피펫으로. 별도의 배양 접시에 다른 hemiganglion과 장소의 PVC 클러스터의 분리를 반복합니다. </li></ol></li><li> BSC 신경을 Microdissect 및 전송할 수 있습니다. <ol><li> 관심의 세포를 절약하는주의 최대 구강 신경절 복부 측면을 핀. 구강 신경절 (10)의 2 BSC 세포 클러스터와 단계 1.12를 반복합니다. </li><li> PVC 클러스터를 포함하는 BSC 클러스터와 2 요리를 포함하는 2 요리 : PVC와 BSC 뉴런의 분리는 신경 세포의 클러스터를 포함하는 4 배양 접시를 생성합니다. 신경의 나머지를 삭제하고 100mm 해부 접시를 따로 설정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Dissoc세포 클러스터를 늦. <ol><li> 저전력 현미경의 무대에 세포를 포함하는 배양 접시를 놓고 덮개를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 포셉에서 개최 미세 해부 핀 세포 클러스터에 인접한 문화 접시의 바닥을 쓸어 PVC 클러스터를 떼어 놓다. 가볍게 치기는하지만 플라스틱의 반점을 찾아 내려고 노력으로 접시의 바닥의 플라스틱으로 핀의 끝을 파고있다. 플라스틱 마찰 핀 포인트를 놓을 때, 타악기 파가 떨어져 세포의 근처의 덩어리를 나누기 매체를 통해 생산됩니다. </li><li> 5-10 제스처는 거의 완전히 세포를 떼어 놓다 필요하지만 세포가 기계적 깎아 지른듯한 의해 파괴되지 않도록 너무 가볍게하기보다는 세포의 작은 클러스터를두고하는 것이 좋습니다 수 있습니다. </li><li> 커버 및 기타 문화 요리와 함께 반복을 대체합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양을 저장합니다. <ol><li> 해리 세포의 가운데에있는 미디어 제도를 포함하는 배양 접시에 배치같은 150 × 25 mm 둥근 플라스틱 페트리 접시로 공기 순환을 허용하고 17 ° C.에 보육 세트에이 접시를 놓고 대형 컨테이너 </li><li> 챔버 습도의 소스로 물을 오픈 접시를 설치합니다. 하룻밤 그대로 둡니다. 세포는 접시의 중앙에있는 폴리 - D - 라이신 코팅을 준수합니다. </li></ol></li><li> 홍수 문화 요리. <ol><li> 3 일에 조심스럽게 ASW의 2.5 ML를 요리 홍수 + P / S. 검사 및 역 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 계산합니다. 17 ° C 배양기에있는 상점. </li></ol></li></ol> 2. 전기 생리학 방법은 (예를 들어 Sakmann 및 Neher, 1995) 수많은 텍스트에 16을 설명했습니다 그 죄는 표준 패치입니다. 이 프로토콜은 세포 ≤ 100 PF 커패시턴스, 또는 셀 &lt;프로토콜의 일 3, 4시 60 μm의 직경을 작동합니다. 프로세스가없는 세포는 녹음에 최적입니다. 다음과 같은 특별한 considerat이온이 적용됩니다 : <ol><li> 큰 세포는 β = 0.1로 설정 Axopatch 200B 앰프의 구성 설정을 수용 할 수 있습니다. 매우 큰 전류의 활성화는 세포 전압 클램프를 탈출하는 원인이 될 수 있습니다. ASW 솔루션 (불 침투성 N-메틸-D-글루 카민 염화로 치환 된 염화나트륨의 예를 들어 분수) 소금 함량을 대체 전체 셀 전류 진폭을 줄일 수 있습니다. </li><li> 피펫 풀러를 뽑아 KCl을 다른 소금 450 ​​밀리미터 (표 1 참조)으로 구성된 세포 내 용액 (ICS)와 중간 채워질 섬유 채워진 붕규산 패치 피펫가 적합하며, 약 0.5 mOhms 온 저항이 있어야합니다. 특정 이온 전류의 차단이 필요한 경우, 예를 들어, 나는 + K 전류, K +이 솔루션의 부재에서 전류와 같은 고사 + 등의 이온으로 대체 될 수 있습니다. CL - 더 자연 ICS가 필요한 경우 impermeant 음이온와 ICS의 교환도 보증9. </li><li> 세포는 실온에서 가능&gt; 1 시간 - 긴 녹음과 강력한입니다. 기록 문화의 24-48 시간에 해당하는 일 3 프로토콜의 4 최적입니다. 48 시간 후 어려움 때문에 세포 표면에 glycocalyx의 정교화, 아마 기가 옴 물개를 형성하고, 공정 부산물에 의한 공간 클램프 문제가있다. 세포는 &lt;14 D에 완료 할 수 있습니다와 같은 독극물과 같은 비 패치 클램프 연구를위한 유용한, 그러나이다. </li><li> ASW와 다른 솔루션 중력 공급 솔루션 장치에서 분배 할뿐만 아니라, 세포 내 솔루션을 통해 필터링해야 기가 옴 씰 형성을 방해 미세 입자를 제거하기 위해 0.2 μm의 Acrodisk 필터 (표 3) 주사기 장착. </li><li> 같은 D-아스파 라진 산염 (D-ASP)를 같은 작용제를 사용하는 경우 탈감작이 발생하므로 작용제의 응용 프로그램 사이에 1-2 분 ~를 추천합니다. 반대로, 상승 작용은 종종 신속하게 반복 응용과 관찰이러한 L-글루타민산 (L-글루) 등의 작용제의 양이온. </li><li> 이러한 L-글루 등의 작용제 작동 전류는 picospritzer 피펫 작용제를 적용하여 공부하실 수 있습니다. 이 피펫은 패치 피펫과 동일하게 뽑아 ASW의 작용제를 포함합니다. 이 피펫 팁 중력 공급 솔루션 장치의 유출 파이프 아래에 위치하며, 유출 관 (그림 2F)에서 45 ° 각도로 작용제를 신속하게 셀에서 씻겨되며, 탈감작을 최소화 할 때. 작용제 피펫은 90 ° 또는 패치 피펫에 더 상대의 각도를 만들어야합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터 while15 시간은 PVC 클러스터에 대한 최적의 소화에 충분하다. 배양 접시에서 낮은 세포 수율은 효소 시간이 부족에 기인하거나, 하나의 셀 전송 단계 (1.11 1.12) 중 또는 플릭 단계 (1.13) 동안 너무 기계적 중단. 할 수 있습니다 문화 기판 아래로 붙어 세포의 실패뿐만 아니라, 문화의 짧은 생존은 일반적으로 너무 많은 기계적인 방해로 인해 발생합니다. 막 오염뚜가 발생할 수 있으며, 최고의 마취 동물이 잘 해부 계기가 깨끗한 지, 세척 및 관심 신경절은 ASW의 여러 린스 + P / S. 겪어야하는 것...

해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 7, 8의 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard 10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 21 시냅스를 형성 할 수 . 우리는 다른 사람 1, 3, 6, 14, 15, 16 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에서 이온 전류를 공부합니다. 많은 군소 뉴런은 오랫동안 실험 조작을위한 시간을 허용하는 클램핑 패치의 반복 라운드까지 서있다. 이 기술은 같은 복부 신경절의 neurosecretory 가방 세포와 분리 우리가 설명 흉막 및 구강 신경의 감각 신경으로 신경 유용합니다,하지만 매우 큰 뉴런&gt; 60 μm의 같은 L7으로 직경 또는 R2 복부 신경절. 우리는 다른 설명 감각 - motoneuron 공동 배양과는 달리, 우리의 문화에서 군소 혈청을 사용하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 얻은 대부분의 뉴런은 t에 대한 프로세스없이됩니다그는 전체 셀 전압 녹화를 촉진 문화의 첫 48 시간,하지만 그 새싹과 영양분 및 / 또는 성장 인자의 부족으로 사망하기 전에 약 14 일 동안 축삭과 다른 프로세스를 자세히 설명합니다. 이 기술은 구강 및 흉막 신경의 생리적 문서화 지역의 접시 당 50-100 뉴런의 차 문화를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 실험은 동물마다 복제 요구하는 실험에서 단일 세포 생리학의 여러 측면을 연구하는 데 유용합니다. 그것은 일치 처리 및 통제 문화에서 공부하는 혜택을 허용, 왼쪽과 오른쪽 hemiganglia에 표적 세포의 해부학 적 분리에 의한 문화의 일치하는 쌍을 생성합니다. 프로토콜은 구강 신경의 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런, 그리고 흉막 신경절의 흉막 ventrocaudal (PVC) 뉴런을 대상으로합니다. 이러한 세포는 전체 셀 전압 녹음 및 디스플레이 robus에 적절한 사이즈입니다T 글루타메이트 반응. 논의 방법론은 군소 신경계에있는 대부분의 신경에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>인공 해수 ASW</td><td>시그마-알드리치</td><td>모듬</td><td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2(6H2O), 15 Hepes-NaOH, pH 7.6</td></tr><tr><td>세포 내 용액</td><td>시그마</td><td>모듬</td><td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA 및 40 Hepes-KOH, pH 7.4</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신이 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc</td>.에 ASW에 추가되었습니다.<td>17-603E</td><td>5,000 단위/ml 페니실린 플러스 5,000 mg/ml 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>중성 분포 II</td><td>Roche 진단</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>히알루로니다제</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 XI형</td><td>시그마-알드리치</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타메이트 (L-Glu)</td><td>시그마-알드리치</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-아스파르테이트 (D-ASP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA)</td><td>바이오몰</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ASP</td><td>시그마</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>알파-아미노-3-하이드록실-5-메틸-4-이소옥사졸-프로피온 산 (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glu R 길항제</td>, <td>다양</td><td>한</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>한천</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>키누레네이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR 길항제)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염소화 용액</td><td>Sigma</td><td>다양한</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml 농축 HCl + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>실가드 실리콘 2-부분 폴리머</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>작은 해부 접시를 위한 핀아웃 표면 제공</td></tr><tr><td>0-40x 줌 확대 현미경 해부용</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 와트 광섬유 조명기</td><td>플로리다의 마이크로옵틱</td>스 <td>TQ FOI-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RotoMix 50800 오비탈 믹서</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4x, 20x(옵션) 및 40x 대물렌즈가 있는 Nikon Diaphot 도립 위상차 현미경</td><td>SR Research Ltd.</td><td>아이링크 II</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>텍트로닉스 디지털 오실로스코프</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 데이터 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Windows XP 이상의 운영 체제가 설치된</td><td>PC 솔루션</td><td></td><td>Thinkserver는 솔리드 스테이트 하드 드라이브(80GB)와 저소음 모니터가 있는 Flaming</td></tr><tr><td>/Brown P87 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axon Instruments Axopatch 200B 클램프 증폭기는 1-1000 pF의 용량 보상 범위를 가지고 있습니다; 프리앰프</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axopatch 200B 프리앰프 분자 장치용 Axon Instruments 전극 홀더 어셈블리</td><td>, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 A/D 컨버터</td><td>분자 장치, 캘리포니아</td><td></td>주 서니베일<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer, 압력과 지속 시간에 맞게 조정 가능한 N2로 구동</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G 진동 차단 테이블</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td></td><td></td><td>맞춤 제조</td></tr>, <tr><td>Burleigh 압전 조가비 미세 조작기</td>, <td>Burleigh Instruments; Thorlabs는</td><td></td><td>현재 PCS-5000; -6000 시리즈 +</td></tr><tr><td>마운트 Narishige M-152 수동 매니퓰레이터 (관류 시스템 및 피코스 프리처 용)</td> <td>Narishige USA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>필라멘트 피펫 유리, 1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3인치 길이</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 반쪽 전지</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브, 35-2097 BD Falcon* 원심분리기 튜브</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>각도 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar 파인 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35mm 매 조직 배양 접시</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>팔콘 150 x 25 mm 조직 배양 접시; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td>은 실가르드 실가드 WPI SYL184<td>를 사용하여 작은 해부 접시로도 만들 수</td></tr> 있습니다<tr><td></td><td></td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>동물 해부 트레이</td><td>다양한</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15ml 원심 분리기 튜브, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>6 구멍 중력 공급 관류 시스템 용</td></tr><tr><td>나사 구멍 끝이있는 알루미늄 클립</td><td>철물점</td><td></td><td>관류 시스템</td></tr><tr><td>용 23 게이지 바늘 (수동 파일 오프 포인트)</td> <td>VWRSP</td><td></td><td>관류 시스템</td></tr><tr><td>용 폴리에틸렌 튜빙 0.022 "ID x 0.042"OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>용 관류 시스템</td></tr><tr><td>H-7 피펫 스탠드/홀더 마이크로캡 관류 어레이</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>관류 시스템용</td></tr><tr><td>단방향 밸브</td><td></td><td></td><td>관류 시스템용</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>관류 시스템용</td></tr><tr><td>흡입용 18게이지 바늘(필드 오프 포인트)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E+11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 해부 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>모세관</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td>은 <td>분젠 버너 불꽃에서 불 연마 및 U자형으로 만들어졌으며 ECS</td></tr><tr><td>모델링 점토</td><td>공예품 상점에서</td><td></td><td></td></tr> 3% 한천으로 채워져 있습니다.<tr><td>격리된 지상 욕조</td><td></td><td></td>가 있는 현미경 스테이지용 식기 홀더 <td>맞춤형</td></tr><tr><td>제조 파스퇴르 피펫</td><td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫 전구</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>acrodisk 주사기 필터</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>두꺼운 벽의 1.5 mm 직경 보로실리케이트 필라멘트 유리</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>고순도 질소 실린더 및 분기 레귤레이터</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">표 1-3. 시약, 재료 및 장비 목록.</td></tr></tbody></table>

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.

이 프로토콜에서 대상으로하는 신경에서 감각 신경의 위치는, BSC 및 PVC 뉴런은 그림 1에 표시됩니다. BSC의 뉴런은 구강 신경절, 그대로 신경절 (그림 1A)에서 구강 질량에서 멀리 얼굴 표면의 복부 측면에 2 대칭 타원형 클러스터에 있습니다. PVC 뉴런은 중앙 축 (그림 1B)쪽으로 흉막 신경의 등쪽 표면의 주위에 래핑하는 양측, V-모양의 클러스터를 형성합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 클러스터 사건의 약 1 %에서 개별 동물에 누락되어 있지만, 이러한 감각 뉴런은 신경 내의 박힌 위치의 장점이 있습니다. BSC와 PVC 신경 세포 클러스터는 세포막의 다크 오렌지 색상과 그림 1A의 큰 원형 개요에 나와 근처의 세포에 비해 상대적으로 작은 크기로 식별됩니다. 문화, 이러한뉴런은 공정하지 않고 종종 도금 다음날 (그림 2A)이며,</str...

우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명<em&gt; 군소</em&gt; 마취 후, 단기 - 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 ​​셀 이온 전류의 녹음 격리.

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

본 절차의 전반적인 목적은 단기 배양 상태에서 개별 감각 신경세포를 분리하는 것입니다. 패치 클램프 연구를 위해, 먼저 마취된 동물로부터 감각 세포를 포함하는 신경절을 해부하여 추출합니다. 그 다음 단계로, 효소 용액에서 신경절을 밤새 소화시킵니다.다음으로, 소화된 신경절에서 분석 대상인 감각 뉴런을 분리합니다. 마지막 단계로, 준비된 배양 접시를 배양 기질에 하룻밤 동안 부착시키기 위해 해리 과정을 거칩니다. 최종적으로, 전압 클램핑(voltage clamping)을 이용하여 이 뉴런들에 발현된 전압 및 작용제 개폐 이온 전류를 연구합니다.in situ 세포 기록과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 뉴런을 분리함으로써 단일 전극 전압 고정 기술을 사용할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 학습 및 기억에 관여하는 신경전달물질에 의해 활성화되는 이온 전류의 정체와 같이, aple 신경생물학 분야의 핵심적인 미지수들을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 효소 소화 및 배양 접시 분산 과정에서 뉴런이 매우 민감하게 반응하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.우리는 학습과 기억에 중요한 특정 글루타메이트성 전류가 이 방법으로 제공되는 세포 격리 효과를 통해 이점을 얻을 수 있다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 이 절차를 시연할 사람은 대학원생인 Andy Kesel과 Justin Greer입니다. 마취된 동물을 해부 트레이에 복측이 아래로 향하도록 놓는 것으로 이 절차를 시작하십시오.체벽의 가장자리와 부근의 모서리 부분을 통해 동물을 고정하되, 생식 홈의 등쪽 표면을 노출시키기 위해 꼬리와 머리 부분은 피하십시오. 다음으로, 등쪽 표면을 천천히 흐르는 찬 수돗물로 헹굽니다. 그런 다음, 스퀴즈 병을 사용하여 70% isopropyl alcohol을 생식 홈을 따라 그리고 머리 윗부분에 가볍게 뿌려줍니다.초기 절개를 하기 위해, 리브 노즈 포셉(rib nose forceps)으로 생식 홈(genital groove) 기저부 왼쪽의 조직 주름을 팽팽하게 잡고, 미세 각도 가위로 생식 홈 바로 오른쪽의 매끄럽고 평평한 체벽 부위를 완전히 관통하여 얕은 구멍을 냅니다. 그런 다음, 장기에 손상을 주지 않도록 아래쪽 가위 날을 위로 당기면서, ROF 4번 사이의 지점까지 절개 부위를 전방으로 확장합니다. 이어서, 깨끗한 포셉과 미세 가위를 사용하여 머리 신경절을 형성하는 신경들이 식도 주위의 고리 형태로 변하는 지점을 절단함으로써, 흉막 촉수 신경절(pleural petal ganglia)과 뇌 신경절(cerebral ganglia)을 한 그룹으로 제거합니다.그 후, 식도의 복측에 부착된 구강 신경절(buccal ganglion)을 제거합니다. 분석 대상이 되는 신경절을 분리하기 위해, 각 신경절에 신경절 직경과 동일하거나 그 이상의 길이의 결합 조직이 남도록 머리 신경절들을 잘라 분리합니다. 이렇게 하면 다음 단계에서 효소에 의해 대상 세포가 과하게 소화되는 것을 방지할 수 있습니다.그런 다음 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 인공 해수 접시에서 각 표적 신경절을 두 번 헹굽니다. PVC 세포를 표적으로 하는 경우, 우측 늑재 신경절 반절(right pleural hemi ganglion)을 우측 꽃잎 신경절 반절(right petal hemi ganglion)에 부착된 상태로 두고, 마찬가지로 좌측 늑재 신경절 반절(left plural hemi ganglion)을 좌측 꽃잎 신경절 반절(left petal hemi ganglion)에 부착된 상태로 둡니다. 그 후 헹군 신경절을 효소 용액에 넣고 캡을 단단히 닫습니다.그 후, 튜브를 로터리 쉐이커 위에 눕혀 놓고 약 23 °C에서 13~15시간 동안 밤새 저속으로 설정합니다. 이 과정에서는 PDL 코팅 및 UV 멸균 처리가 된 35 mm 디쉬 중앙에 인공 해수와 penicillin streptomycin을 약 0.5 mm 채워 내부에 배지 섬을 만듭니다. 소화된 신경절의 미세 절편을 준비하려면, 소화된 흉족 및 구강 신경절이 포함된 효소 용액을 절편 디쉬에 붓습니다.다음으로, 반사광 아래에서 검은색 표면을 배경으로 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 그다지 연결 조직을 사용하여 각 흉부 꽃잎 반신경절(pleural petal hemi ganglion)을 등쪽이 위로 향하게 하여 고정합니다. 이때 조직이 부드러워 신축성에 취약하므로 주의하십시오. 그런 다음, 한 손으로 미세 해부 핀을 프로브로 잡고 두 쌍의 핀셋을 사용하여 흉부 반신경절에서 PVC 세포를 분리합니다.프로브를 사용하여 이 세포들을 화분 연결편(connective)에서 떼어냅니다. 그 다음 세포 뭉치가 해부 접시 바닥으로 떨어지게 합니다. 약간 화염 연마된 일회용 유리 파스퇴르 피펫 팁으로 세포 뭉치를 부드럽게 빨아들여 준비된 35 millimeter 배양 접시로 옮깁니다.그런 다음, 피펫에 기포가 들어가지 않도록 주의하면서 배양 접시의 배지 아일랜드에 천천히 분주합니다. 다른 반강절(hemi ganglion)의 PVC 클러스터 분리 과정을 반복하여 별도의 배양 접시에 넣습니다. 여기 우측 흉부 반강절의 V자형 진한 오렌지색 PVC 세포 클러스터의 광학 현미경 사진이 있습니다.BSC 뉴런을 해부하기 위해, 먼저 구강 신경절(buccal ganglion)을 복측이 위로 오게 하여 손상되지 않도록 주의하며 고정합니다. 그다음, 두 쌍의 핀셋을 사용하여 BSC 세포를 분리하며, 이때 핀셋 중 하나로 미세 해부 핀을 프로브로 활용하여 지지합니다.다음으로, 프로브를 사용하여 이 세포들을 구강 신경절(buccal ganglion)에서 분리합니다. 그 후, 세포들이 해부 접시 바닥으로 떨어지게 둡니다. 이 사진 마이크로그래프는 구강 신경절의 글루탐산성 세포(glutamatergic cells)의 위치를 보여줍니다.BSC 뉴런은 진한 오렌지색으로 식별할 수 있습니다. PVC 및 BSC 뉴런을 분리하면 뉴런 클러스터가 포함된 4개의 배양 접시가 생성됩니다. BSC 클러스터가 포함된 접시 2개와 PVC 클러스터가 포함된 접시 2개입니다.나머지 신경절은 폐기하고, 세포 클러스터를 분리하기 위해 100 millimeter 해부 접시를 따로 준비합니다. 세포가 포함된 배양 접시를 저배율 현미경의 스테이지 위에 놓고 덮개를 제거합니다. 세포 클러스터 근처의 배양 접시 바닥을 가볍게 톡톡 쳐줍니다.포셉으로 잡은 미세 해부 핀을 사용하여 세포가 완전히 해리될 때까지 5~10회 정도 가볍게 쳐줍니다. 그런 다음 다른 배양 접시에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다. 이어서, 해리된 세포가 포함된 배양 접시들을 150 by 25 millimeter 원형 플라스틱 페트리 접시와 같이 공기 순환이 가능한 큰 용기에 담습니다.이 배양 접시를 17 °C로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 그 후, 습도 유지를 위해 물을 담은 열린 접시를 챔버 안에 함께 넣고, 세포가 배양 접시 중앙의 polylysine 코팅에 부착될 수 있도록 밤새 그대로 둡니다. 다음 날, 배양 접시에 2.5 mL의 인공 해수와 penicillin streptomycin을 조심스럽게 채운 후, 도립 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 관찰하고 수를 셉니다.배양 1일 차의 살아있는 BSC 뉴런입니다. BSC 세포는 일반적으로 40 microns의 PVC 세포보다 더 큽니다. 여기 보이는 것은 배양 1주일 후 돌기 성장이 나타난 살아있는 PVC 뉴런입니다. AL glutamate 펄스에 반응하여 나트륨 이온에 의해 전달되는 흥분성 전류가 여기 보이며, D aspartate에 반응하는 전류가 여기에 보입니다.NMDA에 의해 활성화되는 전류는 일반적으로 다른 작용제에 의해 활성화되는 전류보다 진폭이 작습니다. 이 절차를 수행할 때는 해리 과정 동안 뉴런이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 기술의 한 가지 장점은 각 신경절에서 두 개의 배양물을 생성하므로, 그중 하나를 실험군 배양물에 대한 짝지은 대조군(match control)으로 사용할 수 있다는 점입니다.이 기술은 plegia 또는 기타 해양 무척추동물로부터 뉴런의 1차 배양물을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경절의 효소 소화를 통해 plegia의 감각 뉴런을 분리하고, 이어서 관심 세포를 주의 깊게 해리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을...

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

우리는 extracellularly 기록하고 신경, 근육, 및 개인 식별 뉴런에서 자극 할 수있는 기술을...

<em&gt; 체외에서</em의 생리적 운동과 수유 모터 프로그램을 도출하도록 의도하고 녹음&gt; 준비<em&gt; Aplysia californica</em

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

배우세요 Aplysia 감각 뉴런 분리 및 패치 클램프 기법을 이용한 이온 전류 측정 방법. 효소 소화와 단기 배양을 통해 신경 생물학 연구에 활용할 수 있는 전기생리학적 특성을 분석합니다.

의 감각 뉴런의 분리

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