의 감각 뉴런의 분리 군소 californica 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

이 절차의 전반적인 목표는 단기 배양에서 plegia의 개별 감각 뉴런을 분리하는 것입니다. 패치 클램프 연구의 경우, 이는 먼저 마취된 동물의 감각 세포를 포함하는 신경절을 절개하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 효소 용액에서 신경절을 하룻밤 동안 소화하는 것입니다.

다음으로, 관심 있는 감각 뉴런을 소화된 신경절에서 해부합니다. 마지막 단계는 하룻밤 사이에 배양 기질에 부착하기 위해 준비된 배양 접시를 해리하는 것입니다. 궁극적으로 전압 클램핑은 이러한 뉴런에서 발현되는 전압 및 작용제 게이트 이온 전류를 연구하는 데 사용됩니다.

현장 세포 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 뉴런을 분리하면 단일 전극 전압 클램핑 기술을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 학습 및 기억과 관련된 신경 전달 물질에 의해 활성화되는 이온 전류의 정체와 같은 aple 신경생물학 분야의 주요 미지의 사항을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 효소 소화에 대한 뉴런의 민감성과 배양 접시로의 분산으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

우리는 학습과 기억에 중요한 특정 글루타메이터 전류가 이 방법이 제공하는 세포 분리의 이점을 얻을 수 있다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 대학원생인 Andy Kesel과 Justin Greer입니다. 마취된 동물의 복부 쪽을 아래로 향하게 하여 해부 트레이에 놓아 이 절차를 시작합니다.

체벽과 파라포알 경계의 가장자리를 통해 동물을 고정하되 꼬리와 머리는 피하여 생식기 홈의 등쪽 표면을 노출시킵니다. 다음으로, 천천히 흐르는 차가운 수돗물로 등쪽 표면을 헹굽니다. 그런 다음 짜기 병에서 70% 이소프로필 알코올을 생식기 홈을 따라 머리 꼭대기에 가볍게 바릅니다.

초기 절개 부위를 만들기 위해 갈비뼈 코집게로 생식기 홈의 기저부 왼쪽에 있는 조직 주름을 팽팽하게 잡고 가느다란 가위로 생식기 홈의 바로 오른쪽에 있는 몸 벽의 매끄럽고 평평한 부분을 통해 얕은 구멍을 잘라냅니다. 그런 다음 절개 부위를 ROF 4 사이 지점까지 앞쪽으로 확장하면서 아래쪽 칼날로 위쪽으로 당겨 내장에 흠집이 나지 않도록 합니다. 다음으로, 깨끗한 집게와 가는 가위를 사용하여 두신경절을 형성하는 신경이 식도를 둘러싼 고리로 변하는 지점을 절단하여 흉막꽃잎과 대뇌신경절을 그룹으로 제거함으로써 두신경절을 제거합니다.

그런 다음 식도의 복부 쪽에 붙어 있는 협측 신경절을 제거합니다. 관심 신경절을 분리하기 위해, 머리 신경절을 잘라내고, 적어도 신경절의 직경과 동일한 각 관심 신경절에 부착된 연결 길이를 남겨 둡니다. 이렇게 하면 효소가 다음 단계에서 관심 세포를 과도하게 소화하는 것을 지연시킬 수 있습니다.

그런 다음 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 인공 바닷물 접시에서 각 표적 신경절을 두 번씩 헹굽니다. PVC 세포를 표적으로 하는 경우, 오른쪽 흉막편신경절은 오른쪽 꽃잎 편협절에 부착된 상태로 두고, 마찬가지로 왼쪽 복수 편미신경절은 왼쪽 꽃잎 편신경절에 부착된 상태로 둡니다. 그런 다음 헹궈낸 신경절을 효소 용액에 넣고 캡을 단단히 부착합니다.

그런 다음 회전식 셰이커에 튜브를 옆으로 눕히고 약 섭씨 13도에서 15-23시간 동안 저속으로 설정합니다. 이 절차에서는 PDL 코팅 및 UV 살균 처리된 35mm 접시의 중앙을 약 0.5mm의 인공 해수와 페니실린 스트렙토마이신으로 채워 내부에 미디어 섬을 만듭니다. 소화된 신경절의 현미해부를 준비하기 위해, 소화된 흉막페달과 협측신경절이 들어 있는 효소 용액을 해부 접시에 붓습니다.

다음으로, 접시를 s에 놓습니다.tag반사된 빛 아래의 검은색 표면에 대한 현미경의 e. 그런 다음 부착된 결합 조직을 사용하여 각 흉막, 꽃잎, hemi, 신경절, 등쪽 쪽이 위로 향하게 하면 조직이 부드럽고 늘어나지 않습니다. 그런 다음 두 쌍의 집게를 사용하여 흉흉 신경절에서 PVC 세포를 분리하고 그 중 하나를 프로브로 사용하는 미세한 해부 핀을 잡습니다.

프로브를 사용하여 꽃잎, 복수, 연결에서 이러한 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포 클러스터를 해부 접시의 바닥으로 떨어뜨립니다. 약간 불에 광택을 낸 일회용 유리 목초지 피펫의 끝으로 클러스터를 부드럽게 빨아들여 준비된 35mm 배양 접시에 세포 클러스터를 옮깁니다.

그런 다음 배양 접시에 담긴 배지 아일랜드에 천천히 분배하고 피펫에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 다른 편신경절의 PVC 클러스터 분리를 반복하고 별도의 배양 접시에 넣습니다. 다음은 오른쪽 흉막 편도 신경절의 V자형 짙은 주황색 PVC 세포 클러스터의 현미경 사진입니다.

BSC 뉴런을 해부합니다. 먼저 배쪽 쪽이 위로 향하게 하여 조심스럽게 여유를 두고 협측 신경절(buccal ganglion)을 핀으로 고정합니다. 그 후 관심 세포는 두 쌍의 집게를 사용하여 BSC 세포를 분리하고 그 중 하나를 프로브로 사용하여 미세 해부 핀을 유지합니다.

다음으로, 프로브를 사용하여 협측 신경절에서 이러한 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포를 해부 접시의 바닥으로 떨어뜨립니다. 이 현미경 사진은 협측핵의 글루타메이트 세포의 위치를 보여줍니다.

BSC 뉴런은 짙은 주황색으로 식별할 수 있습니다. PVC 및 BSC 뉴런을 분리하면 뉴런 클러스터를 포함하는 4개의 배양 접시가 생성됩니다. BSC 클러스터를 포함하는 2개의 접시와 PVC 클러스터를 포함하는 2개의 접시.

신경절의 나머지 부분을 버리고 100mm 해부 접시를 따로 보관하여 세포 클러스터를 해리합니다. 세포가 들어있는 배양 접시를 무대에 올려 놓으십시오.tage 저배율 현미경의 덮개를 제거합니다. 세포 클러스터에 인접한 배양 접시의 바닥을 부드럽게 튕깁니다.

집게에 미세한 해부 핀을 끼우고 세포를 완전히 분리하기 위해 5-10번의 튕기기가 필요할 수 있습니다. 그런 다음 다른 배양 요리와 함께 반복합니다. 다음으로, 해리된 세포가 있는 배지 섬이 들어 있는 배양 접시를 150 x 25mm 원형 플라스틱 페트리 접시와 같이 공기 순환이 가능한 큰 용기에 넣습니다.

그리고 이 접시를 섭씨 17도로 설정된 인큐베이터에 넣으십시오. 그 후, 챔버에 습기의 원천으로 열린 물 접시를 놓고 세포가 접시 중앙의 폴리리신 코팅에 부착될 수 있도록 밤새 방해받지 않도록 합니다. 다음날, 2.5ml의 인공 해수와 페니실린 스트렙토마이신을 접시에 부드럽게 붓고 반전 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 검사하고 계수합니다.

다음은 배양 하루 후 살아있는 BSC 뉴런이며, BSC 세포는 일반적으로 40 미크론으로 PVC 세포보다 큽니다. 여기에 보이는 것은 배양에서 일주일 후 프로세스 성장을 보여주는 살아있는 PVC 뉴런입니다. 다음은 AL 글루타메이트의 펄스에 반응하여 나트륨 이온이 운반하는 여기 전류이고, 다음은 D 아스파르테이트에 대한 반응으로 흐르는 전류입니다.

NMDA에 의해 활성화되는 전류는 일반적으로 다른 작용제에 의해 활성화되는 전류보다 진폭이 작습니다. 이 절차를 시도하는 동안 해리 중에 뉴런이 손상되지 않도록 하는 것이 중요하다. 이 기술의 한 가지 장점은 각 신경절에서 두 개의 배양을 생성하여 하나를 실험 배양에 대한 매치 컨트롤로 사용할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 플레지아 또는 다른 해양 무척추 동물의 뉴런의 1차 배양을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경절의 효소 소화를 통해 plegia의 감각 뉴런을 분리한 다음 관심 세포를 조심스럽게 해리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.