분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

이 절차의 전반적인 목적은 후속 기능 연구 및 입양 전이 실험을 위해 마우스 골수에서 호중구를 분리하고 표지하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 수집함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 0.2% 및 1.6% 염화나트륨 용액에 순차적으로 현탁하여 적혈구를 삼투압으로 용해합니다.

다음으로, 밀도 구배 원심분리를 통해 호중구를 분리합니다. 마지막 단계에서 호중구를 세포 추적 염료로 표지합니다. 최종적으로 유세포 분석법을 사용하여 다양한 마우스 조직으로 이동한 입양 전이 호중구의 수를 결정할 수 있습니다.

혈액이나 복강보다 골수에서 마우스 호중구를 분리할 때의 주요 장점은, 정상 상태와 감염 후 모두에서 후속 기능 연구 및 입양 전이 실험에 충분한 대량의 세포를 골수로부터 얻을 수 있다는 점입니다. 호중구 분리를 위해 면역 자기 선택법이나 형광 활성 세포 분류법 대신 밀도 구배 원심분리 기술을 사용하는 장점은 속도가 빠르고 경제적이며, 호중구 활성화를 유도할 수 있는 항체 표지를 피할 수 있다는 것입니다. 안락사시킨 마우스에 70% ethanol을 분사한 후, 저희 실험실의 테크니션인 muca swami가 해당 절차를 시연하겠습니다.

동물의 복부 중앙 부위 피부를 절개한 다음, 하지(lower extremities)를 포함하여 동물의 원위부 피부 조직을 제거합니다. 다음으로, 가위를 사용하여 동물의 뒷다리 근육을 절단하고, 대퇴골두(head of the femur)가 파손되지 않도록 주의하며 고관절에서 ACE beum을 조심스럽게 탈구시킵니다. 그 후 가위와 메스를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아 있는 근육을 제거합니다.

골단이 파손되지 않도록 주의하며 무릎 관절에서 다리뼈를 분리한 다음, 얼음처럼 차가운 RPMI 1 6 4 oh가 담긴 페트리 접시에 뼈를 넣습니다. FBS와 항생제를 첨가합니다. 접시를 조직 배양 후드로 옮긴 후, 새로운 페트리 접시에서 70% ethanol로 각 뼈의 외부를 멸균합니다.

약 10~15초 후, 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 세 번 연속 세척하여 각 뼈 표면의 에탄올을 헹궈냅니다. 그런 다음 각 뼈의 골단(epiphysis)을 절단하여 새로운 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 10 mL의 RPMI가 채워진 12 cc 주사기에 25게이지 바늘을 장착합니다.

FBS와 EDTA를 첨가합니다. 그런 다음, 각 대퇴골-경골 쌍의 골간 양끝에서 골수 세포를 100 µm 필터가 장착된 50 mL 스크류 캡 Falcon 튜브로 밀어내어 모든 세포를 회수합니다. 바늘 끝으로 뼈의 내면을 긁어냅니다.

뼈가 하얗게 변하면 세포가 충분히 제거된 것입니다. 이제 메스를 사용하여 골단(bone epiphyses)을 0.5에서 1mm 크기의 작은 조각으로 자른 다음, 2.5mL BioPure 피펫 팁의 뒷부분을 사용하여 100µm 필터 너머로 조각들을 으깨어 줍니다. 수집된 세포를 427×g, 4°C에서 7분 동안 원심 분리한 후, 20mL의 0.2% sodium chloride로 약 20초 동안 적혈구를 세척합니다.

그런 다음 1.6% sodium chloride 20 mL를 사용하여 용해를 중단하고, 세포를 원심 분리한 후 FBS와 EDTA가 첨가된 RPMI 1640 배지에 펠릿을 재부유시킵니다. 세포 수를 측정하고 다시 원심 분리한 후, 세척된 펠릿을 ice-cold sterile PBS 1 mL당 100 × 10⁶ cells 이하의 농도로 재부유시킵니다. 이제 18~26 °C의 His-tag opaque 1119 3 mL를 15 mL 원뿔형 튜브에 분주하고, 그 위에 18~26 °C의 용액 3 mL를 천천히 층분리하여 얹어줍니다.

Hisopaque 1077을 사용합니다. 두 밀도의 혼합을 방지하기 위해 Hisopaque 1077 층 위에 골수 세포 현탁액을 조심스럽게 층분리합니다. 브레이크 없이 25 °C에서 834 ×g로 30분 동안 원심분리하여 밀도 구배를 형성한 후, Hisopaque 1119와 1077 층의 경계면에서 호중구(neutrophils)를 수집합니다. 수집한 호중구를 RPMI 1640, FBS 및 항생제로 2회 세척한 후, 37 °C로 예열한 PBS에 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 세포를 재현탁합니다.

세포 수를 센 후, 각 실험 샘플의 소량 분주액을 따로 보관하여 유세포 분석법으로 순도와 생존율을 결정합니다. 그런 다음, 남은 호중구에 최종 농도 5 µM의 cell tracker 염료를 처리하여 37 °C의 진탕 수조 내 암소에서 10분 동안 라벨링합니다. 마지막으로, 염료 간 교차 오염을 방지하기 위해 FBS와 항생제가 첨가된 얼음처럼 차가운 RPMI 1640으로 세포를 두 번 세척한 후, 이후의 경쟁적 재집락 연구를 위해 서로 다르게 라벨링된 호중구 집단들을 혼합합니다. 여기 패널에는 감염되지 않은 C57BL/6 마우스의 골수에서 분리하여 밀도 구배 원심분리로 분리한 호중구의 대표적인 유세포 분석 플롯이 표시되어 있습니다. 초기 게이팅은 Histopaque 1119와 Histopaque 1077의 계면에서 수집한 골수 세포에 사용되었습니다.

전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 이용하면, 밀도 구배 분리된 호중구가 입양 전이 후 최소 4시간 동안 90% 이상의 순도와 95% 이상의 생존율을 유지함을 입증할 수 있습니다. CellTracker DIA로 라벨링된 호중구는 유세포 분석법을 통해 다양한 마우스 조직에서 추적할 수 있습니다. 예를 들어, 본 실험에서 보여주는 Candida에 감염된 수혜 C57BL/6 마우스의 혈액, 골수 및 신장에서 live CD45+ Ly6G+ CD11b+ 세포를 게이팅함으로써, 입양 전이된 CMTMR 라벨링 호중구를 수혜 마우스의 CMTMR 및 PE 음성인 기존 호중구와 PE 발현 여부를 통해 구별할 수 있습니다.

마우스 골수 중성구의 분리 및 표지법을 숙달하면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.