숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

이 절차의 전반적인 목표는 집락 형성 단위를 도금하지 않고 숙주 세포와 결합하여 병원성 효모를 정량화하는 것입니다. 먼저, 대식세포 세포를 H capsulation으로 감염시키거나 C albicans 효모 세포가 감염된 대식세포 세포를 aine orange 및 propidium iodide로 염색하여 생존 가능한 효모 세포를 강조합니다. 그런 다음 이미징 세포분석기를 사용하여 일련의 이미지를 캡처하고 크기 및 모양 매개변수를 분석하여 효모 세포를 정확하게 열거합니다.

이미지 세포 분석의 결과는 숙주 세포와 관련된 병원성 효모를 정량화하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다. 저는 병원성 진균 히스토플라스마 캡슐의 정량화를 위해 콜로니 형성 단위를 반복적으로 플레이트화하고 계수해야 하는 진균 발병 기전 분야에서 연구를 할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. CFU 열거의 표준 방법에 비해 이미지 세포 분석의 주요 장점은 숙주 세포 내에서 야생형 및 돌연변이 균주의 성장을 비교할 때 CFU의 여러 연속 희석을 도금, 배양 및 계수하는 노동과 시간 집약적인 단계를 제거하므로 속도가 빨라진다는 것입니다.

이 방법은 고체 매체에서 품질 성장을 시작하기 위한 다양한 능력으로 인해 발생하는 잠재적 편향을 제거합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이미지 세포 분석에 어려움을 겪을 수 있습니다. 계측 및 소프트웨어.

원하는 밀도로 대식세포를 배양하여 절차를 시작합니다. 24개의 웰 플레이트에 로그 상 성장의 곰팡이 세포를 추가한 다음 90분 동안 배양하여 식세포작용을 허용합니다. 다음으로, PBS로 대식세포를 세 번 세척하여 감염 다중도가 낮을 때 샘플 분석 전에 실험적으로 정의된 시점 동안 세포외 곰팡이 배양물을 제거하고, 감염된 대식세포 세포는 며칠 동안 생존 상태를 유지하며, 약 12-24시간마다 샘플을 분석할 수 있습니다.

PBS로 3회 세척한 후 감염된 대식세포 세포에 0.5ml의 멸균수를 첨가합니다. 대식세포 세포에서 곰팡이를 방출하기 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 용해물을 멸균 튜브에 넣고 얼음에 보관하십시오.

20 마이크로 리터의 용해물을 별도의 튜브로 옮깁니다. 즉각적인 이미지 세포 분석을 위해 20마이크로리터 aine orange propidium iodide 용액을 추가합니다. 배지에서 용해물을 10배 희석합니다.

그런 다음 각 희석액 100마이크로리터를 복제하여 플레이트합니다. HMM aros 플레이트에. 섭씨 37도의 가습실에서 5%의 이산화탄소를 함유한 상태에서 7-8일 동안 플레이트를 배양합니다.

플레이트의 콜로니를 수동으로 계산하여 최소 100개에서 최대 1000개의 개별 콜로니를 표시합니다. 살아있는 대식세포를 수집하려면 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 그런 다음 0.5ml의 PBS를 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

부드러운 피펫팅으로 조직 배양 웰에서 대식세포를 제거합니다. 액체를 멸균 튜브에 옮기고 얼음에 보관하십시오. 가속도계 기기를 설정하려면 형광 광학 모듈을 시스템에 삽입하고 제자리에 고정되어 있는지 확인합니다.

소프트웨어의 assay 드롭다운 메뉴에서 이미지 유세포 분석기를 켭니다. 생존력을 위해 사전 설정된 분석 유형과 세포 유형을 선택합니다. 이 분석은 칸디다 알비칸스 감염 검출을 위한 aine orange 및 propidium iodide 검출에 최적화되어 있습니다.

이 분석은 GFP 검출에 최적화되어 있습니다. 이제 옵션 탭을 열고 배경 이미지 촬영을 클릭합니다.작업이 완료된 후 A OPI 생존력 측정을 위한 명시야 이미지 미리보기를 클릭합니다. 20마이크로리터의 샘플과 20마이크로리터의 A OPI 및 피펫을 칸디다 알비칸스 감염률에 대한 회계 챔버에 혼합합니다.

샘플을 잘 혼합하고 계수 챔버에 직접 피펫팅합니다. 세포가 챔버에 정착한 후 이미지 획득을 위해 계수 챔버를 이미지 세포분석기에 삽입합니다. 샘플에 초점을 맞춘 다음 count를 클릭합니다.

이미지 획득 작업이 완료되면 일회용 계수 챔버를 제거하고 적절하게 폐기하십시오. OPI 측정의 경우 농도 및 생존력 결과가 계수 결과 페이지에 표시되어 칸디다 알비칸스 감염률을 확인합니다. 계산 결과를 얻은 후 내보내기를 클릭합니다.

그런 다음 GFP의 세포 집단 분석을 위해 데이터를 FCS express four로 보냅니다. FCS express에서 데이터 파일을 가져오고 결과를 형광 히스토그램으로 플롯합니다. 다음으로, 히스토그램에 세포 집단 게이트를 적용하여 칸디다 알비칸스에 감염된 세포의 집단 비율을 결정합니다.

이 실험은 정의된 시점에서 hcaps Lotum 효모에 감염된 대식세포 세포의 성장을 모니터링합니다. 샘플은 이미지 기반 세포 분석으로 염색 및 분석됩니다. 레이스(laced) 대식세포에서 해방된 효모 세포는 Soter 비전 소프트웨어에 의해 식별됩니다.

여기서 검출된 살아있는 효균의 절대 수는 고체 배지에서 군체를 형성할 수 있는 효모보다 많습니다. 이러한 데이터는 상당한 수의 생존 가능하지만 배양 불가능한 세포의 존재를 강조합니다. 이들 골수 유래 대식세포는 A DH one 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질을 발현하는 C 알비칸 효모 세포에 감염되었다.

0.1에서 10에 이르는 감염의 다중성은 감염된 대식세포 내에서 GFP 강도의 점진적 증가를 초래했으며, 감염된 대식세포의 총 비율은 한 번 마스터되었습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 샘플당 단 몇 분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 숙주 세포가 아닌 곰팡이 세포만 계산되도록 매개변수를 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 이미지 세포 분석을 사용하여 숙주 세포와 관련된 병원성 효모를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 곰팡이와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 생물학적 위험 폐기물 처리 절차를 따르십시오.