Name: 면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 학습하세요 면역 결핍 마우스에서 인간 간세포 암(HCC) 이종 이식을 생성하는 방법을 배우세요. 종양 조각 또는 세포 현탁액을 준비하여 피하 또는 간내 이식하고, 부분 간절제술로 이식 성공률을 높입니다.

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이 작품은 건강 연구 1 단계 임상의 과학자 상 (AG)의 캐나다 연구소와 암 연구 협회 (AG)에서 운영 보조금에 의해 지원되었다. 저자는이 프로젝트의 그의 지원을위한 닥터 존 딕에게 감사의 말씀을 전합니다.

프로토콜의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 1. 인간의 HCC 샘플의 처리 서면 환자의 동의와 기관 연구 윤리 보드의 승인을 인간의 기본 간암 검체를 얻습니다. 이러한 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 가이드 라인을 준수 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회의 승인을 우리의 기관에서 수행되었다. 일단 적절한 샘플 임상 목적으로 촬영 한 수술 절차에 따라 가능한 한 빨리 신선한 HCC의 표본을 수집합니다. 이상적으로는이 환자의 조직을 제거 후 30 분 이내에 자리를 대신한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 종양의 중앙부가 괴사 될 수 있으므로, 종양의 주변부로부터 얻어진 적어도 1cm 3의 샘플에서는, 최적이다.종래와 같은 방사선, 화학 요법, 또는 박리와 같은 절제에 어떤 처리를받지 않는 종양은 종양 세포가 생존 있다는 가능성을 최대화하기 위해 바람직하다. 생물학적 물질에 대한 표준 개인 보호 프로토콜에 따라 인간의 기본 조직을 처리합니다. 무균 기술을 사용하여 클래스 II 바이오 캐비닛 종양 조직 및 세포 제제의 모든 실험 조작을 수행. <ol><li> 4 ° C에서 10 ~ 25 ㎖의 혈청 둘 베코의 수정 이글 중간 / 햄의 F12에 신선한 HCC 샘플을 놓고 즉시 처리 및 마우스에 xenografting에 대한 조직의 조각 및 / 또는 세포의 준비를 위해 실험실로 얼음에 전송할 수 있습니다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여, 100mm X 20mm 페트리 접시 또는 다른 적절한 멸균 작업 표면에 종양 샘플을 놓습니다. 10 번 수술 메스 블레이드를 사용하여 약 2 ~ 3 ㎜의 조각으로 종양 샘플을 나눈다. 이 시점에서, 스냅 동결 또는 포르말린 고정의 고려필요에 따라 오메 종양 다른 실험을위한 조각 또는 분석. </li><li> 종양 절편 xenografting 위해, 프래그먼트가 잠긴 남아 있도록 충분한 마트 리겔을 포함하는 하나 이상의 마이크로 원심 튜브에 HCC 단편의 일부를 배치. 얼음이 튜브를 유지합니다. </li><li> 종양 세포 현탁액의 제조를 위해, 나머지 HCC 조직에게 극력 말하다 및 다진 조직의 양에 따라서 50 ㎖ 원추형 튜브에 DMEM-F12 5-10 ㎖로 섞고 수술 메스 블레이드를 사용한다. </li><li> ML 200 단위 /의 최종 농도에 콜라게나 제 타입 IV와 디스 파제 II를 추가하고 0.8 단위 / ml로 각각. 25 ML 피펫을 사용하여 잘 아래로 혼합물을 피펫. </li><li> 튜브를 밀봉하고 종양 조직의 부드러움에 따라 30 ~ 60 분 동안 5 % 이산화탄소 배양기에서 37 ° C에서 1.6 단계에서 혼합물을 품어. 소화 효소의 진행 상황을 평가하기까지 몇 시간마다 10 분 아래로 혼합물을 피펫. </li><li> 디 후Gestion의는 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 종양의 솔루션을 전달 완료됩니다. 부드럽게 통과하는 종양 세포의 최대 수를 활성화하기 위해 25 ㎖ 피펫 팁을 사용하여 세포 고사에 남은 조직 매쉬. 15 ML 원뿔 관에서 변형 된 세포 현탁액을 수집합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 1,200 rpm에서 종양 세포 현탁액을 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다. 펠렛의 크기에 따라, 차가운 얼음 1X 적혈구 (RBC)의 ML 버퍼를 용해하고 부드럽게까지 피펫 아래로 펠렛을 재현 탁 2-5를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> RBC의 용해 버퍼를 씻어 4 ° C에서 5 분 1,000 rpm에서 15 ㎖의 원심 분리기의 총 볼륨에 DMEM-F12를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다 및 DMEM-F12의 RBC없는 종양 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 수동 또는 자동 셀 카운터와 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 원하는 번호 18를 포함하는 원심 분리기 종양 세포 분취상술 한 바와 같이 주사에 대한 세포의 연구는, 그 결과 세포 얼음처럼 차가운 리겔의 30 μL에 펠렛, 그리고 얼음 가게를 재현 탁. </li></ol> 선택 사항 : 단계 1.11 후에, 우리는 정기적으로 대량 종양 세포 현탁액에서 인간 CD45 + 세포 (백혈구)를 고갈 및 / 또는 유동 세포 계측법 또는 면역 자석 구슬을 사용하여 종양 세포의 하위 집합을 정화. 이러한 기술에 대한 자세한 프로토콜은 물론 관련 항체, 구슬, 흐름 세포 계측기의 제조 업체에 의해 설명되어 있습니다. 참고 : 프로토콜 상술 또한 단계 1.1에서 일차 인간 HCC 조직에 대한 이종 이식 조직을 대체 직렬 이식을 수행하기 위해 마우스로부터 수확 된 인간 종양 이종 이식을 처리하기 위해 사용될 수있다. 이러한 상황에서, 단계 1.11 후에, 우리는 일상적 마우스 조직 적합성 항원 H2K에 대한 항체를 사용하여 세포 현탁액에서 뮤린 세포 침윤 고갈. 2.Xenografting 기관 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 준수하는 모든 동물의 절차를 실시한다. 여기에서 설명하는 절차는 모든 관련 규제 및 제도 기관, 규정 및 지침에 따라 규격에 맞추어 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회의 승인을 특정 동물 사용 프로토콜에 따라 완료되었습니다. 작은 동물에 흡입 휘발성 마취제의 전달을위한 장비는 동물 시설 및 연구 기관의 표준 운영 절차에 따라 사용되어야한다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 무균 기술과 무균 장비를 사용하는 모든 수술 절차를 수행합니다. 비만이 아닌 당뇨병 심한 결합 면역 결핍을 활용 (NOD / SCID) 또는 연령 6-8 주에 섹스를 하나의 마우스의 NOD / SCID / 인터루킨 2 수용체 감마 체인 널 (null) (NSG) 균주 (잭슨 연구소, 바 하버, ME) 9, 10. 이들생쥐는 면역 결핍 동물에 적합한 무균 조건을 제공 할 수있는 시설에 보관하고 유지해야합니다. 1 L / 산소의 분 5 % (V / V) 흡입 아이소 플루 란을 공급하는 실에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 각막과 발가락의 반사 손실이 동물 (들)에있을 때까지 마취를 유지합니다. 피하 xenografting 들어 동물 (들)의 등쪽에있는 하나 이상의 작은 영역을 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 정화. 간내 xenografting를 들어, 아래 서혜부에 겨드랑이에서 동물 (들)의 복부 흉부와 복부를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 정화. 종양 파편의 2.1 피하 주입 <ol><li> 마우스 피스 흡입 아이소 플루 란 마취 (2 % (V / V) 1 L에 / 분 O 2)를 유지, 경향 마취 마우스를 놓습니다. 외상성 부상에서 동물의 눈을 보호하기 위해 눈물 - 젤을 적용합니다. </li><li> 베타 딘으로 등쪽 면도 영역 (들)을 살균수술 스크럽은 70 % 에탄올 다음과 마지막으로 포비돈 - 요오드 용액. </li><li> 멸균 날카로운 가위를 사용 5mm의 피부 절개를합니다. </li><li> 부드럽게 피하 공간으로 폐쇄 무딘 가위를 삽입하고 종양 조각을 수용 할 수있을만큼 큰 포켓을 개발하기 위해 부드럽게 확산. </li><li> 살균 미세 집게를 사용하여 피하 주머니에 1.3 단계에서 제조 된 종양 조각을 삽입합니다. </li><li> 봉합 또는 클립을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 마우스로 수술 후 치료를 제공합니다. </li></ol> 종양 세포의 피하 주사 2.2 <ol><li> 단계 2.1.1와 2.1.2에 설명 된대로 동물을 준비합니다. </li><li> 바늘에 29 G 1 / 2 인슐린 주사기로 단계 1.13에서 제조 리겔에서 종양 세포의 현탁액을로드합니다. </li><li> 피하 공간으로 바늘을 삽입하고 주사기의 내용을 방출. 멀리 피하 평면을 따라 바늘을 몇 밀리미터 정도 FR 발전톰 피부 천자 사이트는 바늘의 철수에 따라 천자 사이트 중 종양 세포 현탁액의 누출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 마우스로 수술 후 치료를 제공합니다. </li></ol> 종양 파편의 2.3 간내 주입 <ol><li> 1 ML의 주사기에서 바늘에 27 G 1 / 2를 사용하여, 수술 유체 손실을 보상하기 위해 마취 된 동물의 목의 배부에 멸균 생리 식염수를 피하의 350 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 진통제를 들어, 1 ML의 주사기에 27 G의 2 인치 바늘을 사용하여 피하 동물의 측면에 멸균 생리 식염수를 포함하는 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏)의 350 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 유지 보수에게 흡입 아이소 플루 란 마취 (2 % (V / V) 1 L에 / 분 O 2)를 전달하기 위해 마우스 피스 내부에 위치 코와 입으로 미리 가열 패드에서 마우스 부정사를 놓습니다. </li><li> 사지를 확장하고 노출을 최적화하기 위해 운영면에 테이프로 고정복부 복부 및 흉부. </li><li> 시각화를 최적화하기 위해 돋보기 램프의 절차를 수행합니다. </li><li> 그리고 마지막으로 포비돈 - 요오드 용액과 70 % 에탄올 다음 베타 딘 수술 스크럽 복부 복부와 흉부에 면도​​ 피부를 소독. </li><li> 멸균 예리한 가위를 사용하여, 횡 방향 양측 subcostal 피부 절개를하고, 전체 간의 충분한 노출을 허용하도록 복강을 입력 근육층 나눈다. </li><li> 칼 모양의 과정 위의 피부에 스티치를 넣고 간장과 주변 구조의 더 나은 노출을 허용하기 위해 테이프로 마우스 피스에 고정. </li><li> 안정화에 간 두 면봉 인접 도포 및 후방을 사용합니다. </li><li> 멸균 제 10 메스 블레이드를 사용하여 간 표면의 길이와 깊이 절개 3mm를 확인합니다. </li><li> 즉시의 Surgicel 및 지혈을 달성하기 위해 절개 사이트에 약간 힘을 주어, 60 ~ 90 초 후에 제거완전한 지혈이 달성 된 경우에만 진행합니다. </li><li> 살균 미세 집게로 또는 18 G 바늘 간 절개로 종양 조각의 단계 1.3를 놓습니다. </li><li> 종양 조각의 변위를 방지하고 계속 지혈을 보장하기 위해 간 절개에의 Surgicel의 작은 조각을 적용합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공 </li></ol> 간에 직접 분사를 통해 종양 세포의 2.4 간내 주입 <ol><li> 위의 2.3.7에 2.3.1 단계에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 바늘 (29) G 1 / 2를 사용하여 인슐린 주사기에 종양 세포 현탁액 (1.13 단계에서 제조 된)을로드. </li><li> 간 코튼 팁 어플리케이터를 사용하여 안정화와 함께, 간장에 인슐린 주사기 바늘을 삽입하고 끝에게 낭하 평면을 따라 구멍 사이트 넘어 몇 mm를 진행. </li><li> 부드럽게 주사기 및 t의 내용 방전암탉은 간에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 장소 구멍 사이트에의 Surgicel 종양 세포 현탁액의 유출을 방지하고 완전한 지혈을 달성하기 위해 면봉과 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 비장에 주입을 통해 종양 세포의 2.5 간내 Xenografting <ol><li> 위의 2.3.5 단계 2.3.1에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위를 사용하여, 1 cm의 복강을 입력 subcostal 절개를 왼쪽으로합니다. </li><li> 비장을 노출하기 위해 cranially과 동물의 오른쪽에 배를 반영하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 멸균 미세 atraumatic 집게로 주변의 지방 조직을 처리하여, 절개로 비장을 제공하고 안정화하기 위해 비장 뒤에 면봉을 배치합니다. </li><li> 5-0 실크 봉합사, 장소 사용폴 하부 위의 비장 주위에 느슨한 미리 묶어 매듭. </li><li> 바늘 (29) G 1 / 2를 사용하여 인슐린 주사기에 종양 세포 현탁액 (1.13 단계에서 제조 된)을로드. </li><li> 비장의 하부 기둥에 인슐린 주사기 바늘을 삽입하고 느슨한 미리 묶어 매듭의 수준 지나치을 사전. </li><li> 천천히 주사기의 내용물을 배출 비장​​에서 바늘을 제거하고 주입 된 종양 세포 현탁액의 임의의 누출을 방지하기 위해 매듭을 조인다. </li><li> 복강에 비장을 교체합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 인간의 종양 조직의 간내 생착을 촉진하기 위해 2.6 부분 간 절제술 <ol><li> 2.3.7에 단계 2.3.1에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위, 간장의 중간 엽에 부착 된 낫 모양의 인대를 나눕니다. </li><li> 면봉을 사용하여, 동원왼쪽 엽 주위에 5-0 실크 봉합사의 간 및 위치 느슨한 미리 묶어 매듭의 왼쪽 엽. 왼쪽 엽의 bilio 혈관 척추 경으로 가능한 한 가까운 느슨한 매듭을 진행하고 매듭을 조입니다. </li><li> 매듭 이후 출혈의 미끄러짐을 방지하기 위해 작은 그루터기를 떠나, 멸균 가위를 사용하여 합자에 왼쪽 엽 말단을 절제. </li><li> 유사한 기술을 사용하여, 결찰 및 담낭을 피하고, 간의 중간 엽의 대부분을 절제. </li><li> 사용의 Surgicel 완전한 지혈을 달성하기 위해 간 실질의 절단면을 따라 면봉과 부드러운 압력. </li><li> 종양 조각 또는 종양 세포의 간내 xenografting를 들어, 상기 한 바와 같이 2.4.5 단계 2.3.11 또는 2.4.2에 2.3.8를 진행합니다. </li><li> 비장 주입을 통해 종양 세포의 간내 xenografting를 들어, exposi 부드럽게 cranially과 동물의 오른쪽에 배를 반영하기 위해 면봉을 사용비장 겨. 상술 한 바와 같이 2.5.9에 2.5.4 단계를 진행합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 2.7 수술 후 관리 <ol><li> 흡입 마취 마우스 피스에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 마취에서 회복 충분히 동원 할 때까지 약 20 분간 가열 램프 아래 새장에 마우스를 놓습니다. </li><li> 처음 2 ~ 3 일 동안 수술 후 부 프레 노르 핀 투여마다 8 ~ 12 시간을 반복합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 실험적 질문과 분석의 다양한 적용 할 수있는 면역 결핍 생쥐에 피하 및 간내 HCC 인간 이종 이식을 수립하는 다양한 기술을 설명 하였다. 피하 이종 이식이 널리 HCC 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었지만, 간내 이종 이식은 거의 문헌에 기술되지 않습니다. 또한, 이종 이식의 사용을 설명하는 연구의 대부분은 잘 확립 세포주에서 이들을 생성했다. 인간의 종양 생물학 (12)를 모델링에 암 세포 라인의 한계를 감안할 때, 우리는 인간의 기본 간암 조직을 사용하여 위에서 설명한 기술의 유효성을 검사하는 데 동기를 부여하고 있습니다. 때문에 실험 그룹의 작은 샘플 크기에 통계 분석에 의해 지원되지는 않지만, 우리의 관찰은 주관적으로 종양 세포 또는 조각의 간내 주입에 부분 간 절제술의 추가 개선 생착 속도를 향해 강력한 경향을 알 수있다. &lt;/ P&gt; 엄격하게 기본 조직을 활용하려고 시도한 몇 가지 연구는 13 ~ 15를 ...

간세포 암 (HCC)은 전 세계적으로 다섯 번째로 가장 흔한 암과 북미에서 암 사망의 가장 빠르게 증가하는 원인이다. HCC에 대한 가장 일반적인 위험 인자는 가장 자주 만성 바이러스 성 간염, 알코올 남용,자가 면역 질환, 또는 유전성 대사 장애 1로 발생, 간경변입니다. 세계 인구에 HCC에 의해 부과 된 무거운 질병 부담에도 불구하고, HCC의 병태 생리는 상대적으로 저조한 같은 대장, 유방, 전립선 암과 같은 다른 일반적인 암에 비해 이해된다. 예를 들어, 종양 구동 특정 분자와 세포 사건 깨끗이이 정의 될 남아. 다른 대부분의 고체 상피 암과 마찬가지로 유전 방식은 HCC 3와 관련된 수차의 이질성을 공개했다. 다수의 연구는 세포 증식, 쉬르에 관련된 신호 전달 경로의 다양한 무질서 활동을 밝혀vival, 분화 및 혈관 4. 또한, HCC의 한테 진찰 Pathobiology 암 줄기 세포의 역할은 5를 명확히하도록 남아있다. HCC의 병태 생리의 제한된 이해를 바탕으로, HCC에 대한 효과적인 치료의 armamentarium에도 상대적으로 제한된 남아있다. 재발은 일반적이지만 간장에 국한 종양과 초기 단계의 환자는 종양 절제술 또는 수술 적 절제를 사용하여 치료 치료를위한 후보입니다. 고급 질병, 화학 요법과 방사선 환자에 대한 제한 효능하고 완화 의도 6 질병 관리에 주로 사용됩니다. 인간의 HCC의 생체 실험 모델에서 고품질, 따라서 새로운 치료 방법의 평가뿐만 아니라 인간의 간세포 암의 병태 생리에 많이 필요한 기초 연구를위한 가치있는 플랫폼을 제공합니다. 세포주 또는 고도로 정의 마우스 모델의 사용, PRI의 이종 이식에 비해그들은 또한 7,8 내에서 다른 환자들 사이에 존재하는 이질성을 캡처하는 동안 높은 정확도와 인간의 질병을 recapitulating 할 수 있기 때문에 면역 결핍 생쥐의 메리 인간의 종양은 연구를위한 유용한 도구로 등장했습니다. 이를 위해, 우리는 면역 결핍 쥐에 인간의 간세포 암 이종 이식을 설정하는 다양한 방법을 개발했습니다. HCC 이종 이식과 관련된 발표 된 연구의 대부분은 이러한 목적 노포 인간 HCC 세포주의 사용을 설명하지만, 우리는 즉시 환자의 수술 적 절제 후의 일차 HCC 표본에서 이종 이식편을 생성하기 위하여 분석을 최적화에 초점을 맞추고있다. 다른 xenografting 기술은 서로 다른 연구 응용 프로그램에 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 종양의 조각에서 생성 피하 이종 이식은 빠르게 생성을 쉽게 모니터링하고, 편리과 새로운 치료제의 로컬 관리를위한 더 적합 할 수있다종양 반응의 모니터링. 간내 이종 이식은 HCC 생물학의 간 미세 환경의 역할에 관한 연구에 대한 더 많은 관련이있을 수 있습니다. 종양 세포 현탁액에서 생성 된 이종 이식 종양을 시작하는 셀의 서브 세트의 식별 및 특성 또는 종래 이종 이식 종양 세포의 체외 조작에 필요로하는 실험이 필요하다. 따라서 우리는 개발 및 기본 인간 HCC 표본에서 파생 된 세포 현탁액 또는 종양 조각에서 피하 또는 간내 이종 이식을 설정하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 확인했다.

<table><tbody><tr><td>둘베코&#8217; s 모드. 독수리 중간/햄&#8217; s F12 50/50 믹스 x1(DMEM-F12) </td><td>WISENT Bioproducts</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 분해 효소 IV형</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td>줄기세포 기술</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td> 마트리겔 매트릭스</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td> 10% 완충 포르말린 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 식염수 용액(NaCl), 멸균</td><td>하우스 브랜드</td><td>1011-L8001</td><td></td></tr><tr><td>베타딘 수술용 스크럽</td><td>퍼듀 제약</td><td>NPN 00158313</td><td></td></tr><tr><td> 부프레노르핀(테메게시식) NR 0.3 mg/ml</td><td>레킷 벤키저</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 이소플루란 USP, 99.9 %, 흡입 마취제</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>눈물 젤 </td><td>Novartis 제약</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 냉동 섹션 화합물 </td><td>VWR</td><td>95057-838</td><td></td></tr><tr><td> Cryomold, 조직 -Tek </td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td> 정밀 글라이드 바늘 18G 1 &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td> 정밀 글라이드 바늘 27G &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td> 인슐린 주사기, 3/10 cc U-100, 29G&#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td> 수술용 칼날 No.10</td><td>Feather Safety Razor Co.</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td> #5-0 소프트 실크 수술용 봉합사, 3/8" 테이퍼 포인트 바늘 </td><td>Syneture</td><td>VS-880</td><td></td></tr><tr><td> Transpore 수술 테이프</td><td>3M 헬스케어</td><td>1577-1</td><td></td></tr><tr><td> 면 어플리케이터 </td><td>Medpro</td><td>018-425</td><td></td></tr><tr><td> Surgicel, 산화 재생 셀룰로오스</td><td>Ethicon</td><td>1951</td><td></td></tr><tr><td> 세포 여과기 100 &#956; m 나일론</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td> 모바일 베이스가 있는 확대 조명</td><td>Benson medical Industries Inc.</td><td>모델: RLM-CLT-120V</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 멸균 100x20 mm </td><td>Sarstedt</td><td>821474</td><td></td></tr><tr><td> 조직 집게, 1x2 이빨, 4-1/2"</td> <td>Almedic</td><td>A10-302</td><td></td></tr><tr><td> Adson 드레싱 집게 4-3/4"</td> <td>Almedic</td><td>A10-220</td><td></td></tr><tr><td> 눈 드레싱 집게, 톱니 모양, 직선, 4" </td><td>Almedic</td><td>A19-560</td><td></td></tr><tr><td> Hartman 지혈 집게, 곡선, 3-1 / 2 "</td><td>Almedic</td><td>A12-142</td><td></td></tr><tr><td> 아이리스 가위, 곡선, 4-1 / 4"</td><td>Almedic</td><td>A8-690</td><td></td></tr><tr><td> 아이리스 가위, 스트레이트, 4-1 / 2 "</td><td>Almedic</td><td>A8-684</td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegan 니들 드라이버, 5-1 / 2 "</td><td>Almedic</td><td>A17-228</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

생체 내에서 인간의 질병을 요점을 되풀이 간세포 암 (HCC)의 실험 모델은 질병의 병태 생리에 대한 연구 및 새로운 치료법의 전임상 평가를위한 가치있는 플랫폼을 제공합니다. 우리는 연구 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있는 면역 결핍 생쥐에 피하 또는 동소 인간 HCC 이종 이식편을 생성하는 다양한 방법을 제시한다. 출발점으로 절제술을받은 환자에서 일차 종양 조직의 사용에 초점을 제외한 xenografting위한 세포 현탁액 또는 종양 단편의 제조를 기술한다. 마우스 비장 세포에 주입에 의해 간접적으로 또는 II) intrahepatically, 하나 종양 세포 또는 조각을 직접 주입하여 간으로, 또는, 우리는이 조직 I) 피하 이종 이식 특정 기술에 대해 설명합니다. 또한 전략으로서 xenografting시 네이티브 마우스 간 부분 절제술의 사용을 설명일차 인간 종양 세포의 생착 간내을 용이하게 할 수있다받는 마우스에서 활성 간 재생의 상태를 유도한다. 이러한 기술의 예상 결과가 설명된다. 설명하는 프로토콜은 일반적으로 덜 견고 문헌에 널리 사용되는 자주 인용된다 노포 인간의 간세포 암 세포주에 비해 수행하는 인간의 기본 HCC 샘플 및 이종 이식을 사용하여 검증되었다. 세포 라인에 비해, 우리는 이종 이식 모델에서 기본 HCC의 생착의 상대적으로 낮은 기회에 기여하고 이종 이식 성장의 반응 속도에 영향을 미칠 수있는 기술적 인 문제에 대한 의견 수있는 요소에 대해 설명합니다. 우리는 또한 얻은 이종 이식 정확하게 부모 HCC 조직과 유사하도록 적용 할 방법을 제안한다.

그림 3은 피하 인간 HCC 이종 이식 종양의 해당 조직 학적 모양의 전형적인 모습을 보여줍니다. 피하 이종 이식의 발전 및 성장을 용이하게받는 마우스의 일상 시험에 의해 모니터링 될 수있다. 종양 xenografting 개발 간의 시간 간격은 (조직의 유형 (세포 현탁액 대 종양 단편), 조직의 소스 (주 환자 샘플, 계대 이종 또는 세포주) 및 이식 조직의 양에 따라서 크게 다를 수 세포의 수 또는 종양 조각의 크기). 6 개월 얻어 1 × 10 5 세포에서 유사한 이종 이식의 발전을 위해해야 할 수도 있습니다 예를 들어, 상당한 크기의 이종 이식은 1 ~ 2 주 이내에 잘 설립 간세포 암 세포주의 5 × 10 6 세포의 주입에서 개발할 수 있습니다 기본 HCC 환자 샘플에서. 우리는 implantatio 6 개월 후 이후에 피하 이종 이식의 형성을 관찰하지 않은종양 샘플의 n 및 이종 이식이 개발하지 않은 경우, 따라서이 평가시기에받는 사람의 쥐를 희생...

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

이 절차의 전반적인 목표는 면역결핍 마우스에서 피하 또는 간내 인간 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC) 이종이식편을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 신선한 인간 HCC 검체로부터 종양 조각 또는 단일 세포 현탁액을 준비하여 피하 이종이식을 위해 마우스에 이식함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 간내 이종이식을 위해 종양 세포를 주입하거나 종양 조각을 피하 등쪽 포켓에 이식하는 것입니다.다음 단계는 종양 세포를 비장 또는 간에 주입하거나, 마지막 단계에서 종양 조각을 간에 직접 이식하는 것입니다. 종양이 발달할 때까지 수주 동안 동물을 관찰합니다. 궁극적으로, 인간 HCC Xenograft는 종양 발생 기전과 새로운 치료법에 대한 반응을 포함하여 종양 생물학의 많은 측면을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.세포주나 피하 이종이식만을 사용하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 일차 인간 간암 검체와 환자 유래 간내 이종이식을 통해 인간 간세포암의 더 현실적인 생물학적 모델을 제공한다는 점입니다. 종양 조각의 피하 이식 절차는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Sharif Ahmed가 시연하겠습니다. 우선, 마우스의 입에 마우스피스를 장착하여 흡입성 isof fluorine 마취 상태를 유지하면서 마취된 마우스를 복와위로 배치하십시오.외상성 손상으로부터 동물의 눈을 보호하기 위해 티어 젤(tear gel)을 도포한 다음, 배면의 제모 부위를 베타딘(Betadine) 외과용 세정제로 멸균하고, 이어서 70% ethanol, 마지막으로 포비돈 요오드 용액으로 멸균합니다. 다음으로, 날카로운 가위를 사용하여 피부에 5 mm 절개를 가합니다. 닫힌 상태의 둔단 가위 끝을 피하 공간에 삽입한 후, 가위를 천천히 벌려 종양 조각을 수용할 수 있을 만큼 충분한 크기의 포켓을 만듭니다.그 다음, 미세 핀셋을 사용하여 종양 조각을 피하 포켓에 삽입하고, 조각을 배치한 후 클립을 사용하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 이는 Matrigel 내의 종양 세포 현탁액을 29 gauge, 1/2 inch 바늘이 장착된 인슐린 주사기에 넣어 주입하기 직전에 수행합니다. 그런 다음, 마취 후 털을 제거한 동물의 피하 공간에 바늘을 삽입하고, 천자 부위에서 떨어진 피하 평면을 따라 바늘을 수 밀리미터 전진시킨 후 주사기 내부의 내용물을 배출합니다. 인간 종양 조직의 이식을 위해 동물을 준비시키려면, 먼저 마취된 동물의 목 등 쪽에 1 mL 주사기에 27 gauge, 1/2 inch 바늘을 장착하여 350 µL의 멸균 생리 식염수를 피하 투여함으로써 수술 중 발생할 수 있는 체액 손실을 선제적으로 보충합니다.그 다음, 예열된 패드 위에서 배와 눕힌 마우스(supine mouse)를 마취시킨 후, 동물의 사지를 펴서 수술대 표면에 테이프로 고정하여 복부와 흉부의 복측이 최대로 노출되도록 합니다. 동물의 위쪽에 확대경 램프를 배치하고, 시연한 바와 같이 복부와 흉부 복측의 제모된 피부를 소독합니다. 날카로운 가위를 사용하여 양측 늑골 하단에 가로로 피부 절개를 가한 뒤, 근육층을 분리하여 간 전체를 노출시킵니다.검상돌기 상단의 피부에 봉합사를 배치하고 이를 테이프로 마우스피스에 고정하여 간과 주변 조직이 더 잘 노출되도록 합니다. 다음으로, 조직의 인접히 및 후면에 두 개의 면봉을 배치하여 간을 고정합니다. 그 후, 날카로운 가위로 간의 중앙엽에 부착된 낫인대를 절개합니다.면봉을 사용하여 간의 좌엽을 들어 올리고, 5-0 실크 봉합사로 느슨하게 매듭을 만들어 좌엽 주위에 배치합니다. 매듭을 좌엽의 이중 혈관경(bi pedicle) 방향으로 최대한 가깝게 이동시킨 후 조입니다. 그다음 가위를 사용하여 결찰 부위의 원위쪽 엽을 절제하되, 매듭이 풀려 이후에 출혈이 발생하는 것을 방지하기 위해 작은 그루터기를 남깁니다.유사한 기술을 사용하여 간의 중앙엽 대부분을 결찰 및 절제한 다음, Surgicel과 면봉을 이용해 간 실질의 절단면을 가볍게 압박하여 완전한 지혈을 달성합니다. 마지막으로, 다음 섹션에서 설명하는 것과 같이 종양 조각 또는 종양 세포의 간 내 이종이식을 수행하거나, 비장 주입을 통한 종양 세포의 간 내 이종이식을 수행합니다. 종양 조각의 간 내 이식을 위해서는 10번 메스 날을 사용하여 먼저 간 표면에 길이와 깊이가 3 mm인 절개를 만듭니다.그런 다음 즉시 Surgicel을 도포하고 절개 부위를 60~90초 동안 가볍게 압박하여 지혈합니다. 완전히 지혈되면 미세 핀셋을 사용하여 종양 조각을 간 절개 부위에 배치합니다. 그다음 절개 부위 위에 작은 Surgicel 조각을 덮어 간으로의 직접 주입을 통한 종양 세포의 간 이식을 수행합니다. 종양 세포 현탁액이 충전된 인슐린 주사기 바늘을 노출된 간에 삽입하고, 바늘 끝을 천자 부위에서 피막 하 평면을 따라 수 밀리미터 더 전진시킵니다.시린지 내부의 물질을 천천히 배출하고 간에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 천자 부위에 surgicel을 덮고 면봉으로 가볍게 압박하여, 비정맥 주입을 통한 종양 세포의 간내 이종이식 시 종양 세포 현탁액의 누출을 방지하고 완전한 지혈을 유도합니다. 마우스를 우측 측와위로 배치하고, 날카로운 가위를 사용하여 왼쪽 갈비뼈 아래에 1cm 절개를 가해 복강으로 진입합니다.그런 다음 면봉을 사용하여 위를 동물의 우측으로 두측 방향으로 젖힙니다. 미세 무외상성 포셉으로 주변 지방 조직을 조작하여 비장을 노출시킨 후, 비장을 절개창 밖으로 꺼내고 비장 뒤쪽에 면봉을 배치하여 조직을 고정합니다. 이제 5-0 실크 봉합사를 사용하여 하극 위쪽의 비장 주변에 느슨한 가매듭을 만듭니다.종양 세포 현탁액이 충전된 인슐린 주사기 바늘을 비장의 하극으로 삽입하고, 느슨하게 묶어둔 매듭 지점 너머까지 진입시킵니다. 그런 다음 주사기 내부의 내용물을 천천히 배출하고 비장에서 바늘을 제거한 후, 주입된 세포 현탁액이 누출되지 않도록 매듭을 단단히 조입니다. 마지막으로 비장을 복강 내로 다시 되돌려 놓습니다.이 이미지에서는 종양에 대해 어떠한 보조 요법도 받지 않은 HCC 환자의 간 절제 표본이 제시되어 있습니다. 흰색 상자는 제노그라프트를 위해 채취한 주변부의 생존 가능한 종양 부분을 나타냅니다. 피하 제노그라프트의 형성 및 성장은 수신 마우스를 매일 관찰함으로써 용이하게 모니터링할 수 있습니다.예를 들어, 주변 조직과 시각적으로 구별되는 인간 HCC 피하 이식편의 전형적인 외형과 이에 해당하는 종양의 조직병리학적 외형이 제시되어 있습니다. 종양의 조직학적 소견은 핵의 AIA 및 높은 핵-세포질 비율을 가진 간세포 유사 세포, 문맥관의 부재, 그리고 간세포 판의 두께가 증가하고 왜곡된 소주(trabeculae)를 포함하여 HCC의 전형적인 특징을 보여줍니다. 이 이미지들에서는 종양 조직을 간에 직접 이식하여 구현한 간내 인간 HCC 이식편과 종양 세포를 비장에 주입하여 구현한 이식편의 전형적인 모습이 제시되어 있으며, 각 이미지에서 검은색 화살표는 실질 내 종양을 나타냅니다.간내 xog 이식편의 경계면을 통과하는 이 조직학적 절편은 인간 HCC의 전형적인 특징과 그에 인접한 정상 생쥐 간을 보여줍니다. 표는 면역결핍 생쥐에 인간 원발성 간세포암 조직을 이식한 후 달성된 종양 생착률을 요약합니다. 각 이식 방법별로 방금 시연한 서로 다른 기술들을 사용했을 때, 종양 생착률의 분모는 개별적인 인간 HCC 샘플을 나타냅니다.이러한 데이터는 일차 인간 HCC 조직의 경우, 피하 이식률이 비장 내 종양 세포 주입이나 간 내 종양 조각 이식을 통해 달성된 간 내 이식률보다 낮으며, 부분 간 절제술이 간 내 이식을 촉진하는 것으로 보인다는 것을 입증합니다. 이 절차를 시도할 때 무균 기술을 사용하고 완전한 지혈을 달성하는 것이 중요합니다. 6~8주 된 작은 면역 결핍 마우스는 감염에 취약하며, 소량의 수술 후 출혈만으로도 생존하지 못할 수 있기 때문입니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

이 비디오는 인간화된 이종 이식 마우스 모델을 생성하기 위한 분석을 보여줍니다. 면역이 저하된 마우스에게 시클로포스파마이드를 주사하여 면역 세포를 고갈시킵니다. 하이드로겔에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혼합된 환자 유래 종양 세포를 마우스에 피하 주입하여 T 세포가 침투하는 종양을 형성합니다.

인간 PBMC가 이식된 인간화 이종이식 마우스 모델을 생성하는 기술

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).

간세포 암종의 동소 마우스 모델에서 비침습적 PET/MR 이미징

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

학습하세요 면역 결핍 마우스에서 인간 간세포 암(HCC) 이종 이식을 생성하는 방법을 배우세요. 종양 조각 또는 세포 현탁액을 준비하여 피하 또는 간내 이식하고, 부분 간절제술로 이식 성공률을 높입니다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

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