단일 분자의 단백질 연구에 대한 표면 패시베이션

본 절차의 전반적인 목표는 우수한 품질의 처리된 석영 슬라이드 표면을 얻는 것입니다. 이는 먼저 드릴링된 석영 슬라이드와 커버 슬립을 물과 아세톤으로 세척함으로써 수행됩니다. 그 후, 표면 품질을 향상시키기 위해 수산화칼륨과 피라냐 용액으로 슬라이드를 식각합니다.

다음으로, 슬라이드와 커버슬립을 아민기로 기능화한 후, 폴리머를 이용해 표면 처리를 두 차례 수행하여 유리 표면을 불활성 상태로 만듭니다. 마지막 단계는 폴리에틸렌 글리콜이 코팅된 또는 페길화된 표면이 서로 마주보도록 하여 슬라이드와 커버슬립으로 미세유체 챔버를 조립하는 것입니다. 결과적으로, peg 분자로 표면을 두 차례 처리하는 새로운 전략은 단분자 형광 현미경으로 관찰했을 때 패시베이션의 품질을 현저히 향상시킵니다.

본 기술의 주요 장점은 산화칼륨 식각 후 폴리머 코팅과 같은 기존 기술에 비해 우수한 품질을 보장한다는 점입니다. 여러 단계의 표면 처리를 수행해야 하므로 이 방법이 처음인 사용자는 어려움을 겪을 수 있습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 쿼츠 슬라이드를 준비하십시오.

슬라이드를 유리 염색병에 넣어 세척합니다. 일반적으로 한 병에 5~15매의 슬라이드를 넣을 수 있습니다. 그런 다음 UE water로 3회 반복 헹군 후, 오염 물질을 제거하기 위해 UE water를 사용하여 슬라이드를 5분 동안 초음파 세척합니다. 세척액을 버리고 UE water로 슬라이드를 3회 더 헹굽니다.

다음으로, UE-water를 아세톤으로 교체하고 슬라이드를 아세톤으로 20분 이상 초음파 처리한 후, 아세톤을 버리고 Milli Q water로 헹구어 아세톤 잔여물을 제거합니다. 그다음, 물을 1 M potassium hydroxide로 교체하고 슬라이드를 20분 이상 초음파 처리합니다. 과도한 식각은 표면의 품질을 향상시키지만, 형광 이미지 촬영을 방해할 수 있는 긁힘을 유발할 수 있습니다.

피라냐 식각을 수행하기 위해 Milli Q water로 슬라이드를 3회 헹구어 수산화칼륨 잔여물을 제거합니다. 슬라이드를 Duran 슬라이드 홀더 또는 맞춤 제작된 Teflon 홀더로 옮긴 후, 화학 흄후드 내에 위치한 1L 비커에 넣습니다. 비커에 450 mL의 황산을 채웁니다.

그런 다음 황산과 과산화수소의 비율이 3:1이 되도록 과산화수소 150 milliliters를 추가합니다. 용액을 저어 적절히 혼합하고 비커를 20분 동안 그대로 둡니다. 피라냐 용액에서 슬라이드를 꺼내 밀리유 워터(millieu water)가 담긴 슬라이드 홀더에 넣습니다.

그동안 피라냐 용액(piranha solution)은 지정된 폐액병에 버립니다. 실온에 도달하면, 커버슬립 세척 과정과 마찬가지로 슬라이드를 UE water로 세 번 헹굽니다. 염색 접시의 UE water를 메탄올로 교체합니다. 슬라이드와 커버슬립을 메탄올에 담가 둡니다.

그동안 플라스크에 메탄올 100 milliliters를 부어 아미노 실란화 용액을 준비합니다. 그런 다음 아세트산 5 milliliters와 3-aminopropyltrimethoxysilane 3 milliliters를 추가하고, 흔들어 부드럽게 섞어줍니다. 슬라이드와 커버글라스가 담긴 염색 접시의 메탄올을 아미노 실란화 반응 혼합물로 교체합니다.

20분에서 30분 동안 배양하며, 배양 중에 1분 동안 한 번 초음파 처리합니다. 다음으로, 아미노 섬유화 반응물을 메탄올로 교체합니다. 그 후 메탄올을 버리고 신선한 메탄올 용액을 첨가합니다.

폴리머를 먼저 사용하는 1차 표면 처리 과정에서 이 절차를 세 번 반복합니다. 질소 가스를 사용하여 슬라이드와 커버슬립을 건조시키십시오. 그 다음, PEG화가 필요한 면이 위를 향하도록 milli Q water가 부분적으로 채워진 깨끗한 피펫 박스에 이를 넣으십시오. 이어서, 준비된 PEG 용액에 갓 제조한 반응 버퍼 64 µL를 첨가하십시오.

완전히 용해되도록 혼합물을 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 그 다음 16,100 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 기포를 제거하기 위해 페길화 혼합물 70 µL를 건조된 쿼츠 슬라이드 위에 떨어뜨립니다.

용액 위에 건조된 커버 슬립을 조심스럽게 덮고, PEG화된 슬라이드와 커버 슬립을 보관하기 위해 암실 및 습윤 환경에서 2시간부터 하룻밤 동안 배양합니다. 커버 슬립을 옆으로 밀어 슬라이드와 커버 슬립을 조심스럽게 분리하고, 초순수(UE water)로 헹군 후 질소 가스로 건조합니다. PEG화된 표면이 서로 마주 보지 않도록 슬라이드와 커버 슬립 한 쌍을 50 mL 튜브에 넣습니다.

튜브를 부분적으로 닫고 진공 상태로 만든 후, 질소 가스를 채우고 뚜껑을 단단히 잠급니다. -20 °C에서 보관하십시오. 이러한 단계는 페길화된 표면을 장기간 보존하는 데 도움이 됩니다.

마이크로유체 챔버를 조립하기 위해 슬라이드를 사용하기 직전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 번째 페길레이션(pegylation) 단계를 수행합니다. 페길레이션 처리된 면이 위로 향하도록 쿼츠 슬라이드를 평평한 표면에 놓습니다. 슬라이드 위에 양면 접착테이프를 붙여 페길레이션 표면에 대각선 방향으로 채널을 만듭니다.

구멍들이 채널의 중앙에 위치했는지 확인하십시오. 그런 다음, PEG화된 커버 슬립을 위에 조심스럽게 덮어 챔버를 완성합니다. 이때 PEG화된 면이 아래를 향하게 하십시오.

양면테이프가 부착된 부위 위로 커버 슬립을 눌러 챔버를 밀봉합니다. 챔버가 수밀 상태로 밀봉될 수 있도록 부드럽지만 꼼꼼하게 작업하십시오. 마지막으로 에폭시 접착제를 사용하여 챔버의 가장자리를 마감합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 streptavidin 또는 neutravidin을 고정시키고, 단일 분자 이미징을 위해 biotin이 결합된 생체 분자를 첨가하십시오. 표면 처리가 성공적으로 수행되었다면, 관찰되는 이미징 영역당 비특이적으로 흡착된 단백질이 10개 미만입니다. 1~10 nM의 형광 표지 단백질을 챔버에 첨가했을 때, 세척 또는 반응 단계 중 어느 하나라도 적절히 수행되지 않았다면 비특이적으로 흡착된 단백질의 수가 크게 증가합니다. 예를 들어, piranha 에칭 단계를 생략하면 비특이적 흡착이 100배 더 많이 관찰됩니다.

이중 페길레이션(double pegylation)의 우수한 특성이 여기서 명확하게 나타납니다. 왼쪽 패널에서 보는 바와 같이, 이중 페길레이션을 사용했을 때 형광 분자와 용액으로 인한 배경 신호가 훨씬 더 약하게 관찰되었습니다. 이는 단백질이 이중 페길레이션 층에 의해 더 효과적으로 반발됨을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. AYA를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 장갑, 고글 및 앞치마와 같은 안전 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.