비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

다음 실험의 전반적인 목표는 다중 중심체성 인간 암세포의 유사분열 과정에서 anthr 유도체 PJ 34의 세포독성 효과를 관찰하는 것입니다. 이는 transfection을 통해 중심체는 GFP gamma tubulin으로, 염색체는 H two B read로 표지함으로써 달성됩니다. transfection의 목적은 살아있는 다중 중심체성 암세포의 유사분열 동안 중심체의 이동 및 군집화, 그리고 염색체의 배열을 추적할 수 있도록 하는 것입니다.

두 번째 단계로, 형질전환된 세포 중 일부를 추가 중심체 제거제로 작용하는 분자인 PJ 34에 노출시킵니다. 다음으로, 중심체 및 염색체 이동과 관련된 유사분열 과정 중의 사건들을 포착하기 위해 형질전환된 살아있는 암세포를 공초점 현미경으로 스캔합니다. 획득한 연속 이미지를 재배열하거나 클러스터링하면, 살아있는 세포의 공초점 이미징을 기반으로 유사분열 중인 암세포에서 PJ 34 처리에 따른 제거 효과 및 세포독성 효과를 확인할 수 있습니다.

이 기술의 응용 가능성은 유사분열 중에 상염색체 암세포만을 선택적으로 제거하는 표적 암 치료법으로 확장됩니다. 이 기술의 시연은 Sheba Medical Center 암 연구 센터의 공동 연구자인 Dr.Asher Castillo와 Telaviv University Sacko 의과대학 영상 유닛의 Dr.Leonid middleman이 진행할 예정입니다. 라이브 공초점 이미징을 위해 MDA-MB-231 유방암 세포를 준비하려면, 35 mm 직경의 Poly-D-lysine 코팅 글라스 바텀 배양 접시에 2 × 10⁵ 개의 세포를 완전 배지 2 mL에 넣어 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오.

세포 배양액의 합류도(confluence)가 60~70%에 도달하면 형질전환(transfection) 준비가 완료된 것입니다. 세포에는 두 가지 플라스미드가 형질전환되는데, 하나는 중심체의 형광 검출을 위한 GFP가 포함된 gamma tubulin을 인코딩하고, 다른 하나는 염색체의 형광 검출을 위한 histone red를 인코딩합니다. 형질전환은 제조사의 프로토콜에 따라 리포좀 형질전환 시약인 jet PI를 사용하여 수행합니다. PBS로 세포를 한 번 세척한 후, 보충제가 없는 2 mL의 따뜻한 DMEM으로 세포 배양액을 교체합니다. DMEM 내의 세포에 형질전환 혼합물을 조심스럽게 첨가한 다음, 세포를 인큐베이터로 옮겨 8시간 동안 배양합니다.

DMEM을 2 mL의 완전 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 후, 배지를 20 µM PGA 34가 포함된 2 mL의 완전 배지로 교체합니다.

라이브 공초점 이미징을 수행하기 전, 세포를 18시간 동안 추가로 배양합니다. 다음은 라이브 공초점 이미징 스캐너 설정의 기술적 매개변수입니다. 스캔 모드 XYZT 핀홀, airy 1.00 줌 3.5 해상도 8비트, 레이저 DPSS 561 nanometers 아르곤 가시광 레이저 488 nanometers 헬륨-네온 가시광 레이저 633 nanometers.

대물렌즈 H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63배 1.40 Oil UV 수치구경 1.4. 스캔 속도 700 hertz 및 굴절률 1.52. 세포를 이미징 챔버 내에서 5% carbon dioxide 및 37 °C 상태로 유지하며 최소 16시간 동안 라이브 공초점 이미징을 실시한다.

형광 현미경을 사용하여 형 transfection 효율을 확인합니다. 웰당 하나의 커버슬립이 포함된 6웰 플레이트에 2 x 10⁵개의 MDA MB 231 세포를 2 mL의 완전 배지(complete medium)에 분주하여 이 절차를 시작합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 리포좀 transfection 시약인 jet PI를 사용하여 이전과 동일한 방식으로 세포를 transfection합니다.

형질전환 36시간 후, 커버슬립에 부착된 형질전환 세포를 PBS로 세척한 뒤 각 웰의 배지를 제거합니다. -20 °C에서 메탄올과 아세톤을 1:1 비율로 섞은 냉각 용액에 7분간 처리하여 세포를 고정합니다.

7분 후, 고정액을 흡입하여 제거하고 세포가 부착된 커버슬립을 화학 흄후드 내에서 30분 동안 건조시킵니다. 그다음, DPI가 포함된 prolonged gold anti fade 시약을 도포하고 어두운 곳에서 6시간 동안 커버슬립을 건조시킵니다. 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 적색 및 녹색 신호가 나타나는 형질전환 세포의 백분율을 계산합니다.

전체 세포 집단 중 원하는 transfection 비율은 100~200개의 세포를 계수했을 때 약 20~40%입니다. 이 절차를 시작하려면, 6-well plate의 글라스 커버슬립 위에 MDA-MB-231 유방암 세포 2 × 10⁵개를 2 mL의 완전 배지(complete medium)에 넣으십시오. 배지에 PJ 34를 첨가하고 필요한 기간 동안 세포를 배양하십시오.

배양 기간이 끝나면, 커버슬립을 PBS로 한 번 세척하고, -20 °C에서 얼음처럼 차가운 메탄올과 아세톤을 1:1 비율로 혼합한 용액에 7분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 다음으로, 고정액을 흡입하여 제거하고 화학 흄후드 내에서 커버슬립을 30분 동안 건조시킵니다. 세포막을 투과화하기 위해 커버슬립을 PBST로 한 번 세척한 후, PBST에 희석한 10% normal donkey serum으로 실온에서 1시간 동안 세포를 블로킹합니다.

블로킹 용액에 anti-alpha tubulin 및 anti-gamma tubulin 1차 항체를 첨가하고 볼텍싱하여 첫 번째 항체 혼합물을 제조합니다. 그다지 6웰 플레이트 커버의 각 커버슬립에 항체 혼합물 100 µL를 도포합니다. 커버슬립을 뒤집어 항체 방울 위에 조심스럽게 올린 후 2시간 동안 배양합니다.

실온에서 반응시킵니다. 이렇게 하면 방추사와 중심체가 염색됩니다. 커버슬립을 다시 웰에 넣고 PBST로 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 6-웰 플레이트 커버의 커버슬립당 1방울씩 2차 항체인 LOR 488과 LOR 568을 추가합니다. 그다음 커버슬립의 앞면이 항체 방울에 닿도록 뒤집어 놓은 후, 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양이 완료되면 커버슬립을 다시 웰로 옮기고 PBST로 세포를 3회 세척합니다.

마지막으로, prolonged gold anti fade reagent를 사용하여 커버슬립을 덮고, 암실 내 상온에서 하룻밤 동안 배양하여 건조시킨 후 공초점 현미경으로 고정된 세포를 이미징합니다. PJ 34는 수용성으로 안정한 phant rodine으로, 이전 연구에서 두 개의 중심체와 양극 방추사를 가지고 유사분열을 하는 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서 다중 중심체를 가진 암세포만을 선택적으로 제거하는 것이 관찰되었습니다. 본 연구에서는 추가 중심체의 발생 빈도가 높은 살아있는 인간 유방암 M-D-A-M-B 231 세포를 사용하여 PJ 34의 세포독성 활성을 조사하였습니다.

gamma tubulin foci를 표지하기 위해 gamma tubulin GFP를, 염색체를 표지하기 위해 histone H two B red를 세포에 transfection하였습니다. 공초점 이미징을 통해 MDAMB231 세포를 최소 16시간 동안 스캐닝한 결과, 다음 비디오 클립에서 보는 바와 같이 분열기 세포 대부분에서 추가 중심체에 의한 이초점 군집(bifocal clustering)이 나타났습니다. 첫 번째 비디오는 gamma tubulin으로 중심체가 녹색으로 표지된 분열기의 무작위 선택된 살아있는 세포를 보여줍니다.

두 번째 영상에서 GFP는 histone H2B red가 transfection된 무작위로 선택된 MDA-MB-231 세포 내의 유사분열 중 염색체 재배열을 시각화합니다. 이 세 번째 영상은 유사분열을 겪고 있는 MDA-MB-231 세포의 모습으로, 두 개의 초점으로 클러스터링된 extra risomes foci는 녹색으로, 염색체는 적색으로 표지되었습니다. 이와 대조적으로, 20 µM PJ 34와 함께 배양된 transfection된 살아있는 MDA-MB-231 세포에서는 클러스터링되지 않은 중심체와 염색체의 비정상적인 배열이 검출되었으며, 이 영상에 묘사된 바와 같이 이 세포들의 유사분열은 세포 사멸로 끝났습니다.

세포 분열 중 세포 사멸을 실시간으로 기록한 이 결과는, 분열기에서 다극 방추사를 가진 인간 악성 세포의 수와 PJ 34를 처리하여 배양한 세포의 세포 사멸 백분율 사이에 이전에 정의된 양의 상관관계가 있음을 강력하게 뒷받침합니다. PJ 34가 강력한 PARP one 억제제로 작용하므로, PARP one 억제가 분열 실패와 관련된 세포 사멸을 유발할 가능성을 조사하였습니다. 정상 및 PARP one 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 PJ 34 농도 증가에 따른 세포 독성 활성을 테스트하였으며, 그 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

왼쪽 그래프는 각각 검은색 선으로 표시된 정상 생쥐 배아 섬유아세포와 회색 선으로 표시된 PARP one 결핍 섬유아세포를 명시된 농도의 PJ 34와 함께 48시간 동안 배양했을 때 계산된 다초점 방추사의 비율을 보여줍니다. 이 비율은 세 차례의 서로 다른 실험에서 검출된 총 20개의 방추사를 기준으로 계산되었습니다. 오른쪽 그래프는 20 micromolar 농도로 72시간 동안 배양한 정상 및 PARP one 결핍 생쥐 배아 섬유아세포의 생존율을 보여줍니다.

PJ 34에 의한 세포 생존율은 세포의 A TP 생성량을 통해 분석되었습니다. 세 차례의 서로 다른 실험에서 각 세포주에 대해 측정한 네 번의 평균값이 제시되었습니다. 이러한 결과는 PJ 34가 PARP one 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 용량 의존적으로 방추사 왜곡과 세포 사멸을 유발했으나, 정상 섬유아세포에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다.

PJ 34이 PARP1 결핍 상태임에도 불구하고 PARP1 결핍 MEF를 제거했다는 사실과, PARP1 억제에 필요한 농도보다 높은 농도의 PJ 34로 배양한 PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서 다초점 방추사 형성 및 세포 제거 사이의 상관관계는, PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포의 중심체 정돈(decluttering)과 PARP1 억제 사이의 인과적 연결과 일치하지 않습니다. 이 공초점 이미지들은 분열기 상태의 정상 및 PARP1 결핍 마우스 배아 섬유아세포를 보여주며, 세포를 고정 및 투과시킨 후 alpha 및 gamma tubulin에 대해 면역 표지하여 각각 방추사를 녹색으로, 중심체를 적색으로 표지하였습니다. 염색체는 DPI 시약을 사용하여 청색으로 표지하였습니다.

세포를 처리하지 않거나 명시된 농도의 PJ 34와 함께 48시간 동안 배양하였습니다. PJ 34를 처리한 PARP 1 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서는 응집되지 않은 gamma tubulin ne foci, 방추사 왜곡 및 세포 사멸이 관찰되었으나, PJ 34를 처리한 정상 마우스 배아 섬유아세포에서는 관찰되지 않았습니다. 조사된 세포 배양물 중 일부는 PARP 1의 효소 활성을 억제하는 두 가지 강력한 비-nicotinamide PARP 1 억제제인 BT 8 88 및 G 0 1 4 6 9로 처리되었습니다.

테스트한 PARP one 억제제 중 어느 것도 PARP one 활성을 억제하는 농도에서 정상 생쥐 배아 섬유아세포를 손상시키지 않았습니다. 또한, 이러한 PARP one 억제제들은 PARP one 결핍 생쥐 배아 섬유아세포의 중심체 응집에 영향을 주지 않았습니다. 이러한 결과는 다중 중심체를 가진 세포에 대한 PJ 34의 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP one 억제제들과는 공유되지 않음을 나타냅니다.

이 기술은 다양한 목적을 위해 다른 살아있는 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.