유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 정보 프로브를 표적 G-단백질 결합 수용체(G-Protein coupled receptors)에 도입하여 신호 전달 복합체의 구조 및 동역학적 연구를 촉진하는 것입니다. 이는 비천연 아미노산인 zeto, phenylalanine 또는 zeto fee를 발현된 GPCR에 통합하는 데 필요한 번역 기작을 발현시키기 위해, 해당 플라스미드를 세포에 형질전환함으로써 달성됩니다. 이후 GPCR zeto fee 변이체는 수용체의 구조와 기능을 조사하기 위해 세 가지 서로 다른 방식으로 적용될 수 있습니다.

먼저, zeto fee는 GPCR에서 광활성 가교제로 사용되어 삼중수소 표지 리간드의 결합 부위 식별을 가능하게 합니다. 다음으로, zeto fee는 생체 직교 표지 화학을 통해 펩타이드 접합체나 형광 프로브를 GPCR에 부착하기 위한 반응성 화학 핸들로 사용될 수 있으며, 살아있는 세포 및 생화학적 방법을 기반으로 GPCR의 표적 광가교, 표적 에피토프 태깅 및 형광 표지에 분자 프로브 zeto fee를 사용한 결과가 얻어집니다. 광친화성 리간드 사용이나 시스테인 표지와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은, 표적 수용체의 알려진 위치에 생물학적으로 불활성이면서 반응성이 있는 비천연 아미노산 P zeto phenol alanine을 부위 특이적으로 도입할 수 있는 유연성입니다.

이 방법은 천연 막 환경에서 수용체 LIG 복합체의 상호작용 부위를 매핑하고, 생체 직교 표지에 적합한 A-G-P-C-R 내 위치를 식별함으로써 단일 분자 형광 연구를 용이하게 하는 등 GPCR 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 셋째, 이 방법은 G 단백질 결합 수용체의 분자적 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 다양한 세포 및 막 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 실험을 시작하기 전, HEC 2 9 3 T 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 KO's modified eagle medium에서 37 °C, 5% CO2 환경으로 배양하십시오.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 Lipectomy Plus 시약을 사용하여 10 cm 플레이트에서 60~80% 밀도로 배양된 세포에 G pcr, r CD, NA를 트랜스펙션합니다. 다음 날, 성장 배지를 10% FBS와 0.5 mM fee가 포함된 DMEM으로 교체합니다. 트랜스펙션 48시간 후, 텍스트에 기술된 대로 발현을 분석합니다.

이 비디오의 나머지 부분에서 설명하는 광촬영, 가교 또는 라벨링 절차를 진행하십시오. 형질전환 48시간 후, 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 4mL로 교체합니다. 세포가 플레이트에서 떨어져 나올 수 있도록 37°C에서 15분 동안 둡니다. 그 다음 1x PBS로 세포를 재부유하여 Falcon 튜브로 옮긴 후, 1500 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다.

세포를 펠릿화하려면 상층액을 흡입하여 제거한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비한 포화 결합 농도의 트리튬 표지 리간드가 포함된 1x Hanks buffered salt solution에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 수용체-리간드 복합체 형성을 보장하기 위해 펠릿을 37 °C에서 필요한 시간 동안 배양하며, 이 시간은 특정 수용체와 리간드에 따라 달라집니다. 그다음, 세포 현탁액을 24웰 또는 96웰 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 365 nm 파장의 자외선 램프를 사용하여 4 °C에서 15분 동안 zeto fee를 광활성화하며, 이때 시료의 가열 및 세포 용해를 방지하기 위해 플레이트를 얼음 위에 유지합니다. 광활성화 후, 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거하고 분석을 진행합니다.

세포 펠릿을 용해 버퍼(lysis buffer)에 재부유시키고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 세포 용해물을 16,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기기 전, 상층액에 1D4 단클론 항체로 변형된 SROs 2B 레진을 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 엔지니어링된 C-말단 1D4 단클론 항체 에피토프를 이용해 GPCR을 면역 정제합니다. 다음 날, 비드를 용해 버퍼로 여러 번 세척합니다. 37°C에서 1% SDS를 사용하여 1시간 동안 흔들어주며 샘플을 용출합니다.

EENT의 일부를 신틸레이션 액이 들어 있는 15 milliliter 바이알로 옮긴 후, 베타 신틸레이션 카운터로 측정하여 수용체에 대한 트리튬 표지 리간드의 특이적 결합량을 정량합니다. 남은 정제된 EENT는 표준 단백질 래더와 4~12% SDS 겔을 이용한 표준 겔 전기영동으로 분리합니다. 그런 다음 면역 블로팅을 위해 A-P-V-D-F 막으로 세미 드라이 전사합니다.

0.05% Tween 20이 포함된 TBS 버퍼 내의 5% milk로 PVDF 막을 블로킹합니다. 1D 단일클론 항체와 이어서 HRP가 결합된 anti-US IgG 2차 항체를 사용하여 막을 탐침함으로써 전체 길이 수용체 발현을 확인합니다. 그 후, 강화 화학발광 시약으로 막을 처리합니다.

밴드를 시각화하기 위해 멤브레인을 자동 방사선 사진 필름에 노출시킵니다. 그다음, 면도날로 멤브레인을 잘라 각 샘플 레인을 분리하고, 특정 분자량 마커 위치에서 절단합니다. 절단된 멤브레인 조각들을 신틸레이션 용액이 담긴 바이알로 옮긴 후, 베타 신틸레이션 카운터를 이용해 측정함으로써 각 멤브레인 조각에 포함된 tritium 양을 정량화합니다.

GPCR과 리간드의 합과 동일한 겉보기 분자량에서 트리튬(tritium)을 검출하여 양성 광교차결합을 확인합니다. 세포를 세척하고 계수한 후, 96-well high binding clear bottom plate의 웰당 100 µL의 10 µg/mL Poly-D-lysine으로 전처리하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 1X PBS로 반복 세척하고 공기 중에서 건조시킨 후, 형질전환된 세포를 웰당 60,000~80,000개의 밀도로 200 µL씩 96웰 플레이트에 분주하고 37 °C, 5% CO2 배양 조건으로 되돌립니다. 다음 날.

세포를 라벨링하기 위해 준비합니다. XPBS를 사용하여 웰당 100 µL씩 세 차례 부드럽게 세척하여 잔류 성장 배지를 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 50 내지 200 µM의 flag Tri AAL PHOSPHINE 라벨링 시약을 포함하는 버퍼를 준비합니다.

각 웰에 60 µL를 분주합니다. 라벨 처리와 버퍼를 처리하지 않은 웰 세트를 유지합니다. 또한 zeto feed GPCR 변이체와 비교하기 위해 야생형 GPCR 대조군을 포함합니다.

배양 후 30분에서 4시간 사이에 플레이트를 37 °C로 되돌립니다. 반응하지 않은 표지를 완전히 제거하기 위해 웰당 100 µL의 블로킹 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 다음으로, 상온에서 20분 동안 배양한 후 세포에 웰당 100 µL의 4% paraform aldehyde를 처리합니다.

블로킹 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 먼저 1차 항체를 얼음 위에서 1.5시간 동안 반응시켜 표지된 수용체 및 수용체 발현을 검출하는 표준 세포 표면 EISA 프로토콜을 수행합니다. 이어서 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시킵니다.

다음으로, flag peptide epitope를 검출하기 위해 희석된 Anti-Flag M two 항체 100 µL를 첨가합니다. Tri AAL phosphine labeling 시약도 사용합니다. 또한, 음성 대조군으로서 라벨 처리를 하지 않은 웰(well)도 함께 탐침합니다.

그런 다음, 야생형 또는 zeto fee GPCR 세포 표면 발현을 결정하기 위해 희석된 anti CCR five 2D seven 항체를 각각 다른 웰 세트에 추가합니다. 블로킹 버퍼로 세포를 3회 세척하고, 100 µL의 희석된 HRP 결합 anti-US IgG 항체와 함께 배양합니다.

블로킹 버퍼로 세포를 5회 주의 깊게 세척한 후, 검출 버퍼 50 µL를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로, 형광 멀티웰 플레이트 리더를 사용하여 들뜸 파장 530 nm 및 방출 파장 590 nm에서 스펙트럼 데이터를 수집합니다. 야생형 또는 zeto fee를 발현하는 수확된 세포 10 million 개를 용해시키는 것으로 라벨링 절차를 시작합니다.

4°C에서 1시간 동안 1mL의 가용화 버퍼에 Rod opsin을 반응시킵니다. 세포 용해물을 15,000 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집합니다. 그 후, 엔지니어링된 C-터미누스 1D4 에피토프를 사용하여 수용체를 캡처하기 위해 100µL의 1D4 단클론 항체 변형 spheros 2B 레진을 첨가합니다.

4°C에서 12시간 동안 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수지를 3회 세척합니다. 다음으로, 총 부피 0.3~0.5 mL가 되도록 0.1 mM fluorescein phosphine을 첨가하여 면역 친화성 매트릭스에 고정된 수용체를 표지하고, 상온에서 12시간 동안 배양한 후 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 반응하지 않은 표지물을 제거하기 위해 수지를 세척하고, Elian buffer 100 µL를 사용하여 얼음 위에서 1시간 동안 배양함으로써 표지된 수용체를 용출합니다.

환원 조건에서 SDS page를 통해 표지된 샘플을 분리합니다. zeto fee의 표지 전 겔을 PBS로 짧게 세척합니다. 488 nanometer 파장 레이저가 장착된 공초점 형광 스캐너를 사용하여 Ingel 형광법으로 GPCR을 분석함으로써 fluorescein으로 변형된 수용체를 검출합니다.

비천연 아미노산 돌연변이 유발 방법론과 앰버 코돈 억제 기술을 사용하여 A-G-P-C-R의 C 부위에 분자 프로브를 부위 특이적으로 도입하였습니다. 이후 광가교 기술을 사용하여 살아있는 세포 내 GPCR 리간드 복합체의 구조적 측면을 조사할 수 있으며, 방사성 표지된 삼중수소 소분자 리간드 Ravi Rock을 사용하여 G-P-C-R-C-C-R five 상의 결합 부위를 식별하였습니다.

본 예제에서는 tritiated RANTES와 함께 사전 배양된 zeto fee. CCR five 변이체를 발현하는 세포에 UV 조사를 수행합니다. 그 결과, 리간드의 민감한 방사성 표지를 사용하여 식별할 수 있는 공유 결합 가교 복합체가 생성됩니다.

CCR5의 여러 위치 중에서 테스트한 leucine 28 zero fee와 tryptophan 86 zero fee는 상당히 더 높은 신틸레이션 카운트로 나타난 바와 같이 트리튬 표지된 Ravi Rock에 광가교될 수 있었습니다. 야생형 수용체는 방사성 리간드에 대해 가교 반응을 보이지 않았습니다. 바이오 직교 라벨링 화학법을 사용하여 zero feed를 부위 특이적으로 수정할 수 있습니다.

GPCR 변이 분석 전략 중 하나는 펩타이드 접합 라벨인 flag 펩타이드를 사용하여 살아있는 세포 내의 A-G-P-C-R에 표적 에피토프 태깅을 수행하는 것입니다. Tri AAL PHOSPHINE 라벨링 시약을 사용하여 zeto fee를 특이적이고 선택적으로 수정합니다. 여기에 제시된 CCR five 변이는 flag 펩타이드가 태깅된 위치를 식별하기 위해 사용된 민감한 다단계 EISA 검출 전략의 대표 데이터입니다.

CCR5의 위치들 중에서 모든 zeto fee를 조사했습니다. CCR5 변이체들을 세포 표면에 발현시켰으며, 그 중 약 절반이 표적 에피토프 태깅을 성공적으로 거쳤습니다. 야생형 CCR5는 Anti-Flag 신호가 나타나지 않음으로써 에피토프 태깅에 대한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 대안적인 전략으로, 세제에 의해 가용화된 zeto feed G PCR들을 Spheros 2B 레진에 접합된 anti 1D four 단클론 항체와 같은 면역 친화성 매트릭스에 고정시킨 후, fluoro four 접합 라벨로 표지했습니다.

Ingel 형광 이미지는 예상대로 세 가지 서로 다른 위치에서 GPCR 옵신의 형광 표지가 성공적으로 이루어졌음을 보여주며, 야생형 옵신의 경우 수용체의 예상 분자량 위치에 형광 밴드가 나타나지 않아 배경 표지가 없음을 확인할 수 있었습니다. 이 절차를 수행할 때, 개발 후 특정 도입 산 AOL Alanine을 사용하여 표적 GPCR의 전체 렌즈 발현을 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 기술은 수용체 생물학 분야의 연구자들이 임의의 수용체-리간드 복합체를 탐구하거나 표적 수용체를 표지하는 길을 열어줄 것입니다. 반응성 프로브로서 부위 특이적으로 도입된 비천연 아미노산인 p-benzoyl-L-phenylalanine을 사용합니다. 이 영상을 시청한 후에는 표적 광가교 및 생체 직교 표지 기술을 이용하여 GPCR 신호 전달 복합체의 구조 및 동적 연구를 용이하게 하기 위해, 비천연 아미노산 합성법을 통해 GPCR에 분자 프로브를 도입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.