말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

이 실험 절차의 전반적인 목적은 후두 신경 손상 모델에서 후각 세포 및 초상 세포(sheathing cells)의 사용을 기반으로 한 세포 이식 모델을 제시하는 것입니다. 이를 위해 먼저 되돌이후두신경을 절단한 후 문합술을 시행합니다. 그다음, 후각 점막 또는 후각구에서 얻은 후각 세포와 초상 세포를 이식합니다.

그 후 수술 2~3개월 뒤에 후두경 검사와 근전도 검사를 통해 동물을 평가합니다. 마지막으로, 조직학적 연구를 위해 되돌이후두신경을 분리합니다. 결과적으로 후두경, 근전도 및 조직학적 측정을 통해 후각세포와 초상세포가 되돌이후두신경의 축삭 재생과 성대의 기능적 회복을 개선한다는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 축삭 성장 측정 및 회복 기능의 정량화 능력이 필요한 말초 신경 손상 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 반복적인 말초 신경 문합에 미세수술 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 GFP가 표지된 후구(OB) 및 후각 점막(OM)의 1차 배양물을 생성한 후, 모든 기구를 오토클레이브로 멸균하여 수술을 준비하십시오.

케타민과 클로르프로마진을 복강 내 주사하여 쥐를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 진정 수준을 확인합니다. 수술 부위를 제모하고 쥐를 등으로 누운 자세(dorsal decubitus)로 배치한 다음, 알코올과 베타딘 용액을 교대로 사용하여 피부를 소독합니다. 그 후 멸균 수술 환경을 조성하고 수술 전 과정 동안 멸균 절차를 유지합니다.

메스를 사용하여 내측 경부 피부를 2 cm 절개합니다. 다음으로 내측 백선을 따라, 설골하근 사이에 정형외과적 견인기를 배치한 후 설골하근을 수직으로 절개합니다. 후두를 노출시킨 다음 되돌이후두신경(RLN)을 노출시킵니다.

그런 다음 수술 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 제7 기관지륜 높이에서 신경을 완전히 절단하고, 11 T 봉합사로 한 지점을 고정합니다. 이식 직전에 후두의 신경을 차단하기 위해 문합술을 시행합니다. 배양 접시에서 OB 및 OM 세포를 제거하기 위해 0.05%trypsin EDTA를 사용합니다.

그 후, 세포를 432 G에서 5분 동안 원심분리한 다음, 따뜻한 배지 5 mL를 첨가하여 소화를 중단시킵니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 이 모델의 세포 농도를 조절합니다. 30 µL의 DMEM/F12가 담긴 마이크로 튜브에 1.2~6 × 10⁶ cells를 사용하였습니다. 세포와 성장 인자, reduced Matrigel을 1:2 비율로 준비하여 이식 직전에 얼음에 놓아둡니다.

튜브를 얼음에서 꺼내어 혼합물을 가온합니다. 피펫을 사용하여 세포 마트리젤(matrigel) 용액을 문합 부위에 도포하고, 혼합물이 굳으면서 손상된 신경 위에서 자가 조립되도록 합니다. 4-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 봉합합니다.

쥐를 개별 케이지에 넣고 24시간 동안 가열 램프 아래에 둡니다. 수술 약 2개월 후, 마취 후 5일 동안 진통제를 투여합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 진정 상태를 확인합니다.

30도 비디오 후두경을 삽입하기 전 쥐를 배측 와위로 놓습니다. 매 기록마다 동일한 시야를 재현할 수 있도록 후두가 가장 잘 보이는 위치로 후두경을 조절합니다. 후방 교합부, OID의 성대 돌기에 삽입되는 우측 성대, 그리고 OID의 성대 돌기에 삽입되는 좌측 성대와 같은 해부학적 지표를 확인합니다.

최대 외전과 최대 내전이 연속적으로 일어나는 세 가지 시퀀스를 선택하여 성대 움직임을 기록합니다. 후두 기능을 분석하기 위해 성대의 최대 외전과 최대 내전 움직임 사이의 차이를 측정하여 절대 각도 이동량을 결정합니다. 근전도 검사를 수행하기 위해 움직임 진폭을 측정하여 동적 점수를 결정하고, 연합 운동 및 역설적 움직임을 측정하여 기능적 점수를 결정합니다.

반회후두신경 문합술에서 보여준 것과 같이 후두와 기관을 노출시킨 후, 쥐의 햄스트링 근육에 전극을 배치합니다. 윤상갑상연골을 노출시킵니다. 그다음 마이크로 가위를 사용하여 윤상갑상연골을 절개하여 후윤상갑상근 또는 PCA 근육을 노출시킵니다.

동물을 자발 호흡 상태로 둔 채 단극 바늘 전극을 근육에 삽입합니다. 획득 시스템을 사용하여 PCA 근육의 전기적 근육 활동을 기록합니다. 다음 척도를 사용하여 0에서 3까지의 정성적 점수를 부여함으로써, 호흡과의 동기화 및 풍부함 측면에서 근육 활동을 분석합니다.

0은 흡기 동안 증가가 없는 시도되지 않은 추적을 의미합니다. 1은 흡기가 증가하는 리듬감 있는 추적을 의미하며, 2는 더 활발한 활동을 보이는 리듬감 있는 추적, 그리고 3은 매우 풍부한 리듬감 있는 추적을 의미합니다. 이는 최대 의도적 활동과 유사한 간섭 패턴을 형성합니다.

다음으로, RLN의 크기가 작아 손상될 위험이 있으므로 미주신경을 노출시킨 후, 전극을 부착하여 이 부위를 자극합니다. PCA 근육에서 잠복기와 전위 지속 시간을 기록합니다. 마지막으로, 현미경 하에서 펜토바르비탈 과량 투여로 동물을 안락사시킨 후, 문합부를 찾아 문합부와 후두 사이의 RLN 원위단 절단부를 봉합하여 제거합니다.

후각, 점막 및 후각구의 일차 배양 세포를 이식한 후, 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 조직학적 분석을 수행하십시오. 호흡 중 PCA 근육에서 얻은 EMG 파형의 예시입니다. 대조군 동물은 흡기 중에 증가하는 풍부한 전기 근육 활동을 보였으나, Rerated 군에서는 이러한 현상이 나타나지 않았습니다. 이 그림에서 toluidine blue 염색을 통한 RLN의 조직학적 분석은 정상, 재신경지배 및 이식된 동물의 전형적인 섬유 프로파일을 보여줍니다.

이 측정법을 통해 여기에서 보여주는 바와 같이 유수 신경 섬유의 수, 섬유의 평균 크기 및 수초의 평균 두께를 정량화할 수 있습니다. 조직학적 분석을 완료하기 위해, 좌골 신경 내 이식 후 GFP 양성 세포의 추적이 수행되었습니다.

RLN은 크기가 작아 신경 내 이식이 불가능하기 때문에 이 부위가 선택되었습니다. 되돌이후두신경의 수지접합술은 적절하게 발달된 후 올바르게 수행된다면 15분 이내에 완료될 수 있습니다. 이러한 기술들은 말초신경 손상 분야의 연구자들이 쥐 모델에서 세포 이식의 활용 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 재발성 신경 손상 모델에서 세포를 이식하는 방법과 전기근전도, 실험실 내시경 및 조직학적 측정을 통해 성대의 기능적 회복을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.