인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

이 절차의 전반적인 목표는 lipo aspirate의 형태로 얻은 지방에서 지방 유래 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 수술 용액을 제거하고 오염된 적혈구의 흡인을 세척함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 콜라겐분해효소로 세척된 지흡입물의 효소 분해를 통해 줄기세포를 방출하는 것입니다.

다음으로, 기질 혈관 분획 또는 SVF 형태로 방출된 세포를 원심분리에 의해 수집합니다. 마지막 단계는 부착 ASC의 선택 및 배양을 위해 상층액과 플레이트, SVF 세포를 제거하는 것입니다. 궁극적으로 이러한 배양된 ASC를 뼈, 지방 및 연골로 체외 유도합니다.

계통은 배양액 내에서 이러한 세포의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다중 전위를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 세포 수확 전에 많은 양의 리포 아스피린으로 작업해야 하는 물류 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 멸균 콜라겐분해효소 유형 1 용액 및 멸균 제어 매체를 준비합니다.

흡인 용기에 lippo 흡인을 수집합니다. 조심스럽게 lippo 흡인을 멸균 된 1 리터 유리 스피커로 디캔팅합니다. lippo 흡인 층이 중력에 의해 분리되면 상단 오일 층이 있는 경우 흡인합니다.

또한 하단 inate를 제거하십시오. 생성된 지방 조직층의 부피를 평가합니다. 동일한 부피의 멸균 XPBS를 추가하고 흡인에 사용된 피펫으로 저어줍니다.

두 층이 침전되면 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 inate를 흡인합니다. 지방층이 황색의 황금색을 띨 때까지 PBS로 지방 조직 분획을 계속 세척합니다. 마지막으로 inate를 한 번 흡입하여 지방 조직 분획을 남깁니다.

유리 스피커에. 마지막 세척 후 마지막 흡인 전 5분 동안 lippo 흡입 층이 안정되도록 합니다. 필터 장치에서 멸균 콜라겐 분해 효소 용액을 준비합니다.

지방 분획과 멸균 필터의 부피와 동일한 부피를 추가합니다. 그런 다음 세척된 지방 분획을 콜라겐분해효소 용액에 조심스럽게 붓고 병을 단단히 닫습니다. 그런 다음 콜라겐분해효소 지방분해효소를 섭씨 37도의 수조에서 5-10분마다 부드럽게 소용돌이치면서 30분 동안 배양하고, 소화가 진행됨에 따라 지방 조직층이 더 매끄럽게 보이는지 평가하고, 필요한 경우 고체 지방 조각을 용해하기 위해 반응 시간을 늘립니다.

70% 에탄올이 함유된 분해된 콜라겐분해효소 지방 혼합물이 들어 있는 필터 장치를 멸균하고 생물 안전 캐비닛에 다시 넣습니다. 이제 기질 혈관 분획을 포함하는 inate의 25ml 분취량을 멸균 50ml 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 각 튜브에 25ml의 대조 배지를 추가하고 콜라겐분해효소를 비활성화하기 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음 1, 200배 G에 10 분 동안 생물 안전 장에 있는 펠릿으로 기질 혈관 분획을 모으기 위하여 원심 분리기. 각 튜브에서 상등액을 흡입합니다. 상단 오일 층과 떠 다니는 지방 세포가 이 상층액으로 흡인되었는지 확인하십시오.

다음으로, 30ml의 컨디셔닝 매체를 사용하여 SVF 펠릿을 하나의 원심분리 튜브로 결합하고 원심분리로 두 펠릿의 상층액을 흡입한 후 두 개의 새로운 50ml 원심분리 튜브로 균등하게 나눕니다. RBC 용해가 필요한 경우, 이 두 펠릿을 각각 10ml의 RBC 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 배양할 수 있습니다. 원심분리 후, 상층액을 흡인하여 기질 혈관 분획의 펠릿을 생성합니다.

이 두 펠릿을 하나의 새로운 원심분리기 튜브로 결합하십시오. 5-10ml의 대조 매체를 사용하여 새로운 50ml 원심분리기 튜브 위에 배치된 100미크론 메쉬 필터를 사용하여 큰 조직 입자를 걸러낼 수 있습니다. 이제 지방 줄기 세포를 포함하는 여과된 분획을 조직 배양 접시에 분취합니다.

그런 다음 각 요리에 적절한 조절량을 보충하십시오. 미디어 문화. 매체의 변화 없이 3-4일 동안 세포는 배양, 매체를 흡인하고 메마른 PBS로 세포를 한 번 세척하여 오염시키는 적혈구를 제거한 다음 배지를 보충하고 대용량 lippo 흡인 샘플에서 기질 혈관 분획을 분리하기 위해 이 수동 효소를 사용할 때 배양을 계속합니다.

그 결과 배양된 A SC 집단은 외관상 비교적 균질하며 가장 널리 사용되는 검증 수단으로 세포와 같은 섬유아세포로 구성됩니다. 정의된 배양 조건을 사용하여 A SC 집단의 체외 유도는 중배엽, 외배엽 및 내배엽 계통으로 분화됩니다. 체외(in vitro), 트라이 생식층(tri germ layer) 잠재력으로 인해 다양한 재생 모델 시스템에 ASC가 사용되었습니다.

지방형성 세포(addipogenic, osteogenic 및 congenic cell)로의 분화는 일반적으로 A SC를 확인하고 그 다중 효능을 확인하기에 충분합니다. 또한, ASC는 외배엽 계통 또는 내배엽 간 세포 계통의 골격 근육 및 평활 근육 계통 세포로 분화될 수도 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 지방에서 기질 혈관 분획을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

튜링의 목적을 위해 SC 구성 요소입니다.