Name: 비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 학습하세요 라이브 공촛점 현미경을 이용하여 PJ-34 처리 시 유방암 세포의 비정상적인 중심체 클러스터링과 세포 사멸 과정을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 다중중심체를 가진 암 세포를 표적하는 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구의 자금 출처 : 텔 아비브 대학의 기술 이전 회사 라모트와 시바 - 메디컬 센터 (M. CA 및 SI.) ICRF의 공동 기금 - 이스라엘 암 연구 재단 (M. CA.)와 이스라엘 과학 재단 ( SI).

1. 세포 배양 준비 MDA-MB-231 세포는 ATCC (미국 유형 문화 수집)에서 구입하여 액체 질소에 보관 하였다. <ol><li> Dulbeco 수정 이글 중간 (DMEM), 10 % 말 혈청, 1 % L-글루타민, 1 % Penstrep-Amphotericine B를 포함하는 10 ML 완전 배지 92 mm 직경 페트리 접시에 씨앗 10 6 MDA-MB-231 세포는 세포를 허용 80 ~ 100 % 정도의 합류로 증식한다. </li><li> 요리에서 배지를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 0.25 % 혈청의 모든 흔적을 제거하는 (W / V) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 짧게 세포 층을 씻으십시오. </li><li> 세포 층 (보통 5 - 15 분 이내) 분산 될 때까지 거꾸로 현미경으로 세포를 접시 관찰 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 2.0 ML를 추가합니다. </li><li> 18 ML 전체 성장 매체를 추가하고 부드럽게 피펫으로 세포를 대기음. 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 1,200 rpm으로 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> CU의 24 ML에 세포 펠렛을 다시 일시 중지매체를 lture. </li><li> 35mm 유리 바닥 요리 (25 % 합류에 대한) 및 인큐베이터의 장소 (5 % CO 2, 37 ° C)에 세포 현탁액 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 솔루션 : <ol><li> 세포 증식을위한 완벽한 매체 : 10 % FBS와 DMEM, 1 % 항생제 (100 단위 / ML 페니실린 G, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 펜 연쇄상-Ampho 솔루션), 2 mM의 L-글루타민. </li><li> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션. </li></ol></li><li> 요리 : 92mm 직경 페트리 접시. 35mm 직경 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리. </li></ol> 2. 라이브 공 촛점 이미징 세포의 준비 <ol><li> 시드 2 × 10 제 1 항에서 언급 한 2 ㎖ 완전 배지에서 유리 바닥 문화 요리 5 MDA-MB-231 세포. 세포 배양은 60 % ~ 70 %의 합류 (접시 당 3-4 × 10 5 세포에 대한)에 도달하면, 형질 진행합니다. </li><li> 두 개의 플라스미드는 엔코딩으로 세포를 형질제조 프로토콜에 따라 리포솜의 transfection 시약 제트-PI를 사용하여 융합 단백질 γ-tubulin의-GFP (중심체의 형광 검출)와 히스톤-RED (H2B-RED, 염색체의 형광 검출을) ING. 간단히, 100 ㎕의 염화나트륨 (150 ㎜)과 관의 각 플라스미드의 2 μg을 혼합한다. 두 번째 튜브에 100 ㎕의 염화나트륨 (150 밀리미터)로 형질 시약 (100 μL)를 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 알을 품다. 다음 두 가지 솔루션, 혼합 (약한 소용돌이를 사용하여) 결합 스핀 다운. RT에서 30 분 알을 품다. </li><li> 형질 혼합물의 배양 기간 동안 PBS로 두 번 세포를 씻으없이 보충 따뜻한 DMEM 2 ㎖ (37 ° C)로 세포 매체를 교체하십시오. </li><li> 부드럽게 DMEM에 세포의 transfection 혼합물을 추가하고 8 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 24 시간 동안 배양 8 시간 후 2 ㎖ 완전 배지와 DMEM를 교체하고 인큐베이터에서 세포를 배양시간. </li><li> 24 시간 형질 전환 한 후 2 ㎖ 완전 배지는 20 μM PJ-34를 포함하여 세포의 매체를 교체하십시오. </li><li> 추가 18 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 세포를 품어. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 유지 이미징 챔버에 적어도 16 시간 동안 공 촛점 이미징을 살 수있는 대상 세포 </li><li> 병렬로, 다음과 같이 형광 현미경을 사용하여 형질 효능 36 시간 게시물 형질을 검사 : <ol><li> 시드 2 × 10 1 coverslip에 잘 당 2 ㎖ 완전한 매체를 포함하는 6 - 잘 접시에 5 MDA-MB-231 세포. </li><li> 섹션 2.2-2.5에서 언급 한 세포를 형질. </li><li> 36 시간 포스트 transfection에 차가운 메탄올에 부화하여 coverslip을에 장착 된 형질 전환 세포 수정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C. </li><li> 고정 솔루션을 기음과 화학 후드에서 건조 장착 세포와 coverslip을 보자. </li><li> DAPI와 골드 antifade 시약을 연장하고 일을하게 적용전자 coverslip에 6 시간 동안 어둠 속에서 건조. </li><li> 형광 현미경 슬라이드를 검사하고 세포의 전체 인구 (DAPI에 의한 DNA의 얼룩)에서 형질 세포 (적색 및 녹색 신호)의 비율을 계산합니다. 100-200 세포가 계산 될 때 원하는 형질의 비율이 20-40 %이다. </li></ol></li></ol> 3. 라이브 공 촛점 이미징 스캐너 설정의 기술적 인 매개 변수 <ol><li> ScanMode XYZT; 구멍 [통풍] 1.00, 줌 3.5, 해상도 8 비트, 레이저 DPSS 561 nm의, 아르곤, 가시 레이저 488 nm의, 레이저 그 / 네 눈에 보이는 633 nm의, 목표 HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV, 수치 조리개 1.4; 굴절률 1.52, 속도 700 Hz에서 검색합니다. </li><li> 이미지를 3 차원 프레 젠 테이션 IMARIS 이미징 소프트웨어 7.0으로 제조 하였다. </li></ol> 4. 고정 된 세포의 유사 분열의 공 촛점 이미징 <ol><li> 시드 2 × 10 5 MDA-MB-231 유방암 세포 (ATCC), 정상 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 또는 PARP1 부족 ME2 ㎖ 완전 배지에서 6 - 잘 접시에 유리 coverslips는에 F (박사 프랑소와 Dantzer에 의해 제조 PARP - - /). 의 coverslips는 2 시간 건조하고, 6 - 잘 접시의 각 우물에 배치 멸균 DD 물로 세척하여 다음, 96 % 에탄올로 세척 하였다. </li><li> 매체에 PJ-34 (10-30 μM)를 추가하고 필요한 기간 (일반적으로 최대 96 시간)에 대한 세포를 품어. </li><li> PBS로 한 번 coverslips를 세척 (인산염 완충 식염수), 그리고 얼음처럼 차가운 메탄올에서 배양하여 세포를 고정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C. </li><li> 고정 솔루션을 기음과 coverslips를 화학 후드에서 건조하자 (이 단계에서, coverslips를 여러 주 동안 -20 ° C에 보관 될 수 있습니다). </li><li> 세포막을 permeabilize 및 RT에서 1 시간 PBST 10 % NDS (정상 당나귀 혈청) ( &#39;차단 솔루션&#39;)로 세포를 차단하는 PBST (PBS 0.1 % 트윈 - 20과 보충) 한 번 coverslips를 씻으십시오. </li><li> 기본 antibodi와 투과 고정 된 세포를 배양RT에서 2 시간 동안 ES (스핀들 및 중심체 염색 용). 반대로 α 튜 블린 (1:250 희석) 및 안티-γ 튜 블린 (1:200 희석) : 항체는 것과 같이 따른다 차단 용액에 희석됩니다. 일차 항체는 다음과 같이 적용됩니다 : 6 잘 플레이트 커버 (덮개가 거꾸로) 각 coverslip에 대한 솔루션을 차단하는 항체의 혼합물 100 μL를 (드롭) 적용됩니다. 부드럽게 항체 드롭 coverslip을 넣어 시드 셀의 드롭에 직면. 실온에서 2 시간 동안 항체를 직면 coverslips를 품어. </li><li> 우물에 다시 coverslips를 배치하고 PBST로 세포를 3 회 세척한다. 다음 형광 차 항체의 coverslips에서 세포를 라벨링 4.6에서 설명한 동일한 절차를 사용합니다. 어둠 속에서, 1 시간, RT에 대한 보조 항체의 coverslips에서 세포를 품어. 항체는 다음과 같은 차단 솔루션에 희석되어 있고, 알렉사 플 루어 568 (1:1,000 희석 알렉사 플 루어 488 (녹색 1:1,000 희석)빨간색). </li><li> 를 사용하여 coverslips를이 DAPI (염색체의 염색을 위해)와 금 antifade 시약을 연장하고 건조 어둠 속에서 RT에서 밤새 배양 마운트합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 커버 전표를 확인합니다. </li></ol> 5. 세포 생존율은 ATP 생산에 의해 측정 ATP 생산은 발광 ATP 탐지 분석 장비로 측정됩니다. <ol><li> 96 - 웰 플레이트 각 well에 800 ㎕의 중간에있는 약 20,000 세포의 씨앗 세포를. 세 빈 우물 매체의 배경 발광 측정을 위해 사용되어야한다. </li><li> 약 10 μM에서 100 μM의 ATP 표준 희석 시리즈를 준비하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 각 웰에 세제의 50 μl를 추가하고 궤도 셰이커, 700 rpm으로 5 분 동안 접시를 흔들. </li><li> 키트 &#39;기질 버퍼&#39;의 5 mL로 &#39;동결 건조 된 기질&#39;의 재구성 각각의 병. </li><li> 우물에 재구성 기질 용액 50 μl를 추가하고 흔들어궤도 셰이커, 700 RPM에서 5 분 판. </li><li> 10 분 동안 어둠 속에서 판을 보관하십시오. </li><li> ELISA 마이크로 플레이트 리더 서로 잘 luminiscence을 측정합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

공 촛점 이미징 유사 분열 동안 라이브 멀티 centrosomal 세포 (그림 3 및 보충 정보)의 PJ-34의 세포 독성 효과를 실시간으로 문서를 제공 살고 있습니다. 이 PJ-34 5-9으로 유사 분열 재해 세포 사멸의 유도를 제안, 여분의 중심체 드 클러스터링 및 세포 죽음에 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 세포 독성을 돌리는 최초의 살아있는 문서이다. 대조적으로, 최고 numerary 중심체의 이중 초점 클러스터링 양방향 focali 클러스터 추가 중심체 (그림 2, 보충 정보)와 일반 유사 분열을 겪고 라이브 치료 MDA-MB-231 세포에서 관찰되었다. 이러한 결과에 따르면, 형질 세포의 공 촛점 이미징 유사 분열 5,9,15,16 동안 형질 전환 세포의 여분 중심체 클러스터링에 연루 단백질의 전위를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다 살고 있습니다. 멀티 centr...

페난 트렌는, PJ-34 등 PARP1 억제제, 파생 스트레스 조건 (뇌졸중이나 심근 경색 1)에 따라 에너지 소비 PARP1 매개 DNA 수선에 의해 유도 된 세포 사멸 세포 사멸에서 정지 세포를 보호하도록 설계되었습니다. 그러나 최근 우리는 PJ-34, 그 유도 PARP1 억제보다 두 배 높은 농도에서 독점적으로 인간의 암 세포 2,3에서 세포 죽음을 일으킬 수 있다는 것을 발견. 세포의 더 급속한 확산이었다, 세포의보다 효과적인 근절했다. PJ-34의 세포 독성 활동은 여분 중심체 유사 분열 2 드 클러스터링에 기인 하였다. 사람의 암세포 항구는 4,5 multicentrosomes. 효율적으로 유사 분열에서 두 개의 중심체를 숨겨 정지 세포 또는 일부 양성 증식 세포를 저해하지 않고 72-96 시간 이내에 세포를 박멸 20 μM PJ-34와 여분 중심체를 항구 인간의 유방암 세포 MDA-MB-231의 배양 <suP&gt; 2,3. 양성 세포는 인간의 흉선에서 준비 MCF-10 인간 유방 상피 세포, 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 기본 간엽 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 세포는 PJ-34의 세포 독성에 저항했다. PJ-34 96 시간 배양 동안 자신의 세포주기 방해하거나 자신의 중심체와 이중 초점 스핀들 형성 2,3에 영향을 미치지 않았다. 양극성 중심체 어셈블리는 유사 분열 4,5 양극성 스핀들 형성에 매우 중요합니다. 따라서 두 개 이상의 중심체를 가진 세포는 두 개의 기둥 4-9에서 자신의 별도의 중심체를 클러스터링, 거의 이해하지 분자 메커니즘을 개발했습니다. 자신의 중심체의 양극 어셈블리의 실패 체포 G2 / M 정지의 세포주기 및 세포 죽음에 이르게 4,5 유사 분열 장애에 기인하는 다극 왜곡 스핀들 및 탈선 염색체 분리가 발생할 수 있습니다. 여분 중심체 드 클러스터링을 기본 분자 메커니즘을 집중적으로 조사하는 &lt;&gt; 10을 먹다. 건강한 조직 5,10을 살려주는 동안이 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은 암 세포의 독점적 인 박멸을 가능하게 할 것이다. 따라서, 유사 분열 재앙 세포 죽음을 활성화 화합물은 공 촛점 이미징 여분 중심체 클러스터링에 영향을 미치는 분자를 식별하는 데 사용할 수있는 것이 좋습니다 인간의 고체 cancers.Our 결과의 넓은 범위에서 효율적일 수 있습니다 선택적 암 치료의 새로운 모드를 제공 유사 분열 2,3, 약물 후보를 대상으로 이들 화합물의 암을 렌더링합니다. 우리는 고정 살아있는 인간의 암 세포 (유사 분열의 여분 중심체의 높은 발생에) 대 정상 세포를 스캔하여 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활성을 기록했다. 단계별로 인간의 암 세포 PJ-34의 세포 독성 활동을 식별하는 데 사용되는 이미징 절차의 단계 설명은 아래에 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>41965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS (소 태아 혈청)</td><td>인비트로젠 (GIBCO)</td><td>12657</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pen-Strep-Ampho 솔루션</td><td>Biological Industries, 이스라엘</td><td>03-033-1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>인비트로겐 (GIBCO)</td><td>25030-024</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>인비트로젠(GIBCO)</td><td>25200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>92mm 페트리 접시</td><td>Nunc, Thermo scientific</td><td>150350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35mm 폴리-D-라이신 코팅된 유리 바닥 문화 접시</td><td>MatTek Corporation, USA</td><td>P35GC-0-14-C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>발광 ATP 검출 분석 키트</td><td>Abcam</td><td>ab113849</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NDS (노멀 당나귀 혈청)</td><td>잭슨 면역연구소</td><td>017-000-121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 &-튜불린 항체</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:250 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Anti &gamma;-tubulin 항체</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:200 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td>1:1,000 dilution (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-10042</td><td>1:1,000 dilution (IF)</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>JetPEI (리포솜 형질주입 시약)</td> <td>Polyplus</td><td>101-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica (독일 만하임)</td><td>TCS SP5II</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

강력한 PARP1 억제제 역할을 페난 트렌 유도체 유사 분열의 멀티 centrosomal 인간의 암 세포에있는 여분 중심체의 이중 초점 클러스터링을 막았다. phenanthridine PJ-34은 가장 강력한 분자이다. 여분 중심체의 Declustering 멀티 centrosomal 세포에서 유사 분열 장애 및 세포 죽음을 발생합니다. 대부분의 고체 인간의 암은 여분 중심체의 높은 발생했습니다. PJ-34의 활동은 살아있는 인간의 유방암 중심체에 매우 풍부 형광 γ-tubulin의를 위해 인코딩 벡터에과 형광 히스톤 H2B 선물로 형질 전환 된 MDA-MB-231 세포의 공 촛점 이미징에 의해 실시간으로 기록되었다 염색체. 비정상적인 염색체 배열 및 declustered 중심체를 나타내는 데 클러스터 γ-tubulin의 병소는 PJ-34 치료 후 형질 전환 MDA-MB-231 세포에서 발견되었다. 두 개의 스핀들 극 유엔 클러스터 여분 중심체는 세포의 죽음을 앞에. 이러한 결과는 FO를 연결R 처음 여분 중심체 유사 분열에 드 클러스터링 및 세포 사망에 이르는 세포 분열 장애를 가진 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 최근 발견 독점 세포 독성 활동. 두 개의 중심체와 이중 초점 스핀들과 분열을 겪고 정상 세포를 저해하지 않고 고정 된 세포 다 중심체와 PJ-34 전용 근절 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 이전의 연구 결과에 따르면. PJ-34이 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP1 억제제에 의해 공유되지 않은, 그리고 PARP1 억제의 독립성을 제안, PARP1 부족 MEF 숨겨 extracentrosomes에서 관찰되었다. 공 촛점 이미징을 살고 유사 분열 동안 세포를 근절 새로운 분자를 식별하기위한 유용한 도구를 제공했다.

PJ-34 phenanthridine 1 용해 안정적인 물 (그림 1)입니다. 우리의 이전 결과 세포의 죽음을 발표하고 PJ-34로 치료했다 고정 멀티 centrosomal 암 세포의 여러 유형의 엑스트라 중심체를 드 클러스터. 대조적으로, 일반적인 증식 세포는 2,3 손상되지 않았다. 중심체는 고정 여분 centrosomal 세포 2 centrine1 및 γ-tubulin에 대한 항체를 가진 두 배 레테르를 붙이기에 의해 확인되었다. 여기 PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 현미경을 사용하여 실시간으로이 라이브 여분 centrosomal 세포에서 기록되었다. 인간의 유방암 여분 중심체 4,5의 높은 발생 (&gt; 50 %)이 MDA-MB-231 세포를 라이브 γ-tubulin의-GFP (와 형질 세포에 초점을 맞춘 공 촛점 이미징에 의해 적어도 16 시간...

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

다음 실험의 전반적인 목표는 다중 중심체성 인간 암세포의 유사분열 과정에서 anthr 유도체 PJ 34의 세포독성 효과를 관찰하는 것입니다. 이는 transfection을 통해 중심체는 GFP gamma tubulin으로, 염색체는 H two B read로 표지함으로써 달성됩니다. transfection의 목적은 살아있는 다중 중심체성 암세포의 유사분열 동안 중심체의 이동 및 군집화, 그리고 염색체의 배열을 추적할 수 있도록 하는 것입니다.두 번째 단계로, 형질전환된 세포 중 일부를 추가 중심체 제거제로 작용하는 분자인 PJ 34에 노출시킵니다. 다음으로, 중심체 및 염색체 이동과 관련된 유사분열 과정 중의 사건들을 포착하기 위해 형질전환된 살아있는 암세포를 공초점 현미경으로 스캔합니다. 획득한 연속 이미지를 재배열하거나 클러스터링하면, 살아있는 세포의 공초점 이미징을 기반으로 유사분열 중인 암세포에서 PJ 34 처리에 따른 제거 효과 및 세포독성 효과를 확인할 수 있습니다.이 기술의 응용 가능성은 유사분열 중에 상염색체 암세포만을 선택적으로 제거하는 표적 암 치료법으로 확장됩니다. 이 기술의 시연은 Sheba Medical Center 암 연구 센터의 공동 연구자인 Dr.Asher Castillo와 Telaviv University Sacko 의과대학 영상 유닛의 Dr.Leonid middleman이 진행할 예정입니다. 라이브 공초점 이미징을 위해 MDA-MB-231 유방암 세포를 준비하려면, 35 mm 직경의 Poly-D-lysine 코팅 글라스 바텀 배양 접시에 2 × 10⁵ 개의 세포를 완전 배지 2 mL에 넣어 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오.세포 배양액의 합류도(confluence)가 60~70%에 도달하면 형질전환(transfection) 준비가 완료된 것입니다. 세포에는 두 가지 플라스미드가 형질전환되는데, 하나는 중심체의 형광 검출을 위한 GFP가 포함된 gamma tubulin을 인코딩하고, 다른 하나는 염색체의 형광 검출을 위한 histone red를 인코딩합니다. 형질전환은 제조사의 프로토콜에 따라 리포좀 형질전환 시약인 jet PI를 사용하여 수행합니다. PBS로 세포를 한 번 세척한 후, 보충제가 없는 2 mL의 따뜻한 DMEM으로 세포 배양액을 교체합니다. DMEM 내의 세포에 형질전환 혼합물을 조심스럽게 첨가한 다음, 세포를 인큐베이터로 옮겨 8시간 동안 배

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 ApcMin/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

여기서는 세포 사멸 유도 후 접종된 잎을 지속적으로 이미징하여 프로그래밍된 세포 사멸 개시 속도를 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 현미경을 사용한 세포 사멸 개시 연구

학습하세요 라이브 공촛점 현미경을 이용하여 PJ-34 처리 시 유방암 세포의 비정상적인 중심체 클러스터링과 세포 사멸 과정을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 다중중심체를 가진 암 세포를 표적하는 치료 전략 개발에 활용됩니다.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

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