Name: 비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 학습하세요 라이브 공촛점 현미경을 이용하여 PJ-34 처리 시 유방암 세포의 비정상적인 중심체 클러스터링과 세포 사멸 과정을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 다중중심체를 가진 암 세포를 표적하는 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구의 자금 출처 : 텔 아비브 대학의 기술 이전 회사 라모트와 시바 - 메디컬 센터 (M. CA 및 SI.) ICRF의 공동 기금 - 이스라엘 암 연구 재단 (M. CA.)와 이스라엘 과학 재단 ( SI).

1. 세포 배양 준비 MDA-MB-231 세포는 ATCC (미국 유형 문화 수집)에서 구입하여 액체 질소에 보관 하였다. <ol><li> Dulbeco 수정 이글 중간 (DMEM), 10 % 말 혈청, 1 % L-글루타민, 1 % Penstrep-Amphotericine B를 포함하는 10 ML 완전 배지 92 mm 직경 페트리 접시에 씨앗 10 6 MDA-MB-231 세포는 세포를 허용 80 ~ 100 % 정도의 합류로 증식한다. </li><li> 요리에서 배지를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 0.25 % 혈청의 모든 흔적을 제거하는 (W / V) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 짧게 세포 층을 씻으십시오. </li><li> 세포 층 (보통 5 - 15 분 이내) 분산 될 때까지 거꾸로 현미경으로 세포를 접시 관찰 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 2.0 ML를 추가합니다. </li><li> 18 ML 전체 성장 매체를 추가하고 부드럽게 피펫으로 세포를 대기음. 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 1,200 rpm으로 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> CU의 24 ML에 세포 펠렛을 다시 일시 중지매체를 lture. </li><li> 35mm 유리 바닥 요리 (25 % 합류에 대한) 및 인큐베이터의 장소 (5 % CO 2, 37 ° C)에 세포 현탁액 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 솔루션 : <ol><li> 세포 증식을위한 완벽한 매체 : 10 % FBS와 DMEM, 1 % 항생제 (100 단위 / ML 페니실린 G, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 펜 연쇄상-Ampho 솔루션), 2 mM의 L-글루타민. </li><li> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션. </li></ol></li><li> 요리 : 92mm 직경 페트리 접시. 35mm 직경 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리. </li></ol> 2. 라이브 공 촛점 이미징 세포의 준비 <ol><li> 시드 2 × 10 제 1 항에서 언급 한 2 ㎖ 완전 배지에서 유리 바닥 문화 요리 5 MDA-MB-231 세포. 세포 배양은 60 % ~ 70 %의 합류 (접시 당 3-4 × 10 5 세포에 대한)에 도달하면, 형질 진행합니다. </li><li> 두 개의 플라스미드는 엔코딩으로 세포를 형질제조 프로토콜에 따라 리포솜의 transfection 시약 제트-PI를 사용하여 융합 단백질 γ-tubulin의-GFP (중심체의 형광 검출)와 히스톤-RED (H2B-RED, 염색체의 형광 검출을) ING. 간단히, 100 ㎕의 염화나트륨 (150 ㎜)과 관의 각 플라스미드의 2 μg을 혼합한다. 두 번째 튜브에 100 ㎕의 염화나트륨 (150 밀리미터)로 형질 시약 (100 μL)를 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 알을 품다. 다음 두 가지 솔루션, 혼합 (약한 소용돌이를 사용하여) 결합 스핀 다운. RT에서 30 분 알을 품다. </li><li> 형질 혼합물의 배양 기간 동안 PBS로 두 번 세포를 씻으없이 보충 따뜻한 DMEM 2 ㎖ (37 ° C)로 세포 매체를 교체하십시오. </li><li> 부드럽게 DMEM에 세포의 transfection 혼합물을 추가하고 8 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 24 시간 동안 배양 8 시간 후 2 ㎖ 완전 배지와 DMEM를 교체하고 인큐베이터에서 세포를 배양시간. </li><li> 24 시간 형질 전환 한 후 2 ㎖ 완전 배지는 20 μM PJ-34를 포함하여 세포의 매체를 교체하십시오. </li><li> 추가 18 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 세포를 품어. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 유지 이미징 챔버에 적어도 16 시간 동안 공 촛점 이미징을 살 수있는 대상 세포 </li><li> 병렬로, 다음과 같이 형광 현미경을 사용하여 형질 효능 36 시간 게시물 형질을 검사 : <ol><li> 시드 2 × 10 1 coverslip에 잘 당 2 ㎖ 완전한 매체를 포함하는 6 - 잘 접시에 5 MDA-MB-231 세포. </li><li> 섹션 2.2-2.5에서 언급 한 세포를 형질. </li><li> 36 시간 포스트 transfection에 차가운 메탄올에 부화하여 coverslip을에 장착 된 형질 전환 세포 수정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C. </li><li> 고정 솔루션을 기음과 화학 후드에서 건조 장착 세포와 coverslip을 보자. </li><li> DAPI와 골드 antifade 시약을 연장하고 일을하게 적용전자 coverslip에 6 시간 동안 어둠 속에서 건조. </li><li> 형광 현미경 슬라이드를 검사하고 세포의 전체 인구 (DAPI에 의한 DNA의 얼룩)에서 형질 세포 (적색 및 녹색 신호)의 비율을 계산합니다. 100-200 세포가 계산 될 때 원하는 형질의 비율이 20-40 %이다. </li></ol></li></ol> 3. 라이브 공 촛점 이미징 스캐너 설정의 기술적 인 매개 변수 <ol><li> ScanMode XYZT; 구멍 [통풍] 1.00, 줌 3.5, 해상도 8 비트, 레이저 DPSS 561 nm의, 아르곤, 가시 레이저 488 nm의, 레이저 그 / 네 눈에 보이는 633 nm의, 목표 HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV, 수치 조리개 1.4; 굴절률 1.52, 속도 700 Hz에서 검색합니다. </li><li> 이미지를 3 차원 프레 젠 테이션 IMARIS 이미징 소프트웨어 7.0으로 제조 하였다. </li></ol> 4. 고정 된 세포의 유사 분열의 공 촛점 이미징 <ol><li> 시드 2 × 10 5 MDA-MB-231 유방암 세포 (ATCC), 정상 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 또는 PARP1 부족 ME2 ㎖ 완전 배지에서 6 - 잘 접시에 유리 coverslips는에 F (박사 프랑소와 Dantzer에 의해 제조 PARP - - /). 의 coverslips는 2 시간 건조하고, 6 - 잘 접시의 각 우물에 배치 멸균 DD 물로 세척하여 다음, 96 % 에탄올로 세척 하였다. </li><li> 매체에 PJ-34 (10-30 μM)를 추가하고 필요한 기간 (일반적으로 최대 96 시간)에 대한 세포를 품어. </li><li> PBS로 한 번 coverslips를 세척 (인산염 완충 식염수), 그리고 얼음처럼 차가운 메탄올에서 배양하여 세포를 고정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C. </li><li> 고정 솔루션을 기음과 coverslips를 화학 후드에서 건조하자 (이 단계에서, coverslips를 여러 주 동안 -20 ° C에 보관 될 수 있습니다). </li><li> 세포막을 permeabilize 및 RT에서 1 시간 PBST 10 % NDS (정상 당나귀 혈청) ( &#39;차단 솔루션&#39;)로 세포를 차단하는 PBST (PBS 0.1 % 트윈 - 20과 보충) 한 번 coverslips를 씻으십시오. </li><li> 기본 antibodi와 투과 고정 된 세포를 배양RT에서 2 시간 동안 ES (스핀들 및 중심체 염색 용). 반대로 α 튜 블린 (1:250 희석) 및 안티-γ 튜 블린 (1:200 희석) : 항체는 것과 같이 따른다 차단 용액에 희석됩니다. 일차 항체는 다음과 같이 적용됩니다 : 6 잘 플레이트 커버 (덮개가 거꾸로) 각 coverslip에 대한 솔루션을 차단하는 항체의 혼합물 100 μL를 (드롭) 적용됩니다. 부드럽게 항체 드롭 coverslip을 넣어 시드 셀의 드롭에 직면. 실온에서 2 시간 동안 항체를 직면 coverslips를 품어. </li><li> 우물에 다시 coverslips를 배치하고 PBST로 세포를 3 회 세척한다. 다음 형광 차 항체의 coverslips에서 세포를 라벨링 4.6에서 설명한 동일한 절차를 사용합니다. 어둠 속에서, 1 시간, RT에 대한 보조 항체의 coverslips에서 세포를 품어. 항체는 다음과 같은 차단 솔루션에 희석되어 있고, 알렉사 플 루어 568 (1:1,000 희석 알렉사 플 루어 488 (녹색 1:1,000 희석)빨간색). </li><li> 를 사용하여 coverslips를이 DAPI (염색체의 염색을 위해)와 금 antifade 시약을 연장하고 건조 어둠 속에서 RT에서 밤새 배양 마운트합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 커버 전표를 확인합니다. </li></ol> 5. 세포 생존율은 ATP 생산에 의해 측정 ATP 생산은 발광 ATP 탐지 분석 장비로 측정됩니다. <ol><li> 96 - 웰 플레이트 각 well에 800 ㎕의 중간에있는 약 20,000 세포의 씨앗 세포를. 세 빈 우물 매체의 배경 발광 측정을 위해 사용되어야한다. </li><li> 약 10 μM에서 100 μM의 ATP 표준 희석 시리즈를 준비하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 각 웰에 세제의 50 μl를 추가하고 궤도 셰이커, 700 rpm으로 5 분 동안 접시를 흔들. </li><li> 키트 &#39;기질 버퍼&#39;의 5 mL로 &#39;동결 건조 된 기질&#39;의 재구성 각각의 병. </li><li> 우물에 재구성 기질 용액 50 μl를 추가하고 흔들어궤도 셰이커, 700 RPM에서 5 분 판. </li><li> 10 분 동안 어둠 속에서 판을 보관하십시오. </li><li> ELISA 마이크로 플레이트 리더 서로 잘 luminiscence을 측정합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

공 촛점 이미징 유사 분열 동안 라이브 멀티 centrosomal 세포 (그림 3 및 보충 정보)의 PJ-34의 세포 독성 효과를 실시간으로 문서를 제공 살고 있습니다. 이 PJ-34 5-9으로 유사 분열 재해 세포 사멸의 유도를 제안, 여분의 중심체 드 클러스터링 및 세포 죽음에 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 세포 독성을 돌리는 최초의 살아있는 문서이다. 대조적으로, 최고 numerary 중심체의 이중 초점 클러스터링 양방향 focali 클러스터 추가 중심체 (그림 2, 보충 정보)와 일반 유사 분열을 겪고 라이브 치료 MDA-MB-231 세포에서 관찰되었다. 이러한 결과에 따르면, 형질 세포의 공 촛점 이미징 유사 분열 5,9,15,16 동안 형질 전환 세포의 여분 중심체 클러스터링에 연루 단백질의 전위를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다 살고 있습니다. 멀티 centr...

페난 트렌는, PJ-34 등 PARP1 억제제, 파생 스트레스 조건 (뇌졸중이나 심근 경색 1)에 따라 에너지 소비 PARP1 매개 DNA 수선에 의해 유도 된 세포 사멸 세포 사멸에서 정지 세포를 보호하도록 설계되었습니다. 그러나 최근 우리는 PJ-34, 그 유도 PARP1 억제보다 두 배 높은 농도에서 독점적으로 인간의 암 세포 2,3에서 세포 죽음을 일으킬 수 있다는 것을 발견. 세포의 더 급속한 확산이었다, 세포의보다 효과적인 근절했다. PJ-34의 세포 독성 활동은 여분 중심체 유사 분열 2 드 클러스터링에 기인 하였다. 사람의 암세포 항구는 4,5 multicentrosomes. 효율적으로 유사 분열에서 두 개의 중심체를 숨겨 정지 세포 또는 일부 양성 증식 세포를 저해하지 않고 72-96 시간 이내에 세포를 박멸 20 μM PJ-34와 여분 중심체를 항구 인간의 유방암 세포 MDA-MB-231의 배양 <suP&gt; 2,3. 양성 세포는 인간의 흉선에서 준비 MCF-10 인간 유방 상피 세포, 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 기본 간엽 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 세포는 PJ-34의 세포 독성에 저항했다. PJ-34 96 시간 배양 동안 자신의 세포주기 방해하거나 자신의 중심체와 이중 초점 스핀들 형성 2,3에 영향을 미치지 않았다. 양극성 중심체 어셈블리는 유사 분열 4,5 양극성 스핀들 형성에 매우 중요합니다. 따라서 두 개 이상의 중심체를 가진 세포는 두 개의 기둥 4-9에서 자신의 별도의 중심체를 클러스터링, 거의 이해하지 분자 메커니즘을 개발했습니다. 자신의 중심체의 양극 어셈블리의 실패 체포 G2 / M 정지의 세포주기 및 세포 죽음에 이르게 4,5 유사 분열 장애에 기인하는 다극 왜곡 스핀들 및 탈선 염색체 분리가 발생할 수 있습니다. 여분 중심체 드 클러스터링을 기본 분자 메커니즘을 집중적으로 조사하는 &lt;&gt; 10을 먹다. 건강한 조직 5,10을 살려주는 동안이 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은 암 세포의 독점적 인 박멸을 가능하게 할 것이다. 따라서, 유사 분열 재앙 세포 죽음을 활성화 화합물은 공 촛점 이미징 여분 중심체 클러스터링에 영향을 미치는 분자를 식별하는 데 사용할 수있는 것이 좋습니다 인간의 고체 cancers.Our 결과의 넓은 범위에서 효율적일 수 있습니다 선택적 암 치료의 새로운 모드를 제공 유사 분열 2,3, 약물 후보를 대상으로 이들 화합물의 암을 렌더링합니다. 우리는 고정 살아있는 인간의 암 세포 (유사 분열의 여분 중심체의 높은 발생에) 대 정상 세포를 스캔하여 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활성을 기록했다. 단계별로 인간의 암 세포 PJ-34의 세포 독성 활동을 식별하는 데 사용되는 이미징 절차의 단계 설명은 아래에 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>41965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS (소 태아 혈청)</td><td>인비트로젠 (GIBCO)</td><td>12657</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pen-Strep-Ampho 솔루션</td><td>Biological Industries, 이스라엘</td><td>03-033-1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>인비트로겐 (GIBCO)</td><td>25030-024</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>인비트로젠(GIBCO)</td><td>25200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>92mm 페트리 접시</td><td>Nunc, Thermo scientific</td><td>150350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35mm 폴리-D-라이신 코팅된 유리 바닥 문화 접시</td><td>MatTek Corporation, USA</td><td>P35GC-0-14-C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>발광 ATP 검출 분석 키트</td><td>Abcam</td><td>ab113849</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NDS (노멀 당나귀 혈청)</td><td>잭슨 면역연구소</td><td>017-000-121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 &-튜불린 항체</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:250 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Anti &gamma;-tubulin 항체</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:200 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td>1:1,000 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-10042</td><td>1:1,000 dilution (IF)</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>JetPEI (리포솜 형질주입 시약)</td> <td>Polyplus</td><td>101-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica (독일 만하임)</td><td>TCS SP5II</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

강력한 PARP1 억제제 역할을 페난 트렌 유도체 유사 분열의 멀티 centrosomal 인간의 암 세포에있는 여분 중심체의 이중 초점 클러스터링을 막았다. phenanthridine PJ-34은 가장 강력한 분자이다. 여분 중심체의 Declustering 멀티 centrosomal 세포에서 유사 분열 장애 및 세포 죽음을 발생합니다. 대부분의 고체 인간의 암은 여분 중심체의 높은 발생했습니다. PJ-34의 활동은 살아있는 인간의 유방암 중심체에 매우 풍부 형광 γ-tubulin의를 위해 인코딩 벡터에과 형광 히스톤 H2B 선물로 형질 전환 된 MDA-MB-231 세포의 공 촛점 이미징에 의해 실시간으로 기록되었다 염색체. 비정상적인 염색체 배열 및 declustered 중심체를 나타내는 데 클러스터 γ-tubulin의 병소는 PJ-34 치료 후 형질 전환 MDA-MB-231 세포에서 발견되었다. 두 개의 스핀들 극 유엔 클러스터 여분 중심체는 세포의 죽음을 앞에. 이러한 결과는 FO를 연결R 처음 여분 중심체 유사 분열에 드 클러스터링 및 세포 사망에 이르는 세포 분열 장애를 가진 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 최근 발견 독점 세포 독성 활동. 두 개의 중심체와 이중 초점 스핀들과 분열을 겪고 정상 세포를 저해하지 않고 고정 된 세포 다 중심체와 PJ-34 전용 근절 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 이전의 연구 결과에 따르면. PJ-34이 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP1 억제제에 의해 공유되지 않은, 그리고 PARP1 억제의 독립성을 제안, PARP1 부족 MEF 숨겨 extracentrosomes에서 관찰되었다. 공 촛점 이미징을 살고 유사 분열 동안 세포를 근절 새로운 분자를 식별하기위한 유용한 도구를 제공했다.

PJ-34 phenanthridine 1 용해 안정적인 물 (그림 1)입니다. 우리의 이전 결과 세포의 죽음을 발표하고 PJ-34로 치료했다 고정 멀티 centrosomal 암 세포의 여러 유형의 엑스트라 중심체를 드 클러스터. 대조적으로, 일반적인 증식 세포는 2,3 손상되지 않았다. 중심체는 고정 여분 centrosomal 세포 2 centrine1 및 γ-tubulin에 대한 항체를 가진 두 배 레테르를 붙이기에 의해 확인되었다. 여기 PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 현미경을 사용하여 실시간으로이 라이브 여분 centrosomal 세포에서 기록되었다. 인간의 유방암 여분 중심체 4,5의 높은 발생 (&gt; 50 %)이 MDA-MB-231 세포를 라이브 γ-tubulin의-GFP (와 형질 세포에 초점을 맞춘 공 촛점 이미징에 의해 적어도 16 시간...

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

다음 실험의 전반적인 목표는 다중 중심체성 인간 암세포의 유사분열 과정에서 anthr 유도체 PJ 34의 세포독성 효과를 관찰하는 것입니다. 이는 transfection을 통해 중심체는 GFP gamma tubulin으로, 염색체는 H two B read로 표지함으로써 달성됩니다. transfection의 목적은 살아있는 다중 중심체성 암세포의 유사분열 동안 중심체의 이동 및 군집화, 그리고 염색체의 배열을 추적할 수 있도록 하는 것입니다.두 번째 단계로, 형질전환된 세포 중 일부를 추가 중심체 제거제로 작용하는 분자인 PJ 34에 노출시킵니다. 다음으로, 중심체 및 염색체 이동과 관련된 유사분열 과정 중의 사건들을 포착하기 위해 형질전환된 살아있는 암세포를 공초점 현미경으로 스캔합니다. 획득한 연속 이미지를 재배열하거나 클러스터링하면, 살아있는 세포의 공초점 이미징을 기반으로 유사분열 중인 암세포에서 PJ 34 처리에 따른 제거 효과 및 세포독성 효과를 확인할 수 있습니다.이 기술의 응용 가능성은 유사분열 중에 상염색체 암세포만을 선택적으로 제거하는 표적 암 치료법으로 확장됩니다. 이 기술의 시연은 Sheba Medical Center 암 연구 센터의 공동 연구자인 Dr.Asher Castillo와 Telaviv University Sacko 의과대학 영상 유닛의 Dr.Leonid middleman이 진행할 예정입니다. 라이브 공초점 이미징을 위해 MDA-MB-231 유방암 세포를 준비하려면, 35 mm 직경의 Poly-D-lysine 코팅 글라스 바텀 배양 접시에 2 × 10⁵ 개의 세포를 완전 배지 2 mL에 넣어 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오.세포 배양액의 합류도(confluence)가 60~70%에 도달하면 형질전환(transfection) 준비가 완료된 것입니다. 세포에는 두 가지 플라스미드가 형질전환되는데, 하나는 중심체의 형광 검출을 위한 GFP가 포함된 gamma tubulin을 인코딩하고, 다른 하나는 염색체의 형광 검출을 위한 histone red를 인코딩합니다. 형질전환은 제조사의 프로토콜에 따라 리포좀 형질전환 시약인 jet PI를 사용하여 수행합니다. PBS로 세포를 한 번 세척한 후, 보충제가 없는 2 mL의 따뜻한 DMEM으로 세포 배양액을 교체합니다. DMEM 내의 세포에 형질전환 혼합물을 조심스럽게 첨가한 다음, 세포를 인큐베이터로 옮겨 8시간 동안 배양합니다.DMEM을 2 mL의 완전 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 후, 배지를 20 µM PGA 34가 포함된 2 mL의 완전 배지로 교체합니다.라이브 공초점 이미징을 수행하기 전, 세포를 18시간 동안 추가로 배양합니다. 다음은 라이브 공초점 이미징 스캐너 설정의 기술적 매개변수입니다. 스캔 모드 XYZT 핀홀, airy 1.00 줌 3.5 해상도 8비트, 레이저 DPSS 561 nanometers 아르곤 가시광 레이저 488 nanometers 헬륨-네온 가시광 레이저 633 nanometers.대물렌즈 H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63배 1.40 Oil UV 수치구경 1.4. 스캔 속도 700 hertz 및 굴절률 1.52. 세포를 이미징 챔버 내에서 5% carbon dioxide 및 37 °C 상태로 유지하며 최소 16시간 동안 라이브 공초점 이미징을 실시한다.형광 현미경을 사용하여 형 transfection 효율을 확인합니다. 웰당 하나의 커버슬립이 포함된 6웰 플레이트에 2 x 10⁵개의 MDA MB 231 세포를 2 mL의 완전 배지(complete medium)에 분주하여 이 절차를 시작합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 리포좀 transfection 시약인 jet PI를 사용하여 이전과 동일한 방식으로 세포를 transfection합니다.형질전환 36시간 후, 커버슬립에 부착된 형질전환 세포를 PBS로 세척한 뒤 각 웰의 배지를 제거합니다. -20 °C에서 메탄올과 아세톤을 1:1 비율로 섞은 냉각 용액에 7분간 처리하여 세포를 고정합니다.7분 후, 고정액을 흡입하여 제거하고 세포가 부착된 커버슬립을 화학 흄후드 내에서 30분 동안 건조시킵니다. 그다음, DPI가 포함된 prolonged gold anti fade 시약을 도포하고 어두운 곳에서 6시간 동안 커버슬립을 건조시킵니다. 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 적색 및 녹색 신호가 나타나는 형질전환 세포의 백분율을 계산합니다.전체 세포 집단 중 원하는 transfection 비율은 100~200개의 세포를 계수했을 때 약 20~40%입니다. 이 절차를 시작하려면, 6-well plate의 글라스 커버슬립 위에 MDA-MB-231 유방암 세포 2 × 10⁵개를 2 mL의 완전 배지(complete medium)에 넣으십시오. 배지에 PJ 34를 첨가하고 필요한 기간 동안 세포를 배양하십시오.배양 기간이 끝나면, 커버슬립을 PBS로 한 번 세척하고, -20 °C에서 얼음처럼 차가운 메탄올과 아세톤을 1:1 비율로 혼합한 용액에 7분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 다음으로, 고정액을 흡입하여 제거하고 화학 흄후드 내에서 커버슬립을 30분 동안 건조시킵니다. 세포막을 투과화하기 위해 커버슬립을 PBST로 한 번 세척한 후, PBST에 희석한 10% normal donkey serum으로 실온에서 1시간 동안 세포를 블로킹합니다.블로킹 용액에 anti-alpha tubulin 및 anti-gamma tubulin 1차 항체를 첨가하고 볼텍싱하여 첫 번째 항체 혼합물을 제조합니다. 그다지 6웰 플레이트 커버의 각 커버슬립에 항체 혼합물 100 µL를 도포합니다. 커버슬립을 뒤집어 항체 방울 위에 조심스럽게 올린 후 2시간 동안 배양합니다.실온에서 반응시킵니다. 이렇게 하면 방추사와 중심체가 염색됩니다. 커버슬립을 다시 웰에 넣고 PBST로 세포를 세 번 세척합니다.그런 다음 6-웰 플레이트 커버의 커버슬립당 1방울씩 2차 항체인 LOR 488과 LOR 568을 추가합니다. 그다음 커버슬립의 앞면이 항체 방울에 닿도록 뒤집어 놓은 후, 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양이 완료되면 커버슬립을 다시 웰로 옮기고 PBST로 세포를 3회 세척합니다.마지막으로, prolonged gold anti fade reagent를 사용하여 커버슬립을 덮고, 암실 내 상온에서 하룻밤 동안 배양하여 건조시킨 후 공초점 현미경으로 고정된 세포를 이미징합니다. PJ 34는 수용성으로 안정한 phant rodine으로, 이전 연구에서 두 개의 중심체와 양극 방추사를 가지고 유사분열을 하는 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서 다중 중심체를 가진 암세포만을 선택적으로 제거하는 것이 관찰되었습니다. 본 연구에서는 추가 중심체의 발생 빈도가 높은 살아있는 인간 유방암 M-D-A-M-B 231 세포를 사용하여 PJ 34의 세포독성 활성을 조사하였습니다.gamma tubulin foci를 표지하기 위해 gamma tubulin GFP를, 염색체를 표지하기 위해 histone H two B red를 세포에 transfection하였습니다. 공초점 이미징을 통해 MDAMB231 세포를 최소 16시간 동안 스캐닝한 결과, 다음 비디오 클립에서 보는 바와 같이 분열기 세포 대부분에서 추가 중심체에 의한 이초점 군집(bifocal clustering)이 나타났습니다. 첫 번째 비디오는 gamma tubulin으로 중심체가 녹색으로 표지된 분열기의 무작위 선택된 살아있는 세포를 보여줍니다.두 번째 영상에서 GFP는 histone H2B red가 transfection된 무작위로 선택된 MDA-MB-231 세포 내의 유사분열 중 염색체 재배열을 시각화합니다. 이 세 번째 영상은 유사분열을 겪고 있는 MDA-MB-231 세포의 모습으로, 두 개의 초점으로 클러스터링된 extra risomes foci는 녹색으로, 염색체는 적색으로 표지되었습니다. 이와 대조적으로, 20 µM PJ 34와 함께 배양된 transfection된 살아있는 MDA-MB-231 세포에서는 클러스터링되지 않은 중심체와 염색체의 비정상적인 배열이 검출되었으며, 이 영상에 묘사된 바와 같이 이 세포들의 유사분열은 세포 사멸로 끝났습니다.세포 분열 중 세포 사멸을 실시간으로 기록한 이 결과는, 분열기에서 다극 방추사를 가진 인간 악성 세포의 수와 PJ 34를 처리하여 배양한 세포의 세포 사멸 백분율 사이에 이전에 정의된 양의 상관관계가 있음을 강력하게 뒷받침합니다. PJ 34가 강력한 PARP one 억제제로 작용하므로, PARP one 억제가 분열 실패와 관련된 세포 사멸을 유발할 가능성을 조사하였습니다. 정상 및 PARP one 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 PJ 34 농도 증가에 따른 세포 독성 활성을 테스트하였으며, 그 결과가 여기에 제시되어 있습니다.왼쪽 그래프는 각각 검은색 선으로 표시된 정상 생쥐 배아 섬유아세포와 회색 선으로 표시된 PARP one 결핍 섬유아세포를 명시된 농도의 PJ 34와 함께 48시간 동안 배양했을 때 계산된 다초점 방추사의 비율을 보여줍니다. 이 비율은 세 차례의 서로 다른 실험에서 검출된 총 20개의 방추사를 기준으로 계산되었습니다. 오른쪽 그래프는 20 micromolar 농도로 72시간 동안 배양한 정상 및 PARP one 결핍 생쥐 배아 섬유아세포의 생존율을 보여줍니다.PJ 34에 의한 세포 생존율은 세포의 A TP 생성량을 통해 분석되었습니다. 세 차례의 서로 다른 실험에서 각 세포주에 대해 측정한 네 번의 평균값이 제시되었습니다. 이러한 결과는 PJ 34가 PARP one 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 용량 의존적으로 방추사 왜곡과 세포 사멸을 유발했으나, 정상 섬유아세포에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다.PJ 34이 PARP1 결핍 상태임에도 불구하고 PARP1 결핍 MEF를 제거했다는 사실과, PARP1 억제에 필요한 농도보다 높은 농도의 PJ 34로 배양한 PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 다초점 방추사 형성 및 세포 제거 사이의 상관관계는, PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포의 중심체 정돈(decluttering)과 PARP1 억제 사이의 인과적 연결과 일치하지 않습니다. 이 공초점 이미지들은 분열기 상태의 정상 및 PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포를 보여주며, 세포를 고정 및 투과시킨 후 alpha 및 gamma tubulin에 대해 면역 표지하여 각각 방추사를 녹색으로, 중심체를 적색으로 표지하였습니다. 염색체는 DPI 시약을 사용하여 청색으로 표지하였습니다.세포를 처리하지 않거나 명시된 농도의 PJ 34와 함께 48시간 동안 배양하였습니다. PJ 34를 처리한 PARP 1 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서는 응집되지 않은 gamma tubulin ne foci, 방추사 왜곡 및 세포 사멸이 관찰되었으나, PJ 34를 처리한 정상 마우스 배아 섬유아세포에서는 관찰되지 않았습니다. 조사된 세포 배양물 중 일부는 PARP 1의 효소 활성을 억제하는 두 가지 강력한 비-nicotinamide PARP 1 억제제인 BT 8 88 및 G 0 1 4 6 9로 처리되었습니다.테스트한 PARP one 억제제 중 어느 것도 PARP one 활성을 억제하는 농도에서 정상 생쥐 배아 섬유아세포를 손상시키지 않았습니다. 또한, 이러한 PARP one 억제제들은 PARP one 결핍 생쥐 배아 섬유아세포의 중심체 응집에 영향을 주지 않았습니다. 이러한 결과는 다중 중심체를 가진 세포에 대한 PJ 34의 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP one 억제제들과는 공유되지 않음을 나타냅니다.이 기술은 다양한 목적을 위해 다른 살아있는 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

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