Name: 둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-29T16:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 꿀벌 일벌의 노화 역전과 둔화 메커니즘을 사회적 역할 기반으로 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 노화와 생물학적 노화 과정을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 촬영하는 동안 도움이 조언과 도움을 오스만 Kaftanoglu 감사합니다. 우리는 통찰력있는 의견에 대한 익명의 검토 자에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구위원회 (180504, 191699 및 213976을 부여), 마리 Curie/FP7 (프로젝트 REF. 238665), 노화 (보조금 NIA의 P01의 AG22500)에있는 국립 연구소와 퓨 자선 신탁에 의해 지원되었다.

1. 연대기 나이에서 노화 디커플링 이 절에서는 같은 연대 세 ( &quot;단일 연령대&quot;)와 둥지 꿀벌의 코호트를 공유 식별 개인의 코호트로 구성 더블 일대 식민지의 설정에 대해 설명합니다. 단일 연령대의 같은 세 사람은 결국 서로 다른 노화 역학과 다른 노동자 유형으로 구분됩니다 - 이러한 가속 기능 저하로 둔화와 초지 기계 꿀벌 간호사 꿀벌입니다. 모든 절차는 하나의 실험 집단에 대해 설명합니다. 우리는 그래서 콜로니 효과 (두 복제 설계)에 대해 제어 될 수있는 적어도 두 개의 콜로니에 대해 실험을 수행하지만 복제합니다 조언한다. <ol><li> 이중 코호트 식민지에 대한 하이브 상자를 준비 : 꿀이 두 음식 빗을받는 하나의 일반 하이브 상자, 꽃가루와 다른 음식 빗, 그리고 두 개의 빈 빗을 준비합니다. 3,000 개 이상의와 성관계 여왕뿐만 아니라 기증자의 식민지를 찾을 수 있는지 확인둥지 꿀벌. 두 나중에 소개합니다 (1.3). </li><li> 획득 및 유사 연대기 연령과 개인을 표시 : 등장 직전에 밀봉 무리와 빗를 수집합니다. 하나의 복제의 경우 3,000 ~ 5,000 덮인 무리 세포의 총 빗를 수집 할 전망이다. 각 모성 유전자형 (하이브 원)의 왜곡 분포를 방지하기 위해 적어도 세 가지 다른 하이브 소스에서 무리의 균형 금액을 사용 복제에 대 한. <ol><li> 60 % ~ 70 % 상대 습도 34 ° C로 설정 인큐베이터에 무리 빗 놓습니다. 새로운 종족 탈출 할 수없는 방식으로 빗을 저장해야합니다. </li><li> 꿀벌 이틀 동안 등장하자 흉부 (예 : 유니 POSCA, 미츠비시 연필 (주))에 작은 페인트 태그로 이러한 꿀벌을 표시합니다. 페인트 표시가 하나의 연령대 (출현 일)의 꿀벌을 확인하실 수 있습니다 및 기타 복제 식민지와 구별 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 나는의 일대를 포함하는 더블 일대 식민지를 설정dentified, 단일 연령 꿀벌 : 하루에 젊은 꿀벌이 표시되어있다가, 볼 ((. 토론의 제 1 절 비교), 그리고 이전에 제조 된 하이브 상자에이 표시되지 않은 꿀벌을 추가 기증자 식민지에서 약 2,500-3,000 둥지 꿀벌 수집 ) 1.1 단계. 후자의 사람들은 알 수없는 둥지 꿀벌 코호트를 구성합니다. <ol><li> 처음에는 여왕 케이지 (시판)에 국한됩니다 여왕을 추가합니다. 식용 사탕 (예 : Apifonda, Südzucker AG, 만하임 / Ochsenfurt의, 독일) 일벌 천천히 여왕을 해제 할 수와 케이지를 밀봉. </li><li> 하나의 연령대를 구성합니다 새로 등장하고 표시 꿀벌을 추가합니다. 이러한 꿀벌은 개인 전용으로 표시되고, 모든 다음 단계를위한 포커스 그룹이다. </li></ol></li><li> 발병을 채집하고 초지 표시 모니터링 : 발병과 단일 연령대의 간호사 - 투 - 초지 기계 전환의 역 동성을 평가하기 위해, 먹이를 찾아 다니는 활동 전자의 인구 통계 학적 발전을 모니터링각 식민지에 대한 매우 다른 일. 식민지 (그림 1)을 설정 한 후 5 일 카운트 시작합니다. <ol><li> 고정 된 시간에서 3 × 20 ​​분의 관찰 기간 내 항공편 (입구 카운트) 꼴에서 돌아 꿀벌의 총 수를 계산합니다. (토론 참조) 방향 항공편의 기간 동안 꿀벌 계산하지 않도록해야합니다. </li><li> 입구 카운트 (&gt; 100 입구 카운트 / 일) 개시 상당한 꼴 활동을 표시하는 경우, 초지 마킹 시작합니다. 이렇게하려면, 하나의 연령대 (단일 표시 개인)의 초지는 처음 꼴 항공 돌아온 두 번째 페인트 표시가 나타납니다. 이 페인트 표시가 발병을 채집의 날을 지정하고, 이후 각 초지 기계의 꼴 나이를 식별 할 수 있습니다. </li><li> 꿀벌의 충분한 숫자가 표시 될 때까지 매일 표시를 반복합니다. 이러한 꿀벌은 일반적으로 23 일 후에, 숙성 된 후 표시 초지의 충분한 수를 추정하는, 더 이상 50-10 % 이상의 회수율을 기대할꼴. </li></ol></li><li> 샘플링 : 모든 초기 표시 꿀벌이 비슷한 연대 기적 나이를 가지고 있기 때문에 초지가 ≥ 14 일 동안 채웠을 때, 간호사 및 이전 초지의 나이와 일치하는 그룹이 동시에 수집 할 수 있습니다. <ol><li> 단일 마크 간호사 꿀벌은 벌통에서 수집, 간호 행동 (오픈 브루 셀에 내려 놓고 머리와 먹이와 애벌레의 청소)에 의해 식별됩니다. </li><li> 매일 먹이를 찾아 다니는 활동을 시작하기 전에 두 번 표시 일벌은 벌통에서 수집됩니다. </li><li> 충분한 환기를 제공 케이지 (튜브, 박스)에 꿀벌을 수집하고, 추가 처리 될 때까지 어두운 유지. 또한, transcriptomic, 성적인 또는 프로테오믹스 연구에 직접 액체 질소에 동결 꿀벌 웁니다. 모든 테스트 그룹에서 개인의 균형 번호를 수집하고 식민지를 복제합니다. </li></ol></li></ol> 2. 하이브의 인구 &lt;변경 속도가 느려 노화와 노동자에 대한 신속한와 노동자의 반전/ P&gt; 이 섹션 둔화 노화 (간호사 꿀벌) 근로자에​​ 대한 가속 노화 (초지) 근로자의 반전이 수행되는 방법에 대해 자세히 설명. 초지는 일반적으로 무리 케어에 종사 간호사 꿀벌의 부족을 경험 할 때 이러한 행동 반전은 유도된다. 간호사 꿀벌 분획 한 하이브 ( &quot;간호사 유래&quot;) 및 초지 기계의 일부와 또 다른 하나는 ( &quot;초지 기계 유래&quot;) : 복귀 절차는 하나의 식민지가 두 두드러기로 복제 분리됩니다. 성공적으로 반전, 플라스틱 가능한 증상과 반대로 노화 복귀 노동자, 지속적인 기계, 지속적인 간호사 꿀벌과 신입 초지와 하나의 연령대에서 공부 할 수 있습니다 후. 이전과 같이, 하나의 연령대가 아닌 정체 불명의 둥지 꿀벌의 일대의 확인 꿀벌, 실험 포커스 그룹을 구성한다. <ol><li> 준비 : 이전 섹션에 설명 된대로 간호사 (싱글 표시) 및 초지 (더블 표시)와 두드러기 복제는 사용할 수 있습니다. 복귀가 완료된 후 충분한 검색을 보장하기 위해 복제 식민지 미만 500 표를 초지로의 복귀를 시작하지해야합니다. <ol><li> 회복 후 검사 그룹의 안전 확인을 위해 원래 하이브 전체 초지 기계의 인구가 복귀하기 전에 전원 표시되어 있습니다하는 것이 중요합니다. 다음 절차는 하나의 복제에 대해 설명합니다. </li><li> 복귀 전날, 초지 기계 파생 하이브에 대한 하나의 추가 하이브 상자 (단계 1.1 참조) 준비합니다. 기증자 하이브에서 두 왕비와 두 종족의 빗을 찾습니다. 실험 식민지로 전송하기 전에이 빗에서 모든 성인 꿀벌을 닦아내. 하나 갇힌 여왕 (단계 1.3 참조) 한 무리 빗 원래 하이브 상자에 여왕과 무리 빗을 대체합니다. 여왕과 무리 빗의 다른 세트는 새로운 하이브 상자 다음날 사용됩니다. 모두 원본과 새로운 하이브가 있는지 확인하는 것이 좋습니다 새로운 종족 빗과 외계인 여왕의 유사 할당 분리 초지와 간호사의 동일하게 경험 하이브 큐 ( &quot;하이브 냄새&quot;)을 변경합니다. </li></ol></li><li> 복귀 : 아침에 바로 복귀하기 전에, 초지 기계에서 파생 된 부분을 수신 할 새 상자에 갇힌 여왕과 무리 빗을 추가합니다. 피크 먹이를 찾아 다니는 시간이 시작될 때까지 기다립니다. 그런 다음 적어도 100m 거리에 원래 위치에서 표시 초지와 간호사 꿀벌 원래 식민지를 이동합니다. <ol><li> 원래 위치에서 무리 만 여왕 초지 기계 파생 하이브의 새로운 상자를 설정합니다. </li><li> 일벌은 탈구 원래 하이브 상자를두고, 원래의 위치로 다시 머리 것입니다. 초지가 둥지 꿀벌의 초지 기계 인구의 분리를 완료하기 위해 다음을 달성하기 위해 2 시간 동안 원래 위치로 복귀 할 수 있습니다. </li><li> 그런 다음, 분리를 종료 원본을 닫고, 지금 하이브를 &quot;간호사 유래&quot;, 최소 3 km 거리 양봉장에 전송합니다. </li></ol></li><li> 성공적인 사회 작업에 대한 하이브 유지 보수 및 모니터링반전 : 건강, 오픈 무리 정기적으로 실험 두드러기를 확인합니다. <ol><li> 식민지 조작 후 첫 일 동안 잠재적 인 병원체의 부하를 줄이기 위해 무인 죽은 무리를 교체합니다. </li><li> 복귀 실험 (그림 2) 완료 될 때 빗이 교체 될 때 또는 다시이 도입되기 전에 무리 빗의 사진을 촬영하고, 초지 기계 파생 하이브에서 성공적으로 반전의 유효성을 검사합니다. 이전에 상한선이 무리와 함께 오픈, 라이브 무리와 지역 초지 기계 파생 식민지에서 간호 활동의 믿을 수있는 마커입니다. </li></ol></li><li> 샘플링 : 사회 반전을 동반 생리 효과 3~8일 초지와 간호사 후 검출 할 수있다을 분리 하였다. <ol><li> 우리는 반전이 시작된 후 팔일 모든 테스트 그룹, 즉 복귀 노동자와 계속 초지 (초지 기계 파생 하이브),뿐만 아니라 계속 간호사와 새로 영입 초지 (간호사 파생 하이브를) 샘플링 조언한다. </li><li> 안부단계 1.5에 설명 된대로 lect 샘플. </li></ol></li></ol> 3. 리포 푸신의 정량화하여 작업자 형 특정 세포 노화 패턴 분석 리포 푸신은 세포 노화의 보편적 인 바이오 마커입니다. 고유 축적 제품으로, 리포 푸신의 특정 형광도는 (방출 최대 = 530-650 nm의) 검출 18 사용할 수 있습니다. <ol><li> 해부 및 고정 : 움직임까지 얼음에 칠 꿀벌, 제거하고 원하는 조직 샘플을 해부하다. <ol><li> 4 ℃에서 하룻밤 배양을 위해, 정착에 (산도 7.2 인산염 완충 식염수, PBS에 4 % 파라 포름 알데히드)을 전송 </li><li> PBS에서 샘플을 3 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> 조직 처리 및 설치 : 진동 블레이드 마이크로톰, 예를 들면 라이카 VT 1000S (라이카 생물계, Nussloch, 독일)를 사용하여 예를 들어, 더 이상 40 ㎛ 이상의 두께 섹션으로 조직 샘플을 잘라. <ol><li&gt; 청소를 들어, 30 % 글리세롤 (PBS)에서 하룻밤 조직 섹션을 품어, 50 % 글리세롤 (PBS)의 또 다른 2 시간. </li><li> 50 % 글리세롤 (PBS)에서 현미경 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 장기 저장 씰 커버 매니큐어 전표. </li></ol></li><li> 이미지 수집 : 리포 푸신를 감지하기 위해, 우리는 λ = 514, 561nm 또는 여기 비슷한을 가진 레이저 라인을 제공하는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 제안하고, 검출기의 대역폭이 570-650 nm의 설정으로. <ol><li> 리포 푸신의 더 나은 식별을 위해, 두 번째 채널을 포함하고, 짧은 파장의 스펙트럼에서 동시 검사를 수행 (여기 = 405 nm의; 방출 = 410-450 nm의). 긴 파장 채널 인해 autofluorescent 기관 및 기타 비 과립 구조로 세분화 리포 푸신를 모두 공개뿐만 아니라, 불특정 &quot;배경&quot;합니다. 둘째로, 더 짧은 파장 채널은 불특정 형광도를 공개 아니지만 리포 푸신 것이다. 따라서, 리포 푸신 식별 facili이 될 수 있습니다<html> 둘 중 하나만 리포 푸신 특정 형광으로 과립을 공개, 두 채널의 신호를 비교하여 tated. </li><li> 고해상도 이미지의 획득은 40X 배율 이상, 1.25 이상, 바람직하게 개구 수 대물를 사용. 스캔 이미지는 약 100 × 100 × 10 μm의 3 차원으로 스택. 모든 개인과 조직 샘플은 여러 이미지 스택으로 표시해야합니다. </li><li> 기술적 편차로 인한 인트라 개인과 개인간 편차를 줄이기 위해 항상 레이저 출력 및 검출 감도를 일정하게 유지. </li><li> 하루 하루의 기술 변화에 의해 편견을 줄이기 위해 몇 가지 검사 각 세션에서 모든 테스트 그룹의 동일한 샘플 번호를 검색합니다. </li></ol></li><li> 이미지 처리 : 현미경 이미지 스택의 고급 처리 할 수​​있는 모듈과 소프트웨어 패키지를 사용하여, 예를 들어 ImageJ에 (건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국의 미국 국립 연구소,gej.nih.gov / IJ / &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> 3D 이미지 스택의 각 차원의 최대 투사를 생성합니다. </li><li> 고주파 노이즈를 감쇠하고, 리포 푸신 과립의 크기와 구조를 보존하기 위해 적당한 커널 크기가 가우스 필터를 적용한다. </li><li> 리포 푸신의 식별 (단계 3.2 참조) 용이하게하기 위해 두 색상 채널을 병합합니다. </li></ol></li><li> 이미지 분석 : 정량 단계를 수행하는 주체가 그룹 ID를 테스트 할 장님이 될 것이라고 확신합니다. <ol><li> 모든 이미지에 대해 먼저 관련 구조를 포함하고, 다른 이미지에서의 ROI와 유사한 크기를 가지고 관심 (ROI)의 영역을 선택합니다. </li><li> 그런 다음 각 ROI를 나타내는 리포 푸신 과립의 원하는 번호를 선택합니다. ROI 내에 리포 푸신 과립을 선정 할 때, 다음과 같은 규칙의 애플리케이션은 주관적인 바이어스를 감소시킬 것이다. <ol><li> 첫 번째 granu을 선택하기위한 일관성있는 위치를 선택합니다르. 이것은 예를 들어, ROI의 가장 왼쪽 가장자리와 가장자리에 가까운 과립이 항상 우선 선택 될 것 일 수있다. </li><li> 다른 후 하나는, 과립 이전 선택 (다음 이웃)에 가장 가까운 것을 선택된다. </li><li> 다음 이웃을 선택할 경우에만 이전 선택에서 바로 검색하고, 예를 들어, 하나의 방향으로 이동한다. 이 규칙은 선택이 밀집 과립 가끔 클러스터에 의해 지배되는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 선택이 완료되면, 각각의 과립 영역을 요약하고 측정함으로써 각 리포 푸신 입자의 크기를 평가. 다른 테스트 그룹의 사람들을 비교하는 적절한 통계 테스트를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

우리는 여기에서 이전에 설명 8,16,17,19,20 접근 채택하고, 꿀벌 유연한 노화 연구를 촉진하는 하나의 워크 플로우에 통합. 우리의 목표는 관련 샘플 자료를 얻기 위해 설정하는 표준화 된 도구를 사용하여이 분야에 초보자 과학자를 제공하고, 다른 연구 팀 간의 실험 재현성을 개선하는 것입니다. 우리의 절차를 단순화하고 (예 : 8에 대한 비교) 이전 설명과 특수 장비를 필요로하지 않지만,주의 사항의 일부 조치가 좋습니다 아래에 수집됩니다. 연대 세부터 노화 디커플링. 가장 중요한 측면은 먹이를 찾아 다니는 행동 (2 차 마킹)의 초기 확인하는 동안 초지 기계 꿀벌의 잘못된 인식을 방지하는 것입니다. 초지 모니터링 ( &quot;입구 카운트&quot;) 또는 표시 할 때 따라서 엄격하게 방향 항공편이 매일 기간을 피하기 않습니다. 이 기간 동안 사전 포럼 많은ging를 무대 꿀벌에서 출발하거나 하이...

높은 사회적 동물의 복잡한 식민지 구조는 생식 계급의 상호 작용을 통해 유지되고, 다른 사회 작업 행동과 일반적으로 비 재생 노동자의 도우미 계급. 다른 노동자에 특정 생리 학적 적응은 별개의 SIB 관리 동작을 가능하게하고, 또한 극단적 인 수명의 차이로 연결되어 있습니다. 꿀벌과 두더지 쥐 사회성이 가속 무시할 또는 1-3 노화 반전의 패턴에 연결하는 방법을 연구하는 가장 좋은 개발 동물 모델을 나타냅니다. 꿀벌 식민지에서, 하나의 알을 낳는 여왕은 음식의 무리, 사료 경향이 노동자의 수천에 의해 지원되고, 체온 조절이나 위생 행동 4를 지키고에 종사. 이 노동자 중 극히 단명 기계, 중간 간호사 꿀벌, 및 긴 수명과 겨울 (diutinus) 꿀벌입니다. 개인은, 그러나, 영구적이에요 특정에 바인딩되지 않습니다rker 형,하지만 유연한 행동 개체 발생을 표시 : 그들은 ( &quot;시간 카스트&quot;) 또 다른 하나의 사회 작업 동작에서 변경합니다. 풋내기 꿀벌은 결국 외부 꼴로 변경할 수있는, 무리 경향 간호사 꿀벌을 변경할 수 있습니다. 그러나 풋내기 둥지 꿀벌은 긴 수명 겨울 꿀벌로 변환 할 수 있으며, 수명이 짧은 초지도 일반적으로 더 이상 수명이 간호사로 되돌릴 수 있습니다. 극단적 인 (겨울 꿀벌) 및 중간 (간호사 꿀벌) 수명을 가진 근로자는 풍부한 자원과 식량 생산 및 저장 기관을 잘 개발 - (1,5 검토) 수명이 짧은 초지에 반대. 그러나, 개별 수명의 규정이 개인의 자원 균형 간단한 변경을 넘어 것이이 같은 젤리 생산 6, 호르몬 제어 7, 면역과 비 재생 노동자 계급의 다양한 적응 기능이 난황 단백질에 대한 연구에 의해 제안 8 항산화 방어 9. F의 패턴후각 설립하고, 다른 뇌 모터 기능 10-13 등 unctional 감소 (노화) 노동자 중 거울 수명 격차. 수명이 긴 겨울 꿀벌 (15)의 검출 감소 (무시할 노화)의 부족과 반대로 특히, 꼴의 두 주 후 학습 기능의 상당한 감소, 초지 14에서 비슷한 사망률의 진행을 일치합니다. 우리는 모니터링 및 노화 형 전환에게 8,16,17 조작을 허용 설립 실험 패러다임에 적응 유연성 노화의 분자 지문을 식별합니다. 연대기 나이와 노화에 근로자 형 특정 사회적 행동의 효과를 분리 할 수​​있는 샘플을 구하는 방법 1 세부 사항을 실험. 실험 2는 둔화 노화 역학 간호사 꿀벌에 가속과 초지의 역전을 설명합니다. 실험 3 anatomica에 의해 세포 노화의 영향을 프로빙에 대한 접근 방식을 제공합니다세포 노화 (리포 푸신) 18 일 설립 된 바이오 마커의 L 정량화.

<table><tbody><tr><td>아피폰다</td><td>S&#252; dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>머크</td><td>1.04094.1000</td><td></td></tr></tbody></table>

둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

높은 사회적 동물의 사회는 밀접한 관련이 개인 사이의 광대 한 수명의 차이가 있습니다. 사회적 곤충 가운데, 꿀벌은 수명과 노화의 가소성이 사회적 요인에 의해 설명되는 방법을 연구하는 최선의 설립 모델입니다. 꿀벌의 노동자 계급은 꿀과 꽃가루를 수집하는 무리 경향 간호사 꿀벌, 및 초지 기계 꿀벌이 포함되어 있습니다. 이전 작업은 뇌 기능과 비행 성능이 간호사보다 초지에 더 빠르게 senesce 것으로 나타났습니다. 초지 다시 간호 업무에 복귀 할 때 그러나, 뇌 기능, 복구 할 수 있습니다. 가속 반전 기능 노화의 이러한 패턴은 단백질 풍부의 변화와 면역 기능, 변경된 대사 자원 수준에 연결되어 있습니다. 비텔로 제닌, 호르몬 조절 및 세포 방어에 적응 기능을 가진 난황 단백질은 노동자의 다른 노화의 역 동성을 제어하는​​ 네트워크의 중요한 조절 요소로 역할을 할 수있다. 여기에서 우리는 간호사와 초지의 출현을 모니터링하고, 이상 수명이 간호사로 일반적으로 수명이 짧은 초지의 역전을 포함, 조작 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 우리의 대표적인 결과는 유사한 연대기 연령 개인이 실험 조건에서 초지와 간호사 꿀벌로 분화 방법을 보여줍니다. 우리는 다시 간호사로 초지에서 행동 반전의 유효성을 검사 할 수있는 방법을 예시. 마지막으로, 우리는 세포 노화가 리포 푸신의 축적, 노화의 보편적 인 바이오 마커를 측정하여 평가 할 수있는 방법을 다른 보여준다. 사회적 영향을 링크 할 수 있습니다 메커니즘을 연구하고 소성 노화를 들어,이 프로토콜은 관련 샘플 자료를 확보하고, 미래 연구간에 데이터의 비교 가능성을 개선하기 위해 설정하는 표준화 된 도구를 제공합니다.

프로토콜 섹션 1과 테스트 그룹은 가속의 특성을 연구하기 위해 얻을 수있는 방법을 2 세부 둔화 단일 연령대와 식민지에서 노화 반전. 우리는 (그림 1, 제 1 절 비교) 6 식민지를위한 초지 기계 카운트 ( &quot;입구 카운트&quot;)을 평가 정상적인 개체 발생을 함께 노동자 타입의 차별화를 모니터링 할 수 있습니다. 그래프는 개인이 10 일 이상 이전되기 전에 초지 기계의 상태로 간호사에 상당한 변화가 일반적으로 관찰되지 않았 음을 보여줍니다. 초지 기계 카운트에 표시 변동성은 다른 식민지 사이에 발병을 꼴의 타이밍에 관해서 관찰되었다 각 식민지에서 표시된 일상의 변화 등. 외에도 같은 다른 무리의 부하와 같은 식민지 특정 인구 통계 학적 요인에서 많은 변화가 기상 조건 (그림 1에서 빨간색으로 표시된 시점)을 변경하여 설명한다. 꼴 역학 닫기 모니터링 따라서 DUR 표시 및 수집 노력을 최적화하는 것이 좋습니다실험을 보내고. <p class="jo...

꿀벌 노동자, 노화는 사회적 행동보다는 연대기 나이에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 매우 다른 노화 패턴과 노동자 유형을 얻을과 세포 노화를 분석 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

다음 실험의 전반적인 목표는 급격한 노화가 지연되고 역전된 메커니즘을 가진 꿀벌 일벌 유형을 확보하는 것입니다. 이를 통해 노화를 연구할 수 있습니다. 이는 동일한 연령의 신생 벌들로 군집을 구성함으로써, 먼저 노화를 연대순 연령과 분리함으로써 달성됩니다.이 벌들은 결국 동일한 연대기적 연령임에도 불구하고 육아 또는 foraging(먹이 찾기)이라는 서로 다른 사회적 과업을 수행하게 됩니다. 육아 벌들은 foraging 벌들의 더 빠른 노화에 비해 노화 속도가 느려진 모습을 보일 수 있습니다. 다음으로, foraging에서 육아로의 노화 역동성 역전이 유도됩니다.먼저 외역봉을 유모봉으로부터 분리하며, 이후 유모봉의 부재를 경험한 외역봉은 유모 활동으로 회귀합니다. 회귀한 일벌, 일반 외역봉 및 유모봉의 세포 노화 증상을 비교하여 결과를 얻습니다. 이 방법은 노화 과정 중 기능적 저하를 늦추는 데 기여하는 메커니즘은 무엇인가와 같은 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않다는 점입니다. 따라서 이러한 방법을 사용하여 실험을 재현하는 것이 용이할 것입니다. 일부 절차의 시연은 이곳 Arizona State University 꿀벌 연구소의 프로젝트 매니저인 Osman Craft가 진행하겠습니다.이 섹션에서는 표식된 꿀벌의 연령 일치 코호트와 무작위 둥지 꿀벌 코호트로 구성된 2개 코호트 군집의 설정 방법을 설명합니다. 표식된 꿀벌은 서로 다른 노화 역학을 가진 육아벌 또는 외역벌로 나뉩니다. 실험은 이러한 군집을 두 개 이상 포함하여 구성해야 합니다.먼저, 꿀이 들어 있는 먹이집 2개, 화분이 들어 있는 먹이집 1개, 그리고 빈 벌집 2개가 들어 있는 일반 벌통을 준비합니다. 그런 다음, 교미된 여왕벌과 3,000마리 이상의 일벌이 있는 공여 군집을 찾습니다. 다음으로, 곧 부화할 밀봉된 봉개 유충이 있는 벌집들을 수집하며, 한 군집당 약 3,000에서 5,000개의 봉개 유충 방이 필요합니다.모계 유전자형의 분포가 편향되는 것을 방지하기 위해, 이러한 소초광은 최소 세 곳 이상의 벌통에서 수집해야 합니다. 이제 수집한 봉개된 소초광을 34 °C, 상대습도 60~70% 조건에서 배양하십시오. 벌들이 2일 동안 우화하도록 하며, 우화하는 유충들이 탈출할 수 없도록 소초광을 보관하십시오.다음으로, 우화한 벌들의 가슴 부위에 작은 페인트 표식을 하여 단일 연령 코호트의 벌들을 식별하고 다른 반복 실험 군집들과 구분하십시오. 어린 벌들의 표식이 완료된 날에, 공여 군집으로부터 2, 503, 000마리의 둥지 벌을 수집하여 준비된 벌통 상자에 이 표식되지 않은 벌들을 추가하십시오.그런 다음 식용 캔디로 밀봉된 케이지에 갇힌 여왕벌을 넣습니다. 건강한 성체 일벌들이 서서히 여왕벌을 풀어줄 것입니다. 마지막으로, 갓 부화하여 표식된 벌들을 추가합니다.본 연구의 목적은 유봉(nurse)에서 외역봉(forager)으로의 전환 시작 시점과 그 역동성을 평가하는 것입니다. 각 군집에 대해 이틀마다 채집 활동의 인구통계학적 발달 과정을 모니터링하십시오. 군집 조성 5일 후부터 계수를 시작합니다.모니터링은 입구 카운트를 통해 채집 비행에서 돌아오는 벌의 총 마릿수를 세어 수행합니다. 이는 정해진 시간에 20분씩 세 차례에 걸쳐 진행합니다. 정위 비행 기간 중에는 벌을 세지 마십시오.입구 출입 횟수가 하루 100회를 초과하면 비행이 시작된 것입니다. 채집 벌들의 표식을 시작하십시오. 벌들을 쉽게 포획할 수 있도록, 비행을 마치고 돌아오는 표식된 벌을 부드러운 핀셋을 사용하여 한 마리씩 수집하십시오.착륙 후, 폼이나 메쉬를 사용하여 벌통 입구를 좁힙니다. 날짜를 지정하는 두 번째 페인트 표시를 하여, 나중에 먹이 탐색 활동이 시작된 연령을 산출할 수 있도록 합니다. 매일 벌을 표시할 때 서로 다른 색상이나 색상 조합을 사용하십시오.연구를 위해 마킹해야 할 벌의 수를 고려할 때, 마킹된 먹이 활동 벌의 5~10% 정도를 회수할 수 있을 것으로 예상하십시오. 최소 2주 동안의 먹이 활동 기간이 지난 후, 마킹된 간호벌과 먹이 활동 벌을 동시에 수집하며, 벌집에서 마킹된 간호벌을 수집하십시오. 이 벌들은 열린 유충 세포에 머리를 넣고 유충에게 먹이를 주거나 청소 작업을 수행합니다. 또한 이중 마킹된 먹이 활동 벌도 함께 수집하십시오.모든 테스트 그룹과 반복 군락에서 균형 잡힌 수의 벌을 수집하십시오. 수집한 벌들을 통풍이 잘 되는 케이지로 옮기고, 추가 처리 전까지 암소에 보관하십시오. 분자 생물학적 연구를 위해서는 수집한 벌들을 액체 질소에 넣어 즉시 급속 냉동하십시오.본 절차는 단일 군집을 간호벌(B 분획)과 외역벌 분획으로 구성된 두 개의 벌통으로 분리하는 방법입니다. 이를 위해서는 이전 섹션에서 준비한 대로, 최소 500마리의 표식된 외역벌을 보유하고 외역벌 개체군 전체에 표식이 완료된 벌통이 필요합니다. 환원 전날에 앞서 설명한 방식대로 두 번째 새 벌통 상자를 준비하십시오.다음으로, 공여 벌통에서 육아판 두 개를 수집합니다. 선택한 육아판에서 모든 성봉을 브러시로 털어냅니다. 또한, 캔디 씰 케이지에 들어있는 여왕벌 한 마리와 육아판 하나가 포함된 공여 벌통 여왕벌 두 마리를 수집합니다.기존 벌통 상자에 여왕벌과 봉개판을 교체해 넣습니다. 다음 날 다른 벌통 상자에는 또 다른 여왕벌과 봉개판을 사용합니다. 이는 추후 유아벌 유래 군집과 외역벌 유래 군집 모두에 새로운 벌통 냄새를 제공하기 위한 대조군 설정입니다.반전일 아침에 새로운 육아 벌집의 상태를 사진으로 촬영합니다. 그 다음, 캔디로 밀봉된 케이지에 넣은 새 여왕벌 한 마리와 육아 벌집 하나를 새 상자에 넣습니다. 해당일의 채집 활동이 가장 활발한 시간에, 표식된 외역봉과 내역봉이 포함된 원래의 군집을 원래 위치에서 최소 100m 떨어진 곳으로 이동시켰다가 다시 원래 위치로 옮깁니다.외역봉 유래 벌통을 위한 새 벌통을 설치하십시오. 외역봉들이 원래 위치로 돌아갈 수 있도록 2시간 동안 기다립니다. 이를 통해 외역봉 집단과 내역봉 집단을 거의 완벽하게 분리할 수 있습니다.분리를 종료하려면 원래의 벌통을 폐쇄하고 최소 3km 떨어진 양봉장으로 옮기십시오. 실험용 벌통에 건강한 개방 봉충이 있는지 정기적으로 확인하십시오. 처음 며칠 동안은 잠재적인 병원균 부하를 줄이기 위해 관리되지 않은 죽은 봉충을 제거하십시오. 이전에 밀봉되었던 봉충 및 살아있는 개방 봉충이 있는 구역은 전환이 시작된 지 8일 후 채집봉 중심 군집에서 육아 활동의 신뢰할 수 있는 지표가 됩니다.앞서 설명한 방법을 사용하여 환원된 일벌, 지속적으로 활동하는 채집벌 및 지속적으로 활동하는 보육벌을 샘플링합니다. 실험이 완료되면, 정상적인 채집벌 수의 평가와 함께 수반되는 일벌 유형의 분화를 모니터링하기 위해 도입된 소초의 사진을 다시 촬영합니다. 6개 군집에 대해 평가한 결과, 10일 후에 채집 활동이 상당히 증가한 것이 관찰되었습니다.빨간색 시점으로 표시된 일부 변동성은 기상 조건의 변화로 인한 것입니다. 먹이 찾기 활동에서 다시 육아 활동으로 돌아가는 역전된 온토제니(ontogeny)는 먹이 수집 벌 유래 군집에 도입된 육아 벌집을 검사함으로써 검증되었습니다. 상단은 벌집이 도입되기 전의 모습입니다.아래는 도입 8일 후의 동일한 콤입니다. 새롭게 부화한 건강한 유충 무리와 부화실 주변의 증가된 화분 저장량은 이전의 foragers가 전형적인 둥지 짓기와 육아 작업을 성공적으로 수행했음을 모두 나타냅니다. 세포 노화의 고도로 보존된 증상인 lipofuscin의 축적을 연령이 일치하는 nurse bee와 forager bee의 다양한 벌 조직에서 평가했습니다.17일간의 채집 활동 결과 리포푸신 과립의 크기가 유의미하게 증가했습니다. D의 화살표로 표시된 바와 같이, 이러한 리포푸신 축적 및 과립 크기의 뚜렷한 증가는 장기간의 채집 기간과 연관이 있었습니다. 이러한 절차를 수행할 때는 일벌의 유형을 정확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어, 사전 채집 단계이자 정위 비행이 일어나는 일일 기간 동안에는 벌의 표식을 중단하여 채집벌을 잘못 식별하는 오류를 방지하십시오.벌들은 우리의 절차에 따라 벌집에서 나가거나 들어오게 됩니다. 유연한 노화의 분자적 특징을 식별하기 위해 프로테오믹스 및 트랜스크립토믹스와 같은 다른 방법들이 수행될 수 있습니다.

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마약 조직의 응용 프로그램에서 꿀벌의 후각 appetitive 에어컨 패러다임 (아피스 mellifera)의 행동 약리학 방법을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 메커니즘 기본 학습과 간단하고 안정적​​인 방식으로 메모리 형성의 조사를 허용합니다.

꿀벌의 코 확장 응답 클래식 컨디셔닝에 Behavioural 약리학 ( 아피스 mellifera)

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

꿀벌(Apis mellifera)을 위해 개발된 코확장반응(PER) 조절프로토콜은 많은 곤충 종에서 여러 가지 학습 메커니즘을 연구하기 위한 생태학적으로 관련성이 있고 쉽게 정량화할 수 있는 수단을 제공합니다.

코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

여기에서 우리는 제시   방법은 개별 꿀벌과 벌집 콜로니 모두 농약 오염 된 식품을 공급한다. 절차는 기본 유생 다이어트 생체 공급함으로써, 또한 벌집 콜로니의 자연 상태에서 개별 꿀벌의 살충제 효과를 평가한다.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

여기서 제시된 프로토콜은 항체 특이성을 시험하기 위해 성인 꿀벌 뇌에서 단백질의 생산을 감소시키기 위한 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 프로토콜이다.

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

이 프로토콜은 농약이 꿀벌(아피스 멜라이프라)재생에 미치는 이해를 향상시키기 위해 개발되었으며, 꿀벌 여왕과 그 노동자 관리인을 통제 된 실험실 환경에서 농약에 노출시키는 방법을 확립하고 관련 반응을 주의 깊게 모니터링합니다.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

면역 조직 화학적 방법은 꿀벌 연구에서 성인 꿀벌의 중추 및 하인두 땀샘에서 세포 사멸 및 괴사 수준을 감지하고 평가하는 데 유용합니다.

꿀벌 조직의 조직학 기초 및 세포 사멸 검출

우리는 현장에서 채취한 꿀벌을 안전하게 취급하기 위한 검증된 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 샘플링 중에 수집된 꽃가루를 통해 식물-곤충 상호 작용의 신속한 조작, 식별, 유전자 샘플링 및 확인을 수행할 수 있습니다. 쉽게 적응할 수 있는 이 접근 방식은 희귀 곤충 그룹을 연구하는 데 비용 효율적이고 치명적이지 않은 수단을 제공합니다.

현장에서 꿀벌을 가두고 안전하게 다루는 신속한 방법

배우세요 꿀벌 일벌의 노화 역전과 둔화 메커니즘을 사회적 역할 기반으로 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 노화와 생물학적 노화 과정을 이해하는 데 활용됩니다.

둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기

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