Name: 분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 쥐 골수에서 호중구를 분리하고 CellTracker 염료로 라벨링하는 방법을. 밀도 그래디언트 원심분리를 활용한 이 기법은 기능 연구와 입양 전송 실험에 활용할 수 있는 경제적이고 재현성 높은 접근법을 제공합니다.

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이 작품은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID), 국립 보건 연구소 (NIH), 미국의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 모든 마우스는 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)에서 실험 동물 관리 공인 동물 시설의 인증을위한 미국 협회에서 관리 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 설명 된 절차에 따라 보관 하였다 NIAID의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 후원하에.

1. 마우스 골수 세포의 분리 <ol><li> 기관의 동물 관리위원회의 승인 프로토콜을 사용하여 쥐를 안락사와 70 % 에탄올과 동물의 표면을 스프레이. </li><li> 중반 복부 피부의 절개를 확인하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함한 마우스의 말초 부분에서 피부를 제거합니다. </li><li> 가위를 사용하여 하반신의 근육을 잘라 대퇴골 머리를 깨고 피하면서 조심스럽게 고관절의 비구를 탈구. </li><li> 메스와 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아있는 근육을 제거하고 뼈 끝을 중단하지 않도록 무릎 관절 운동 치료의 경골에서 대퇴골을 분리합니다. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X를 포함하는 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 다음 단계를 진행합니다. neutrophi을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지하기 위해 추가 조치를 취L 활성화. </li><li> 뼈의 표면에서 에탄올을 씻어하는 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 세 이후의 세척 (배양 접시 내에서) 다음에 70 % 에탄올 (페트리 접시 이내) 각 뼈를 씻어. </li><li> 깨끗한 멸균 페트리 접시 안에, 뼈의 epiphyses을 차단하고 따로 보관하십시오. </li><li> 25 게이지 바늘과 RPMI 10 % FBS, 2 mM의 EDTA가 첨가 가득 12 CC 주사기를 사용하고, 100 μM가 장착 된 50 ML 나사 최고 팔콘 튜브에 뼈 샤프트의 양쪽 끝에서 골수 세포를 세척 필터링합니다. 효율적으로 모든 세포를 제거하기 위해 25 게이지 바늘을 사용하여 뼈의 안쪽 표면을 긁어. </li></ol> 참고 : 뼈의 창백은 세포가 충분히 긁어되었음을 나타냅니다. 참고 : 대퇴골 / 경골 쌍을 플러시 미디어의 약 10 ㎖를 사용합니다. 매체에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가하면 세포의 응집 방지하기 위해 필수적이다. <ol start="9"><li> 뼈 epiphyses 컷메스와 2.5 ML Eppendorf의 Combitip 플러스 Biopur 피펫 팁의 뒤쪽 끝 부분을 사용하여 100 μm의 필터를 통해 그들을 부수어 작은 0.5 mm 3 조각합니다. </li><li> 4 ℃에서 12 분간 1,400 rpm으로 원심 분리 </li><li> 약 20 초 동안 염화나트륨 0.2 % 20ml에 세포 펠렛을 현탁하여 적혈구를 용해는 1.6 % 염화나트륨 20 mL를 첨가하여. (중요 : 골수 세포 죽음을 피하기 위해 저장성 용해 20 ~ 30 초를 초과하지 마십시오 후자는 호중구를 활성화 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 용해에 대한 저장성 염화나트륨의 사용은 ACK lysing 버퍼에 좋습니다.). </li><li> 4에서 1,400 rpm으로 12 분 동안 원심 분리기 ° C 세포를 수집합니다. </li><li> 10 % FBS, 2 mM의 EDTA로 보충 RPMI 1640 1X와 세포를 씻고 단계 1.12에서와 같이 원심 분리기. </li><li> 이 방법을 사용하여 골수 세포의 수율은 약 60-80000000 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마​​우스의 기준입니다. </li></ol> 2. 호중구의 분리밀도 기울기 원심 분리하여 <ol><li> 골수 세포를 계산하고 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 1 ML에 resuspend을. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 Histopaque 1119 3 ㎖ (밀도 1.119 g / ㎖)를 추가합니다. </li><li> Histopaque 1119 3 ML에 Histopaque 1077의 오버레이 3 ML (밀도 1.077 g / ㎖). </li></ol> 참고 : Histopaque 1119 및 Histopaque 1077는 18-26로 예열해야 ° C 사용하기 전에. 중요한 단계 : 즉시 미리 그라디언트는 두 레이어와 최적 호중구 순결과 복구 사이에 확산 될 것 준비로 사용하기 전에 그라디언트를 준비합니다. 중요한 단계 : 오버레이하기 원심 분리하는 동안 세포 분리를 배제 할 두 가지 밀도, 혼합 방지하기 위해 천천히 수행 할 1119의 요구에 Histopaque 1077. <ol start="4"><li> Histopaque 1077의 상단에 골수 세포 현탁액을 오버레이. </li></ol> 중요한 단계 : Overl세포와 1077 Histopaque 사이의 인터페이스를 방해 방지하기 위해 천천히 수행 할 수 Histopaque 1077의 요구에 골수 세포 현탁액을 아잉. 참고 : PBS 1 ML에 감염되지 않은 쥐의 골수 세포를 현탁하여&gt; 90 %의 호중구 순도를 얻을 수 있습니다. 그러나 많은 골수 샘플을 풀링하여 호중구 순도를 떨어 뜨리고, 예를 들어, 3 ML PBS가 ~ 80 %&gt; 90 %에서 호중구의 순도를 줄일 수있는 300 X 10 6 세포를 현탁. 따라서 연구자들은 특정 실험에 이상적인 세포 수 / 볼륨 상태를 식별하는 파일럿 실험을 수행해야 <ol start="5"><li> 25 2,000 rpm에서 30 분 ° 브레이크없이 C를위한 원심 분리기. </li></ol> 참고 : 상온에서 기울기 원심 분리하여 호중구의 효과적인 분리를위한 중요하고 필수적이다. <ol start="6"><li> Histopaque 1119 인터페이스에서 호중구를 수집하고 1077 레이어를 Histopaque. </리&gt; <li> RPMI 두 번 수집 된 호중구를 씻어 1640 1X 10 % FBS, 4시 7 분을위한 1,400 rpm에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 원심 분리기 ° C.로 보충 </li><li> 호중구를 계산하고 자신의 생존을 결정합니다. </li></ol> 참고 : 호중구는 전형적으로&gt; FACS 분석에 의해 결정된 95 %의 생존과&gt; 90 % 순수. 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마우스의 골수에서 호중구의 전형적인 수익률 (즉, 2 대퇴골 2 경골 뼈) ~ 6-12000000 세포이다. 백혈구는 감염 동물의 골수에서 수확 할 때이 숫자는 상당히 큽니다. 칸디다 균에 감염된 생쥐 세포 수확 6에 사용되었을 때 따라서, ~ 30-40000000 호중구 / 마우스를 회수 하였다. 3. CellTracker 염료를 사용하여 호중구의 레이블 <ol><li> 5시에 호중구를 resuspend을 X 10 6 세포 / PBS에 ML 37에 prewarmed ° C. </li><li> 최종 concent에서 CellTracker 염료를 추가5 μM의 식량. </li></ol> 참고 : CellTracker 그린 (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein의 디아) 및 CellTracker 오렌지 (CMTMR (5 - (및-6)-4-클로로 벤조일 아미노 테트라 메틸)는 차동 야생형 유전자 결핍에서 호중구의 레이블이 프로토콜에서 사용 된 마우스. 참고 : 실험 당일까지 -80에서 10 CellTracker 녹색의 mm와 CellTracker 오렌지, 나누어지는 및 매장의 재고 솔루션 ° C를 준비합니다. <ol start="3"><li> 어둠 속에서 떨고 물 목욕 37 ° C에서 10 분에 해당하는 CellTracker 염료의 5 μM로 호중구를 품어. </li><li> 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X로 두 번 세포를 씻으십시오. </li></ol> 참고 : 세포의 효율적인 세정 CellTracker 염료와 라벨링 단계는 다운을 위해 차동 - 라벨 호중구 인구를 혼합하기 전에 염색 교차 오염을 방지하는 것이 필수적입니다 후tream 경쟁력을 다시 채우기 연구. 4. 마우스 및 유동 세포 계측법을 사용하여 전송 호중구의 분석에서 호중구의 입양 전송 <ol><li> 25 X 10 6 세포 / ㎖, 5 × 10 6 호중구는 마우스 당 전송되도록 측면 꼬리 정맥에 현탁액 200 μl를 주입 농도에 얼음처럼 차가운 PBS에서 호중구를 Resuspend. 경쟁력을 다시 채우기의 호중구 연구의 경우, 1:1의 비율로 야생형 유전자가 결핍 된 호중구를 혼합하고 상기와 같이 마우스 당 5 × 10 6 호중구의 총을 주입. </li></ol> 참고 : 적어도 최대 10 X 10 6 호중구가 adoptively 동물에 명백한 즉시 독성없이 마우스 당 전송할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 입양 전송 (예 : 1, 2, 3 또는 4 시간 후 전송)에 따라 서로 다른 시간에, 마우스 및 수확 혈액을 안락사 및 / 또는 그 골수 및 / 또는 기타 표적 장기 (들). </li><li> SI 준비게시 된 프로토콜 6,15를 사용하여 adoptively 전송 표시 호중구의 양적 및 질적 분석을 위해 이러한 조직에서 ngle 세포 현탁액. </li><li> 죽은 / 라이브 생존 염색 구단 봉쇄, CD45 (클론 30-F11)의 라벨 세포 Ly6G (복제 1A8)와 CD11b (복제 M1/70) 및 게이트 라이브 CD45 + Ly6G + CD11b + 호중구합니다. 다음 이 게이트 호중구 FITC + (CellTracker 녹색으로 표시하는 경우) 또는 PE + (셀 추적기 주황색으로 표시하는 경우)은 수신자 마우스의 기본 호중구뿐만 아니라 adoptively 전송 표시 호중구를 포함합니다. </li></ol> 참고 : 호중구 적어도 4 시간 후 전송 칸디다 균에 감염된 생쥐의 혈액, 골수 및 신장에서 추적 할 수 있습니다. 참고 : PBS의 2 % 파라 포름 알데히드로 고정 나쁜 CellTracker의 할머니로 표시된 호중구의 평균 형광 강도에 영향을 미치지 않습니다최소 48 시간 동안 een과 나 CellTracker 오렌지.

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 우리는 밀도 기울기 원심 분리 방식을 사용하여 고순도 생존과 생쥐의 골수에서 호중구의 큰 숫자의 절연을위한 신뢰성, 빠르고 간단하고 경제적 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜이 올바르게 수행 될 때, ~ 6-12 × 10 6 백혈구는 감염 마우스에서 복구 할 수 있으며, 많은 ~으로 30 ~ 40 × 10 6 백혈구는 감염 후 6 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 격리 된 호중구 80-95 % 순수와&gt; 95 % 가능한입니다. 골수 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 쥐 호중구를 얻기위한 적절한 저수지이다. 첫째, 이전에 두 구획의 세포가 유사한 산화 버스트와 탈과립 16 전시로 골수 호중구 쥐에서 혈액 호중구 기능적으로 유사하다는 것을 보였다. 둘째, 마우스 골수 호중구는 protr 살아 남기 위해 표시되었습니다문화 시간의 행동 기간이 상당히 오래 마우스 혈액 호중구 16에</s...

호중구는 인간의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 그들은 미생물 침입에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 타고난 면역 시스템과 법의 주요 세포 구성 요소입니다. 호중구 수 및 / 또는 기능에 영향을 인수 호중구 감소증 및 기본 면역 부전 환자 호스트 방어 1이 세포의 중요성을 강조 생명을 위협하는 침입 세균 및 곰팡이 감염을 개발할 수 있습니다. 염증 조직 2에 혈류에서 채용 호중구 수있는 화성 그라데이션을 생성 chemoattractants의 분비로 연결 조율 타고난 면역 반응의 유도에 자신의 동족 패턴 인식 수용체 결과에 감염 사이트에서 병원균 침입의 면역 인식 . 호중구는 감염 사이트를 입력 한 후, 그들은 활성화되고, 이는 사이토 카인과 케모카인 생산, 병원균의 이해에 이르게하고, 산화 비 산화 나를 통해 살해chanisms 3. 타고난 면역 자신의 잘 인식 역할 외에, 호중구는 최근 효과적인 적응 면역 반응 4 개시로 중요한 역할을 보여왔다. 5-7 감염 및 면역 질환의 다양한 같이 다른 한편으로는, 떨어져 면역 자신의 보호의 역할에서, 호중구는 또한 과도한 축적 및 / 또는 염증의 사이트에서 활성화로 인한 조직 손상과 면역 병리를 중재 할 수 있습니다. 설치 효과적인 타고난 면역 반응과 여러 전염성 질환 및 염증, 신뢰성 실험 프로토콜이 세포 부족을 취급와 기술적 인 문제에서의다면 발현 이펙터 기능이있는 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 지난 수십 년 동안 호중구와 연구를 방해하고있다. 따라서 호중구의 분리에 대한 재현성 분석의 사용은 호중구 매​​개 immunolo에 대한 추가 연구를 촉진해야한다gical 기능 전직 생체 내 및 생체있다. 지금까지 여러 가지 방법이 같은 인간의 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 및 마우스 혈액이나 골수 8,9, 마우스 혈액이나 골수 10,11에서 호중구의 긍정적이거나 부정적인 면역 자기 농축으로 호중구의 분리에 대해 설명하고, 수확 한 thioglycollate이나 다른 염증성 에이전트 12의 복강 내 주입 후 생쥐의 복강에서 호중구. 호중구는 쉽게 인간의 혈액에서 큰 숫자에서 격리 할 수 있지만,이 방법은 기능 연구 또는 입양 전송 실험 13 충분한 호중구의 분리를 배제 마우스 혈액의 제한된 볼륨에 의한 생쥐에 최적입니다. 의 수율 thioglycollat​​e가-이끌어하지만 또한 복강에서 세포가 쥐의 혈액에 비해 큰 경우 염증 복막 세척에서 호중구의 순도 사이에 차이가중가와 격리 된 호중구가 활성화 표현형을 나타냅니다. 따라서, 세포는 마우스 복강이 정상 상태 12에서 몇 가지 호중구가이 방법 만, 활성화의 기능 연구를 수행하는 데 사용하지만 자극받지 호중구 수 있습니다 사용하여 수집. 대신, 골수 그런 다음 식균 작용, 살인 및 탈과립, 또는받는 마우스로 입양 전송 등의 다운 스트림 기능을 연구에 사용할 수있는 하나 비자극 또는 활성화 된 호중구 11,14, 많은 수확을위한 편리한 저수지이다. 여기에 우리는 높은 수율을 제공하는 간단하고 빠른 (~ 2 시간) 프로토콜을 설명 (~ 6-12 × 10 6 호중구 / 감염 마우스 또는 최대 30-40 × 10 6 호중구 / 감염된 마우스) 순수 (80 -95 %), 골수에서&gt; 95 % 생존율과 호중구. 이 방법은 밀도 기울기 세포 분리되어 있습니다 시중 Histopaque를 사용Ficoll 나트륨 diatrizoate 구성된 배급 매체는, 마우스의 골수에서 백혈구를 분리합니다. 이 방법은 혈액이나 복막 캐비티에 비해 마우스 당 호중구의 상당히 큰 숫자를 얻을, 그것은 정상 상태에서 또는 감염 후 두 생쥐에서 호중구를 수집하는 데 사용, 그것은 불연속을 사용하는 밀도 기울기 원심 분리 방식에 비해 레이어에 쉽게 할 수 있습니다 55 % / 65 % / PBS 9의 75 % Percoll로 구성된 Percoll 기울기. 또한, 시간과 순수한 호중구를 수집하는 데 필요한 자원이 크게 형광 활성화 된 셀 정렬을 사용하여 호중구의 분리에 비해 감소된다. 또한,이 방법은 면역 자기 농축 단계를 포함하지 않기 때문에,보다 비용 효율적이며, 따라서 호중구 활성화의 가능성을 감소, 자기 열에 항체에 세포의 노출을 방지 할 수 있습니다. 고립 neutroph의 기능 연구를 수행하는 이외에ILS 생체 및받는 생쥐에 세포의 입양 전송이 프로토콜은 서로 다른 CellTracker 염료를 사용하여 격리 된 호중구의 레이블하는 방법을 설명합니다. 다양한 유전 적 배경 생쥐에서 호중구의 차이 라벨은 혈액에서 호중구의 인신 매매의 특정 유전자의 직접적인 역할에 대한 기계론의 통찰력을 제공 할 수있는 유동 세포 계측법을 사용하여받는 사람 쥐의 조직에서 전송 된 호중구를 추적하기위한 경쟁 재 증식 연구에 적용 할 수 있습니다 대상 염증 기관 6에.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (열 비활성화)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(페니실린 10,000 단위 / 10,000 mg/ml 연쇄상구균)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>품질 생물학 Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2% 및 1.6% 염화나트륨</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>증류수와 멸균 여과를 사용하여 염화나트륨 용액</td></tr><tr><td>멸균 여과된 Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077은 18-26°C로 가져와야 합니다. C 사용 전</td></tr><tr><td>멸균 여과 Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119는 18-26 &deg로 가져와야 합니다. 사용 전 C</td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘 없는 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>에틸 알코올 (200 proof)</td> <td>워너 그레이엄 컴퍼니</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>DMSO에서 10 mM의 원액을 만들고 분취 및 -80°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD45 (클론 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly6G (클론 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-마우스 Ly6G (클론 1A8)</td><td>BD 파밍겐</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11b (클론 M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>1:100 희석에서 사용</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 수정 가능한 블루 데드 셀 스테인 키트</td><td>분자 프로브</td><td>L-23105</td><td>1:1000 희석에서 사용</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 용액, PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td>에서 4%<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>표 1. 채택된 호중구의 분리, 라벨링 및 추적을 위한 시약.</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Materials</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 ml 혈청학 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml 혈청학 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5 ml 혈청학 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 ml 주사기</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25G x 5/8인치 바늘 (정밀 활공 바늘)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100mm 셀 스트레이너</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>살균 페트리 접시</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>쥐 해부 기구 (가위, 펜치, 메스)</td> <td>생물 의학 연구 기구</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>기구는 사용 전에 멸균 처리되었습니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &도; C 쉐이킹 워터 배스</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>표 2. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 장비 목록.</td></tr></tbody></table>

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

호중구는 타고난 면역 시스템의 중요한 효과기 세포입니다. 그들은 빠르게 급성 염증의 사이트에서 모집하고 염증 환경에 따라 보호 또는 병원성 효과를 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 다른 전염성 질환 및 염증성 조건에서 호중구의 &#39;음향과 immunopathogenic 효과를 중재하는 분자 요인의 면역 자세한 이해 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 아직도 부분적으로 때문에 그들의 짧은 반감기, 이들의 처리에 어려움, 부족한 세포 및 다운 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 호중구의 충분한 숫자를 얻기위한 신뢰성있는 실험 프로토콜의 부족. 따라서, 간단하고, 빠르고, 경제적이며 신뢰할 수있는 방법은 식균 작용, 살인, 시토 킨 생산, 탈과립 및 인신 매매 등의 기능을 평가하기위한 마우스 호중구 충분한 수의 수확에 매우 바람직하다. 이를 위해,우리는 높은 순도와 가능성과 생쥐의 골수에서 백혈구의 큰 숫자를 분리하는 어떤 실험실에서 적용 할 수있는 재생 밀도 기울기 원심 분리 기반의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 adoptively 유동 세포 계측법을 사용하여 적어도 4 시간 후 전송받는 생쥐에 옮겨와 여러 조직에서 추적 할 수있는 고립 된 호중구, 레이블 CellTracker 염료를 사용하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면 다른 CellTracker 염료와 야생형 유전자 결핍 생쥐에서 호중구의 차이 라벨이 성공적으로 생체 내 표적 조직에 혈액에서 호중구의 거래에서 특정 유전자의 직접적인 역할을 평가하기위한 경쟁력을 다시 채우기 연구를 수행하기 위해 고용 수 있습니다 .

이 프로토콜은 쥐의 골수 세포와 시중 Histopaque 세포 분리 매체를 사용하여 밀도 기울기 원심 분리하여 이들 세포에서 호중구의 연속적인 분리의 수확에 최적화되어 있습니다. 호중구는이 방법을 사용하는 것은 다운 스트림 기능 연구 전직 생체의 다양한 사람과받는 사람의 생쥐의 입양 전송 실험에 사용할 수입니다. 감염 8-12주 된 C57BL / 6 마​​우스 당 대퇴골과 경골 모두에서 골수 세포의 컬렉션의 전형적인 수율은 ~ 94~98%의 생존과 ~ 60-80000000 세포이다. 이러한 세포의 하류 밀도 기울기 원심 분리 Histopaque 밀도 분리 매체를 사용하여 일반적으로 감염 마우스 당 ~ 6-12000000 호중구를 얻을 수 있습니다. 호중구 80-95 % 순수하고&gt; 95 % 가능한, 등 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 확인. 그것은 밀도 전에 여러 동물에서 풀 골수 세포 수는 있지만기울기 원심 분리 단계 ...

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

이 절차의 전반적인 목적은 후속 기능 연구 및 입양 전이 실험을 위해 마우스 골수에서 호중구를 분리하고 표지하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 수집함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 0.2% 및 1.6% 염화나트륨 용액에 순차적으로 현탁하여 적혈구를 삼투압으로 용해합니다.다음으로, 밀도 구배 원심분리를 통해 호중구를 분리합니다. 마지막 단계에서 호중구를 세포 추적 염료로 표지합니다. 최종적으로 유세포 분석법을 사용하여 다양한 마우스 조직으로 이동한 입양 전이 호중구의 수를 결정할 수 있습니다.혈액이나 복강보다 골수에서 마우스 호중구를 분리할 때의 주요 장점은, 정상 상태와 감염 후 모두에서 후속 기능 연구 및 입양 전이 실험에 충분한 대량의 세포를 골수로부터 얻을 수 있다는 점입니다. 호중구 분리를 위해 면역 자기 선택법이나 형광 활성 세포 분류법 대신 밀도 구배 원심분리 기술을 사용하는 장점은 속도가 빠르고 경제적이며, 호중구 활성화를 유도할 수 있는 항체 표지를 피할 수 있다는 것입니다. 안락사시킨 마우스에 70% ethanol을 분사한 후, 저희 실험실의 테크니션인 muca swami가 해당 절차를 시연하겠습니다.동물의 복부 중앙 부위 피부를 절개한 다음, 하지(lower extremities)를 포함하여 동물의 원위부 피부 조직을 제거합니다. 다음으로, 가위를 사용하여 동물의 뒷다리 근육을 절단하고, 대퇴골두(head of the femur)가 파손되지 않도록 주의하며 고관절에서 ACE beum을 조심스럽게 탈구시킵니다. 그 후 가위와 메스를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아 있는 근육을 제거합니다.골단이 파손되지 않도록 주의하며 무릎 관절에서 다리뼈를 분리한 다음, 얼음처럼 차가운 RPMI 1 6 4 oh가 담긴 페트리 접시에 뼈를 넣습니다. FBS와 항생제를 첨가합니다. 접시를 조직 배양 후드로 옮긴 후, 새로운 페트리 접시에서 70% ethanol로 각 뼈의 외부를 멸균합니다.약 10~15초 후, 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 세 번 연속 세척하여 각 뼈 표면의 에탄올을 헹궈냅니다. 그런 다음 각 뼈의 골단(epiphysis)을 절단하여 새로운 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 10 mL의 RPMI가 채워진 12 cc 주사기에 25게이지 바늘을 장착합니다.FBS와 EDTA를 첨가합니다. 그런 다음, 각 대퇴골-경골 쌍의 골간 양끝에서 골수 세포를 100 µm

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

이 논문은 시험 관내 및 주사 후 마우스에서 유도 된 급성 백혈병 C1498 세포 배양을 특성화하는데 사용될 수있는 기술적 인 방법을 제공한다. 표현형 및 기능 분석은 유동 세포 계측법, 면역 형광 현미경, cytochemistry 월 - 그룬 왈드 김사 염색을 사용하여 수행됩니다.

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.

비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

배우세요 쥐 골수에서 호중구를 분리하고 CellTracker 염료로 라벨링하는 방법을. 밀도 그래디언트 원심분리를 활용한 이 기법은 기능 연구와 입양 전송 실험에 활용할 수 있는 경제적이고 재현성 높은 접근법을 제공합니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

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