멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

다음 실험의 전반적인 목표는 통계적으로 관련된 수의 세포에서 탄소 나노튜브의 세포 흡수를 모니터링하고 정량화하기 위한 나노 도량형 방법을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 농도 의존적인 방식으로 세포에 들어가는 물 분산 가능한 탄소 나노튜브로 세포를 처리함으로써 달성됩니다. 이 탄소 나노튜브는 결국 형광 마커로 표지됩니다.

그런 다음 고정 후 각 세포는 다중 스펙트럼 이미징 흐름의 명시야, 암시야 및 형광 채널에서 이미지화됩니다. 세포분석기. 탄소 나노튜브의 분포와 광 흡수 수준, 산란광 및 형광 수준을 시각화하기 위해 나노 튜브 라벨링은 픽셀 단위로 각 세포를 유도합니다. 궁극적으로, 세포 내의 고유한 광 흡수 및 산란은 탄소 나노튜브의 국소화 및 정량화를 가능하게 합니다.

따라서 이 방법은 나노 독성학 및 나노 의학 분야의 새로운 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 살아있는 세포에서 탄소 기반 물질의 영향과 운명, 약물 전달 시스템으로서의 탄소 나노튜브의 냄비 잠재력 세포 배양수에서 형광 라벨에 결국 결합된 탄소 나노튜브를 분산시키는 것으로 시작합니다. 그런 다음 목욕물에 나노 튜브를 초음파 처리하고 섭씨 20도에서 20 분 동안 초음파 처리합니다. 다음으로, 나노 튜브를 완전한 배지에서 밀리리터 당 0, 10, 20 및 50 마이크로 그램 농도로 희석 한 다음 20 시간 후 섭씨 37도에서 희석 당 1 25 평방 센티미터 플레이트에 관심있는 세포와 함께 2 밀리리터의 희석을 배양하고, 각 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 탄소 나노 튜브 표지 세포를 PBS로 헹굽니다.

세척 후 트립신은 각 플레이트의 세포를 관찰한 다음 완전한 DMEM 배지에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 각 샘플을 개별 einor 15 millil falcon tubes로 옮긴 다음 200 배 G 및 실온에서 5 분 동안 셀을 스핀 다운합니다. 각 펠릿을 섭씨 4도에서 4%파라 포름알데히드에 1시간 동안 재현탁시킵니다.

고정 후, 세포를 다시 스핀 다운하고 150 마이크로 리터의 PBS에서 5 번째 세포에 15 곱하기 10으로 펠렛 화 된 각 샘플을 재현탁합니다. 그런 다음 개별 50미크론 메시 스트레이너를 통해 샘플을 필터링하여 이미지 스트림으로 세포의 이미지를 획득합니다. Multi-spectral imaging 유세포 분석기.

먼저, 조정된 배율을 선택한 다음 관심 있는 샘플 이미지를 선택합니다. 685 나노미터 레이저를 사용하여 암시야를 이미지화하고 유세포 분석기를 설정합니다. 745-800 나노미터의 대역 통과에서 암시야 방출을 수집하는 6번 채널.

이미지 분석을 위해 1번 명시야와 6번 암시야 채널에서 샘플을 이미지화합니다. 먼저, 셀 면적에 대한 너비 x 높이 종횡비를 가진 by parametric dot plot을 만듭니다. 이를 통해 표준 면적과 종횡비가 1에 가까운 단일 세포와 넓은 면적과 작은 종횡비를 갖는 다세포 이벤트와 매우 작은 면적을 나타내는 파편을 구별

세포 이미지를 사용하여 단일 세포가 올바르게 선택되었는지 확인한 후, 낮은 제곱근, 평균 정사각형 구배, 저대비 초점이 맞지 않는 세포를 제외하고 초점이 맞춰진 평면의 세포를 선택할 수 있도록 평균 제곱근 구배에 대한 대비를 표시하여 고대비 탄소 나노 튜브 표지 세포에 대한 이중 파라메트릭 점도표를 설정합니다. 다음으로, 최상의 기능 찾기 도구를 사용하여 레이블이 지정된 셀과 레이블이 지정되지 않은 셀 간에 최상의 통계적 분리를 제공하는 매개변수를 결정합니다. 예를 들어, 이 대표적인 실험의 경우, 평균 픽셀 객체 특징이 가장 적합합니다.

그런 다음 정규화된 주파수에 대해 이 매개변수를 표시하여 각 실험 농도에서 세포가 차지하는 나노튜브의 정량화를 위한 히스토그램을 추적합니다. 이제 명시야의 평균 픽셀 객체와 암시야의 강도에 대한 이중 파라메트릭 그래프를 플로팅합니다. 이 두 매개변수 간의 상관 관계를 확인하기 위해 탄소 나노튜브가 강렬한 어두운 점으로 나타날 때 세포 이미지를 생성하는 방식으로 나노 튜브 정량화도 평가합니다.명시야 채널에서 낮은 강도(예: 0에서 533 사이)의 제한된 범위의 픽셀을 선택하여 임계값 마스크를 생성합니다. 하나는 어두운 나노튜브에 정확하게 맞아 두 번째 마스크는 암시야 채널에서 밝게 보이는 나노튜브를 시각화하기 위한 마스크 2로 표시되었습니다.

강도가 높은 픽셀 범위를 선택합니다. 예를 들어, 이 실험에서는 150에서 4, 095 사이의 범위가 선택되었습니다. 그런 다음 명시야 마스크 1 또는 암시야 마스크 2의 영역을 사용하여 나노튜브의 상대적 내재화를 정량화하기 위해 점도표를 설정합니다.

예를 들어, 마스크 2가 있는 암필드에 해당하는 채널 6의 영역을 마스크 1이 있는 명시야에 해당하는 채널 1의 영역에 대해 플로팅합니다. 마스크 1과 마스크 2 사이의 선형 상관관계를 결정한 후, 먼저 전체 세포의 마스크를 생성한 다음 마스크를 침식하여 세포질 내의 나노튜브를 시각화합니다. 이제 M 0 1 7 x 7 픽셀을 침식하여 세포 내부를 볼 수 있습니다.

세포막 내의 탄소 나노튜브를 시각화하려면 부울 방정식 M zero one을 사용하고 M 0 1 7을 침식하지 마십시오. 즉, 전체 세포의 마스크로, 세포의 내부에서 빼서 막의 마스크를 만들고 막의 어두운 픽셀을 평가하기 위해서만 마스킹합니다. 명시야 마스크 하나를 멤브레인 마스크에 적용합니다.

이러한 모든 마스크를 한 번에 여러 세포에 적용하여 라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 샘플의 차이를 확인합니다. 그런 다음 feature area 도구로 멤브레인의 검은색 픽셀을 선택하여 세포막의 탄소 나노튜브를 정량화합니다. 마지막으로, 내부에 흡수된 탄소 나노튜브와 멤브레인에 흡수된 탄소 나노튜브를 구별합니다.

전체 세포의 검은색 영역에 대한 막의 검은색 영역을 플롯합니다. 하나의 실험 조건에 대한 모든 플롯이 생성되면 통계 보고서 템플릿을 생성합니다. 템플릿을 ST 파일로 저장하고 모든 데이터 파일을 일괄 처리합니다.

이미지 스트림 장치는 명시야, 암시야 및 형광 채널을 포함한 유세포 분석기의 각 세포에 대한 여러 고해상도 이미지를 생성하며, 여기에서 3개의 서로 다른 나노 튜브 표지 세포로 입증되었습니다. 이러한 채널의 오버레이도 표시됩니다. 탄소 nanotubes의 존재는 표지되지 않은 세포와 비교된 표식한 세포의 대조 그리고 기온변화도 둘 다에 있는 변화를 유도합니다.

따라서 이중 파라메트릭 도트 플롯을 만드는 것은 초점 셀을 선택하는 데 중요합니다. 노란색의 초점이 맞지 않는 세포는 나노 튜브 라벨링의 유무에 관계없이 낮은 대비와 낮은 루트 평균 제곱 구배로 구별할 수 있습니다. 표지되지 않은 초점 세포도 낮은 대비를 나타내지만 초점 세포가 나노튜브로 표지될 때 높은 뿌리, 평균 제곱 구배를 보여주지만, 세포는 높은 대비, 낮은 뿌리, 평균 제곱 구배 프로파일을 보여줍니다.

내부화된 탄소 나노튜브는 특히 명시야 채널에서 쉽게 구별되며, 이 채널에서는 강렬한 다크 스팟으로 나타나며, 그 영역은 나노튜브의 농도에 따라 증가합니다. 명시야 이미지의 평균 픽셀 신호를 분석할 때 나노 튜브 흡수의 상대적 정량화를 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 히스토그램은 나노 튜브 라벨링 농도가 증가할 때마다 발생하는 나노 튜브 흡수의 상당한 증가를 보여주며, 탄소 나노 튜브 정량화는 명시야 이미지 내의 제한된 범위의 어두운 픽셀 또는 암시야 내의 고강도 픽셀 내에서 적용된 마스크의 사용을 통해서도 가능하다는 것을 입증했습니다. 나노 튜브가 존재하는 영역에 해당합니다.

그런 다음 이러한 마스크의 면적을 표시하면 탄소 나노 튜브 흡수를 추가로 정량화할 수 있습니다. 또한 명시야 이미지와 암시야 이미지의 스폿 간의 상관 관계는 암시야 강도 대 명시야 평균 픽셀 신호를 플로팅하거나 명시야 내 마스크 영역과 암시야 내 영역을 플로팅하여 평가할 수 있습니다. 이 다음 두 그림에서는 세포 내부에 국한된 탄소 나노튜브의 분석이 표시됩니다.

이 첫 번째 이미지는 생성된 다양한 마스크를 보여줍니다. 기본 세포 마스크의 침식을 기반으로 하는 국소화 마스크의 견고성은 레이블이 지정된 세포와 표시되지 않은 세포의 집합에서 시각적으로 확인해야 합니다. 이 점도표에서 방금 설명한 바와 같이, 세포막의 검은 반점의 총 면적과 전체 세포의 면적을 비교하여 내재화 점수를 결정하기 위해 표시되었습니다.

섭씨 37도에서 20시간 동안 배양된 세포의 경우, 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양된 세포와 비교하여 탄소 나노튜브는 대부분 멤브레인에 위치한 반면, 섭씨 37도에서는 탄소 나노튜브가 세포의 90% 이상에 내재화되어 있습니다. 탄소 나노 튜브 형광은 형광 반점과 밝은 필드 및 어두운 필드 채널 내의 반점 사이의 상관 관계가 너무 낮기 때문에 탄소 나노 튜브 내재화의 좋은 지표가 아닙니다. 실제로, fitzy intensity와 brightfield mean pixel 사이의 상관관계는 -0.2의 Pearson 상관 계수를 나타냅니다.

이러한 이미지에서 볼 수 있듯이 형광 신호는 형광 신호를 부분적으로 소멸시킨 명시야 블랙 스팟, 탄소 나노튜브, 감금 및 세포 내 리소좀 내의 응집과 안정적으로 일치하지 않습니다. 대조적으로, 분산된 나노튜브는 개발 후 보다 신뢰할 수 있는 형광 신호를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 나노 기술 및 나노 의학 분야의 연구자들이 통계적 고처리량 세포 분석 방법을 사용하여 탄소 기반 나노 물질 또는 높은 흡수 및 생명 산란 능력을 가진 나노 물질과 살아있는 세포의 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.