Name: 인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 학습하세요 인간 지방 흡입물에서 콜라게나아제를 이용한 효소적 소화로 지방 유래 줄기 세포(ASCs)를 수동 분리하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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저자는 인정하고자하는 등 기술 된 프로토콜 및부터 ASC의 그 분리의 발전에 기여하는 추가 연구 인력 감사 : 박사 H. 피터 로렌스, MD, 박사 히로시 Muzuno, MD, 박사 제리 황, MD를 박사 아담 카츠, MD, 박사 윌리엄 푸트 렐, MD, 박사 룽 장, DDS, 박사, 박사 라리사로드 리 게스, MD, 박사 제니 알폰소, 박사, 박사 존 프레이저, 박사. 발표 결과는 NIAMS와 NIDCR 연구소를 포함하여 건강의 국립 연구소에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 투자되었다.

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이 논문의 저자는 캘리포니아 대학의 리젠트과 Cytori 치료학 허가가 소유 한 특허의 공동 발명자이다.

부터 ASC의 절연을위한 지방 조직은 여러 가지 형태가 있습니다 : 주사기 추출 또는 흡입 보조 lipoplasty (즉, 지방 흡입) 중 하나를 통해 얻은 작은 조각으로 절제 또는 lipoplasty을 통해 얻은 조직의 단단한 조각에서. 충돌하는 연구는 16, 17를 제시 한 것처럼 더 SVF 세포 (이에부터 ASC)가 절제된 또는 흡입 지방 샘플에서 얻을 수 있는지 여부는 불분명하다. 그것은 지방 조직의 형태 중 하나는 한 운전자가 자신의 분리 기술에 실력으로 SVF 세포부터 ASC의 분리에 적합한보다 더 많은 것을 할 수있다. 그러나, 지방 흡입이 점에서 절제를 통해 이점을 보유하고 있는가 덜 침습적이며, 훨씬 적은 수술 치료가 필요합니다. 지방 흡입술의 유형과 같은 기술을 포함하여, 지난 십년 동안 증가하고 있지만, 초음파를 이용한 전력 보조 레이저를 이용한 지방 흡입 (18)은, 가장 일반적인 부어 오르는 지방 흡입 유지하는 지방 구획 (19)을</sup...

2001에서, 지방 조직에서 다 능성 줄기 세포의 추정 인구는 저널 조직 공학 1에 기재 하였다. 이 세포는 성형 수술을 통해 얻은 처리 lipoaspirate 조직에서 자신의 유도에 의한 이름 가공 Lipoaspirate 또는 PLA 세포를 부여했다. 이 문서에서 설명하는 분리 방법은 지방 조직 2의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리에 대한 기존의 효소 전략을 기반으로했다. SVF는 조직 배양 기판 (2, 3)에 밀착 아직 적혈구 세포, 섬유 아세포, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포와 전 지방 세포의 최소 처리 인구로서 정의되었다. 시간이 지남에 따라이 SVF의 배양은 이러한 오염 된 세포 집단의 대부분을 제거하고 부착 성, 섬유 아세포의 집단 발생하는 것이 제안된다. 이러한 섬유 아 세포는 미리 것으로 지난 40 년 동안 문헌에서 확인 된지방 세포. 그러나, 우리의 연구 그룹은이 세포가 중배엽 다 능성을 보유하고 PLA 세포로 부착 SVF 인구 이름 것​​을 보여 주었다. 많은 다른 연구 그룹에 의해 후속 연구 (리뷰가 4 참조) 내배엽과 외배엽의 잠재력을 모두 제안하고,이 잠재력을 추가했습니다. 그 이후로,이 세포에 대한 많은 추가적인 조건이 문헌에 등장했다. 컨센서스의 일부 유형을 제공하기 위하여, 용어 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC는 2 차 연례 IFATS 회의에서 채택되었다. 따라서, 용어 ASC는이 문서에서 사용됩니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 표준 실험실 장비를 필요로하고 포스 완충 식염수, 표준 조직 문화 미디어 시약 및 콜라게나 간단한 시약을 사용하는 비교적 간단한 절차입니다. 이것은 지방 조직 부피와 후속 C의 개시 량에 따라부터 ASC 다수 생성 할ulture 시간. 그러나, 지방 조직 등의 대량의 처리는이 프로토콜을 사용하는 정도로 완화 될 수있는 물리적 인 문제를 제시 할 수있다. 또한,이 프로토콜함으로써 승인 된 조직 문화 시설의 사용을 필요로 무균 조직 배양 시설과 승인 된 바이오 안전성 후드를 요구한다. 그들은 좋은 제조 연습 임상 사용의 분리 및 재료의 확장을위한 설계 (GMP) 승인 시설에서 격리하지 않은 경우,이 요구 사항은 임상 응용 프로그램에서 ASC 인구의 유용성을 감소시킬 수있다. 다른 방법으로 운영 극장에서 닫힌 시스템에서부터 ASC를 분리 할 수 있습니다 자동화 시스템은이 중요한 문제를 피할 것이다 이후 체외 확장에 대한 필요없이부터 ASC의 즉시 사용할 수 있습니다. 지금까지 인간의 조직에서 세포의 분리를 위해 상업적으로 이용 가능하다 여섯 자동화 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 가능하게 격리 할 수​​있다즉시 수확을 다음과 지방 조직의 양이 많은부터 ASC의 상당수. 이러한부터 ASC는 지금 수술실을 떠나지 환자없이 재생하는 다양한 목적을 위해 환자에 재 도입 될 수있다. 부터 ASC를 수동으로 분리를 설명하는이 프로토콜뿐만 아니라, Celution 시스템을 사용부터 ASC의 자동 분리를위한 프로토콜은 또한 동반자 문서에 나와있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#8217; Eagle&#8217의 수정; S Medium)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>with 4.5 g/ml 포도당, L-글루타민, 피루브산</td></tr><tr><td>나트륨 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10,000 IU/ml 페니실린/10,000 &#956; g/ml 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-003-CF</td><td>250 &#956; g/ml 암포테리신 B</td></tr><tr><td>10X PBS (포스포 완충 식염수)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>칼슘 없음, 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>20-031-CV</td><td>0.25 % trypsin/2.21mM EDTA</td></tr><tr><td>Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>crude preparation; < 125 콜라겐 소화 단위/mg 고체</td></tr><tr><td>FBS(소 태아 혈청) 열 비활성화</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100106</td><td>USDA 소스, 열 비활성화 </td></tr><tr><td>10ml 혈청학 피펫</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25ml 혈청학 피펫</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-106</td><td></td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>150mm 조직 배양 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>500ml 스테리업 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>PES 멤브레인, 0.22 &#956; m pore</td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>FisherBrand</td><td>22-363-549</td><td>100 &#956; m 나일론 메쉬</td></tr><tr><td>덱사메타손 - 수용성</td><td>시그마</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2 인산염</td><td>시그마</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-글리세로인산이 나트륨 염 </td><td>시그마</td><td>G-9422</td>(<td>글리세로인산</td></tr>염이라고도 함) 인슐<tr><td>린</td><td>시그마</td><td>I-6634</td><td>소 췌장</td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>시그마</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>apo-transferrin</td><td>시그마</td><td>T-4382</td><td></td></tr><tr><td>TGF&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-002</td><td>재조합 인간</td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>알시안 블루</td><td>시그마</td><td>A-5268</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>시그마</td><td>S-0319</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>16% 재고</td></tr><tr>로 공급<td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td colspan="4">장비 필요 </td></tr><tr><td>Class II A/B Biosafety hood</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>은 후드에 흡인을 위한 진공 라인이 있는지 확인합니다</td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Hermle Labnet</td><td>Z383</td><td>50ml 튜브용 스윙 아웃 로터 필요, 1200xg</td></tr><tr><td>수조 </td> 가능 <td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>S52602Q</td><td>5-10L 용량, 37C 가능</td></tr><tr><td>자동 피펫 보조기</td><td>Drummond Pipette Aid XL</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>Forma 310</td><td>직접 가열 또는 수포 재킷</td></tr></tbody></table>

인간 lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

2001 년에, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스의 연구자들은 초기 가공 Lipoaspirate 세포 또는 PLA 세포를 지칭 liposuctioned 지방 조직에서 성체 줄기 세포의 새로운 인구의 격리를 설명했다. 그 후,이 줄기 세포는 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC로 개명 된 줄기 세포 연구 및 재생 의학 분야에서 가장 인기있는 성체 줄기 세포 집단 중의 하나가되기 위하여 갔다. 기사의 수천은 지금 뼈 재생, 말초 신경 수리 및 심장 혈관 엔지니어링을 포함하여 재생 동물 모델의 다양한부터 ASC를 사용하는 방법을 설명합니다. 최근 기사는 병원에서부터 ASC를위한 용도의 무수한을 설명하기 시작했다. 이 문서에 나와있는 프로토콜을 수동 및 효소 화장품 절차에서 얻은 lipoaspirates 많은 양에서부터 ASC를 분리하기위한 기본 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 확대 또는 축소 accommod 아래로 할 수있다lipoaspirate의 볼륨을 먹고 복부 성형술 및 기타 유사한 절차를 통해 얻은 지방 조직에서부터 ASC를 분리하기 위해 적용 할 수 있습니다.

프로토콜의 개요는 위의 큰 볼륨 lipoaspirate 샘플에서 SVF의 분리에 대한 설명서, 효소 방법에 대해 설명합니다. 이 SVF 내에서 ASC 등 다양한 세포 집단이 있습니다. 많은 연구는 표준 조직 배양 조건이 SVF를 배양하는 ASC 형식으로 주로 구성 될 가능성이 접착 섬유 아세포 인구 선택 것이라고 제안한다. 이과 일치, 우리는 배양 SVF 펠릿의 주요 오염 세포 유형, 즉 적혈구, 평활근 세포와 내피 계통 (1)의 세포의 본질적 될 것을, 유동 세포 계측법 및 면역 형광 사용하여 보여 주었다. 그 결과 ASC 인구는 (그림 2) 상대적으로 외관 동질 및 섬유 아세포와 같은 세포로 구성되어 있습니다. 이 자기편부터 ASC 표준 조직 배양 조건에서 배양에서 잘 성장하고 수많은 분자 및 세포 B에 적합하다 시간 1을 두 배로 적당한 인구를 전시생체 내 시험 관내 및 재생 연구에 iology 연구. 그러나 고립 된 S...

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

이 절차의 전반적인 목표는 지방 흡입술을 통해 얻은 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 수술용 용액을 제거하고 흡입물 내의 오염된 적혈구를 세척함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 콜라게나아제(collagenase)를 이용하여 세척된 지방 흡입물을 효소 처리함으로써 줄기세포를 방출시키는 것입니다.다음으로, 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction) 또는 SVF 형태로 방출된 세포들을 원심분리를 통해 수집합니다. 마지막 단계로 상층액을 제거하고, 부착성 ASC를 선택 및 배양하기 위해 SVF 세포를 플레이트에 도말합니다. 최종적으로 이렇게 배양된 ASC를 골, 지방 및 연골 방향으로 인비트로(in vitro) 유도합니다.세포 계통(Lineage)은 세포의 다분화능을 확인하는 것뿐만 아니라, 배양액 내에 해당 세포들이 존재하는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 세포 수확 전 대량의 지방 흡입물(lipoaspirate)을 처리하는 물류적 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 멸균된 collagenase Type 1 용액과 멸균된 대조군 배지를 준비하십시오.흡입 용기에 지방 흡입물을 수집합니다. 지방 흡입물을 1L 멸균 유리 비커에 조심스럽게 붓습니다. 중력에 의해 지방 흡입물 층이 분리되면, 상단에 오일 층이 있을 경우 이를 흡입하여 제거합니다.또한, 하단의 무세포층을 제거합니다. 결과로 얻어진 지방 조직층의 부피를 측정합니다. 동일한 부피의 멸균 1X PBS를 첨가하고, 흡입에 사용한 피펫으로 섞어줍니다.두 층이 분리되면, 10 mL serological pipette을 사용하여 상층액을 흡입하여 제거합니다. 지방 조직 층이 황금색을 띨 때까지 PBS로 계속 세척합니다. 지방 조직 층만 남기고 상층액을 마지막으로 한 번 더 흡입하여 제거합니다.유리 스피커(glass speaker) 내에서, 마지막 세척 후 최종 흡입 전까지 지방흡입 흡인물 층이 5분 동안 가라앉도록 둡니다. 필터 유닛에서 멸균된 collagenase one 용액을 준비합니다.지방 분획의 부피와 동일한 양의 용액을 추가하고 멸균 필터링합니다. 그런 다음 세척된 지방 분획을 콜라게나제 용액에 조심스럽게 붓고 병을 단단히 닫습니다. 이후 콜라게나제 지방 혼합물을 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양하며 5~10분마다 가볍게 소용돌이치게 섞어줍니다.

manual-isolation-adipose-derived-stem-cells-from-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

여기, 우리는 일련의 유화 및 여러 centrifugations를 포함 하는 기계적인 프로세스를 통해 지방 조직에서 stromal 혈관 분수를 얻기 위해 프로토콜 제시.

재생 치료를 위한 Lipoaspirates의 기계 Micronization

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

학습하세요 인간 지방 흡입물에서 콜라게나아제를 이용한 효소적 소화로 지방 유래 줄기 세포(ASCs)를 수동 분리하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

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