배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 배아 얼룩말 물고기의 세포에 입 넣는 시냅스 및 흥분성 특성을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 얼룩말 물고기 배아를 해부하여 뒷 뇌의 복부 표면을 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 절개된 제제를 패치 클램프 현미경의 스테이지에 놓고 세포의 구강을 식별하는 것입니다.

다음 패치. 적절한 기록 모드를 사용하여 M 세포에 고정하고 시냅스 활동과 흥분성 특성을 기록합니다. 마지막 단계는 기록된 데이터를 분석하여 시냅스 또는 흥분성 속성을 확인하는 것입니다.

궁극적으로, 이러한 세포의 패치 클램핑은 발달 중인 유기체에서 시냅스 수용체의 특성을 보여주는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 두 가지 주요 어려움 영역이 있습니다. 첫 번째는 해부입니다.

공연 씬의 두 번째 형성은 어려울 수 있습니다. 뒷뇌가 척수에 부착 된 제브라 피시 제제에 대해 작업하기로 결정했을 때이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌으며, 그 절차가 내 연구실의 박사 과정 대학원생 인 burram Roy가 Sard를 깐 해부 접시를 준비하여이 절차를 시작합니다. 먼저 그리스로 와셔를 슬라이드에 고정합니다.

그런 다음 세탁기 중앙에 액체 사드를 추가합니다. 사드는 보통 하룻밤 사이에 경화되어 유리 슬라이드에 작은 원형 침대를 형성하여 해부 접시의 기초가 됩니다. 슬라이드에 커버 슬립을 놓은 후 슬라이드를 녹음실에 넣어 해부의 기초로 사용합니다.

그런 다음 필요한 솔루션을 준비합니다. 세포 외 용액은 실온에 두어야 하며 세포 내 용액은 멸균 상태로 유지해야 합니다. 또한 세포 내 용액에 노란색에 대해 0.1%loose를 추가할 수 있으므로 실험이 끝날 때 M 세포 형태의 시각화를 수행하여 세포 식별을 확인할 수 있습니다.

다음으로, 야생형 얼룩말 물고기 배아를 섭씨 28.5도의 달걀 물에서 키우고 이전 간행물에 따라 수집하고 병기합니다. 해부를 위해 배아를 기록실 역할도 하는 해부 접시로 옮깁니다. 그런 다음 7-10분 동안 마취합니다.

생리적 식염수와 매우 유사한 마취 소금 용액에서 부드러운 꼬리 꼬집음에 대한 반응을 검사하여 적절하게 마취되었는지 확인할 수 있습니다. 그 후, 노 어코드를 통해 배아를 고정하고 25배 배율의 해부 현미경으로 0.001인치 텅스텐 와이어가 있는 SIL 가드 라인 접시에 고정합니다. 해부 범위의 배율을 40에서 50배로 조정하여 해부를 수행합니다.

이제 가느다란 집게를 사용하여 턱, 눈, 전뇌를 제거합니다. 마디삭과 뇌 사이의 겸자를 조심스럽게 움직여 기저 노드 코드로부터 뒷뇌를 부드럽게 떼어냅니다. 그런 다음 복부 표면이 위를 향하도록 뒷뇌를 부드럽게 뒤집습니다.

이러한 위치 지정은 M 세포에 대한 좋은 접근을 제공하며, 일반적으로 어린 배아의 경우 복부 표면에서 5-10마이크로미터 이내에 있고 나이 든 유충의 경우 20-50마이크로미터 이내에 있습니다. 다음으로, 패치 클램프 실험을 수행할 수 있는 녹음 설정으로 준비물을 조심스럽게 이동합니다. M 세포는 미분 간섭 대비로 시각화되지만, 패치 클램핑을 준비하기 위해 다른 이미징 모드도 사용할 수 있습니다.

얇은 벽의 규산보 유리가 있는 패치 CLA 피펫을 당겨 시작합니다. 수평 당김에서 피펫 팁 직경은 부드러운 가장자리로 화재 연마 후 약 0.2-0.4 마이크로 미터이며 섕크 테이퍼의 길이는 약 4mm입니다. 팁을 세포 내 유체에 담궈 피펫 팁을 세포 내 용액으로 채웁니다.

그런 다음 주사기 바늘을 피펫에 삽입하고 주사기에서 세포 내 용액을 부드럽게 배출합니다. 피펫 주입을 완료하려면 피펫을 증폭기 헤드 스테이지에 부착합니다.전기생리학 설정에서는 헤드 스테이지를 수평 축에 대해 약 45도 각도로 유지하는 것이 중요한데, 이는 피펫이 수조 용액으로 내려가기 직전에 셀에 입이 있는 고저항성 밀봉 형성에 적합한 피펫의 진입 각도를 보장하기 때문입니다. 팁이 막힐 가능성을 줄이기 위해 피펫에 소량의 양압을 가하십시오. 피펫에 소량의 양압으로 M 세포에 계속 접근합니다.

양압은 세포를 좌우로 부드럽게 밀어내며, 세포 바로 위에 위치하면 세포막에 작은 보조개를 형성합니다. 이제 피펫을 몇 초 동안 제자리에 두어 세포 표면을 부드럽게 청소하여 피펫과 멤브레인 사이에 강력한 밀봉이 형성될 수 있도록 합니다. 그런 다음 피펫의 양압을 해제하여 밀봉을 시작합니다.

음의 피펫 전위와 결합된 소량의 음압으로 인해 몇 초 내에 기가 씰이 형성됩니다. 그런 다음 증폭기의 유지 전위를 마이너스 60밀리볼트로 변경합니다. 일련의 짧은 흡입 펄스로 세포막을 파열시킵니다.

그런 다음 즉시 멤브레인 전위를 기록하고 커패시턴스 아티팩트를 최소화합니다. 셀 커패시턴스와 액세스 저항을 70-85%로 보상합니다.액세스 저항은 30초에서 1분마다 모니터링해야 하며, 20% 이상의 변화가 있는 경우 실험을 중단해야 합니다. 실험이 끝나고 충분한 데이터가 수집되면, 한 쌍의 집게로 뒷뇌를 제거하여 배아를 희생시킨다.

이 그림은 48개의 HPF 배아에서 얻은 흥분성 A MPA 및 NMDA 수용체 전류의 대표적인 기록을 보여줍니다. 다음은 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위에서 M 셀에서 기록된 자발적인 A MPA ME PSC입니다. 그리고 이것은 평균적인 ME PSC입니다.

다음은 40밀리볼트의 유지 전위에서 M 셀에서 기록된 자발적인 A MPA 및 NMDA me PSC입니다. 그리고 이것은 평균 ME PSCs, 글루타메이트 ME PSCs는 활동 전위를 차단하기 위해 1 마이크로 몰 TTX의 존재 하에서 기록되었으며, 글리신 및 G 발생을 차단하기 위해 5 마이크로 몰 엄격한 9 및 100 마이크로 몰 리톡신이 표시되었습니다. 다음은 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위에서 M 셀에서 기록된 자발적인 MI PSC입니다.

그리고 평균 MI PSC, MI PSC는 활동 전위를 차단하기 위해 1 마이크로 몰 TTX의 존재 하에서 기록되었습니다. 글루타메이트 수용체 활성을 차단하기 위한 1밀리몰 키메라산과 GABA 발생을 차단하기 위한 Qing에 의한 10마이크로몰. 이것들은 이 특정 세포의 M 세포에서 기록된 활동 전위입니다.

0.48 나노 암페어의 SRA 임계값 자극은 여러 활동 전위를 유도했지만 임계값에 대한 자극은 단일 활동 전위의 생성만 초래합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 배아에서 M 세포 및 기타 망상 척수 뉴런의 클램프 기록을 패치하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.