Name: 유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용을 이미징하는 방법을. 유발 및 자발적 시냅틱 활동을 평가하여 신경전달 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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저자는이 작업을 실행하는 동안 도움이 토론의 Harata 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association), 근긴장 의학 연구 재단, 에드워드 말린 크로, 주니어 재단, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 NCH에 화이트 홀 재단의 교부금에 의해 투자되었다

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 자연과 소형 시냅스 활동을 유발하고, destaining 단계에서 이미징에 대한 응답으로 시냅스 소포를 염색하고 destaining을위한 프로토콜을 설명했다. 기존 프로토콜 이외에, 우리는 미니어처 시냅스 활성에 근거 FM의 destaining 관찰의 새로운 프로토콜을 포함했다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 운동 장애 근긴장의 마우스 모델에서 배양 된 신경 세포의 이상을 확인했다. 높은 활성 (20)에 의해 자극 될 때, 야생형 마우스에서 그들의 대응에 비해, 이들 뉴런은 칼슘 2 + 의존적으로 시냅스 소포 세포 외 유출을 가속화 받았다. 신경 전달 물질 방출 (19)의 패치 클램프 전기 생리학 기록에 의해 확인 된 이들 뉴런은 또한, 더 자주 소형 시냅스 활성을 나타내었다. 이러한 분석에서 FM 염료를 사용하기위한 프로토콜의 중요한 측면은 ASS...

시냅스 소포의 기능은 시냅스 전달의 중요한 결정 요인이다. 그들은 시냅스 세포막 (세포 외 유출)와 융합 할 때이 소포는 신경 전달 물질을 방출, 그들은 세포막 (엔도 사이토 시스)에서 재생과 신경 전달 물질로 다시로드 된 후 릴리스의 또 다른 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. 의 역학과 시냅스 소포 재활용을 기본 메커니즘에 대한 연구는 크게 스티 FM 염료 (1)의 도입에 의해 가속화되었다. 긍정적으로 (그림 1A, 그림 1B의 FM1-43 stereoview에서 여러 염료) 친수성 머리 그룹과 소수성 꼬리가 청구 한이 양친 매성 분자는 가역적으로 입력을 침투하지 않고 지질 세포막을 종료 할 수 있습니다. FM 염료의 그룹들이 방출하는 빛의 범위에 영향을 미치는 유사한 기능을 공유 할 수 있습니다. 예를 들어, FM2-10, FM1-43, 및 FM1-84는 두 개의 고리 형 화합물과 슈 사이에 하나의 이중 결합이w 녹색 방출. 그들 사이의 차이는 소수성을 결정하고, 따라서 멤브레인으로부터 출구의 비율 (departitioning) 소수성 꼬리의 길이이다. FM5-95 및 FM4-64의 경우, 세 개의 이중 결합 사이 클릭 화합물을 연결, 그들은 적색 발광을 보여줍니다. 이 염료는 친수성 ​​부분에 대한 차이가 있습니다. 그들은 인해 친수성 ​​환경 소수성 환경 상대 양자 수율 증가, 생체막에 삽입 될 때 모든 FM 염료에서, 형광 강도가 증가한다. 따라서 FM 강도의 변화는 막 회전율의 변화를 나타냅니다. 다른 색 (발광 스펙트럼)과 hydrophobicities는 FM이 시냅스 소포 재활용의 다양한 연구 도구 염료합니다. 이러한 기능을 바탕으로, FM 염료는 대부분 시냅스 소포 재활용 분석을 다음과 같은 방식 (그림 2)에 따라 사용됩니다. 신경그들은 엔도 시토 시스 (염색)을 통해 형태로의는 시냅스 소포 (의 SV)에 채택되기에 가능, FM 염료를 포함하는 세포 외 용액에 목욕을합니다. 염료는 염료가없는 세포 외 용액을인가함으로써 세척하고, 이것은 즉 만 활발히 진행 엔도 시토 시스는 염료 (도 2 하단)으로로드 된 시냅스 소포의 클러스터를 포함 할 기능적 신경 말단을 보여준다. 이후의 세포 외 유출은 세포 외 공간으로 FM 염료의 손실과 형광의 수반하는 손실로 연결 (destaining; 인해 친수성 ​​환경에 departitioning 멀리 세포 외 유출의 사이트에서 확산 둘 다). 따라서 FM의 형광 강도의 변화는 시냅스 소포 엑소와 엔도 사이토 시스의 지표입니다. FM 염료는 다양한 생물과 준비 2,3에있는 시냅스 소포를 얼룩 destain하는 데 사용되었습니다. 예를 들면 포유류 neur 포함ONAL 문화 4-9, 포유류의 뇌 조각 10, 11, 신경 근육 접합부 (12, 13), 망막 바이폴라 뉴런 14, 15, 및 16 달팽이관의 유모 세포. 일반적으로 실험, 염색 및 destaining 모두 광범위 뉴런 (유발 활동을) 자극에 의​​해 트리거됩니다. 외부 자극 (자연과 소형 시냅스 활동) 9,17-19의 부재에서 재활용을 가지고 최근에, 그러나, 약한 자극에 대한 응답으로 시냅스 소포 재활용도 분석하고있다. 자연과 소형 시냅스 활동은 활동 전위의 자연 발화 (그림 3)을 포함하는 이전에, 외부 자극의 부재에서 발생하는 것과 같이 정의된다. 이러한 약한 시냅스 활동은 다양한 자극에 의​​해 트리거보다 FM 신호의 작은 변화와 관련되어있다. 측정을 요구하는 FM의 fluoresc의 변화줬어 강도는 정확하게 시냅스 소포 세포 외 유출 또는 엔도 시토 시스하지만 강도 인공적하지 않은 변경 사항을 반영합니다. 이슈의 원인 중 하나는 FM 염료에 의한 세포막의 비특이적 염색의 존재이다. 이 구성 요소의 점진적 유실이 잘못 시냅스 활동에 기인한다 측정 된 형광 강도의 점진적인 변화로 이어질 것입니다. 이 계수는 (프로토콜 참조) 적절한 방법에 의해 감소​​ 될 수있다. 이슈의 가장 주목할만한 원인은 시냅스 소포 내에 유지 FM 염료의 광표백입니다. FM 강도 광표백 관련된 변화를 측정하는 생물 (시냅스)의 변화에​​ 비해 작아야한다. 민감한 카메라의 최근의 개발은, 예를 들면 전자 승산 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라가 가능한 노광 시간을 단축하고 형광체를 여기 시키는데 사용되는 빛의 강도를 약화 photobleaching에 의해 최소화 할 수있다. 이슈의 또 다른 원인은 드리프트의 iN 광학 현미경의 초점 수준. 촬상 세션 동안 포커스 드리프트는 기계적 또는 열 효과에 의해 야기 될 수 있고, 잘못 측정 된 형광 강도의 변화로 이어질 것이다. 여기에서 우리는 가능한 특히, 소형 시냅스 활성, 약한 또는 전혀 자극의 컨텍스트에서 시냅스 소포 재활용을 분석하는 FM 염료를 사용할 수 있도록 프로토콜 및 장비를 설명한다. 우리는 배양 된 쥐의 해마 신경 세포를 사용하고 destaining 단계 이미징, 유발과 자발적인 시냅스 이벤트 기간 동안 소포의 염색과 destaining의 예를 보여줍니다. 또한 인하여 시냅스 활동에 대한 FM 염료 손실의 부재에서, FM 염료 광표백의 정도를 평가하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>펄스 발생기</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;절연 자극기&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>저배율에서 세포 형태를 평가하는 데 사용한다.</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>초점 드리프트를 최소화하여 고해상도 형광 및 투과광 이미징에 사용한다.</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>수침 렌즈를 권장한다. 이미징 구조가 커버슬립 표면으로부터 깊은 곳에 있지 않은 한(&lt;i&gt;예:&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m) 유침 렌즈를 사용할 수 있다.</td></tr><tr><td>필터 큐브</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>FM1-43용 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em</td></tr><tr><td>필터 큐브</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>FM4-64용 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>이 EMCCD 카메라는 형광의 고감도 검출에 사용한다.</td></tr><tr><td>액체 재순환 냉각기</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>카메라에 냉각수를 지속적으로 순환시켜 -80&amp;deg;C의 온도를 유지함으로써 노이즈를 감소시키는 데 사용한다.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>이 광원은 형광 여기의 신속한 온/오프 제어에 사용한다.</td></tr><tr><td>이미지 획득 소프트웨어</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>고속 관류 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>테트로도톡신</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>주의: 독성 시약. 취급 시 주의하십시오.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>알데히드 고정 가능 FM1-43 (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>알데히드 고정 가능 FM4-64 (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>이오노마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 균형 염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 배지</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>이 용액은 형광 이미징을 방해하는 페놀 레드(phenol red)를 포함하지 않는다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>주의: 독성 시약. 취급 시 주의하십시오.</td></tr><tr><td>수크로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 fm 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

기능 신경 말단에서 시냅스 소포는 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스를 받고있다. 이 시냅스 소포 재활용 효과적으로 막 매출을 공개 스티 FM 염료를 사용하여 분석 할 수 있습니다. FM 염료의 사용을위한 종래의 프로토콜이 자극 (유발) 시냅스 활성 다음 뉴런을 분석을 위해 설계되었다. 최근 프로토콜은 자연 또는 소형 시냅스 이벤트와 같은 약한 시냅스 활동을 함께 FM 신호 분석을위한 유효하게되었다. FM 신호의 이러한 작은 변화의 분석 영상 시스템은 강도의 작은 변화를 감지하기에 충분히 민감하다, 그러나 큰 진폭의 인공적인 변화가 억제되어 있어야합니다. 여기서 우리는, 유발 자발 및 미니어처 시냅스 활동, 예를 들어 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 적용 할 수있는 프로토콜을 설명한다. 이것은 중요하다으로서이 프로토콜은 또한, FM 염료의 광표백의 속도를 평가하는 수단을 포함강도의 작은 변화 이미징 유물의 소스.

예를 들어, 우리는 시냅스 소포의 destaining 시간 코스 (그림 4)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 배양 된 해마의 신경 세포가 자발적 시냅스 활동 (단계 2.3)를 사용하여 FM4-64로 염색 및 염료 무료 솔루션 (솔루션 2 린스)로 세척 하였다. 영상은 자발적인 활동 (단계 5.3) (연속 라인의 초기 부분, 그림 4A)를 사용하여 초기 destaining 시간의 과정을 보여줍니다. 이것은 120 초 동안 10 Hz에서 자극 필드 각각 (단계 5.1)로 유발 된 활성의 3 라운드를 사용 destaining 시간 코스 따른다. 유발 destaining의 양을 측정하는 방법 중 하나는 소포의 전체 리사이클 풀의 크기에 대응 양두 화살표 (ΔFM 유발)으로 설명된다. 첫 번째 자극이 주어지기 전에, (그림 (b)에 확대) FM 강도의 점진적 감소가 발생했...

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

examination-synaptic-vesicle-recycling-using-fm-dyes-during-evoked

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

중앙 신경 터미널에있는 보충 및 특정 시냅스 소포의 동원 (SV) 풀을 수치 라이브 형광 이미징 기술이 설명되어 있습니다. SV 재활용의 두 발만 내부 통제를 제공하는 동일한 신경 터미널에서 모니터링하고 있습니다.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용을 이미징하는 방법을. 유발 및 자발적 시냅틱 활동을 평가하여 신경전달 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

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