Name: 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 이미지 계측법을 사용하여 숙주 세포 내 병원성 효모를 정량화하는 방법을. 이 기술은 전통적인 CFU 계수법보다 빠르고 효율적이며 진균 병원성 연구에 활용됩니다.

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1. H.와 대 식세포의 감염 capsulatum, C. albicans에 <ol><li> 감염 이전에 16 시간, 24 잘 접시에 원하는 농도에 씨앗 식세포. 이 프로토콜에서는 잘 3.0 × 10 5 세포의 밀도가 /을 사용 하였다. </li><li> 감염 원하는 다중성 (MOI)에서 로그 위상 성장 곰팡이 세포를 추가합니다. 이 프로토콜은 MOI의 범위 (- 5.0 0.2)을 수용 할 수 있습니다. H.와 RAW264.7 대식 세포의 감염 capsulatum, 우리는 MOI 0.2을 사용했다. </li><li> 1.5 시간 식균 작용을 허용하는 다음, 세포 곰팡이를 제거하는 PBS와 대식 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 시료 분석 이전 시간에 원하는 번호를 품어. (우리의 실험 0.2) MOI 저에 감염된 대식 세포는 며칠 동안 가능한 남아 있고, 샘플마다 약 12​​ ~ 24 시간을 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 대식 세포 용해 <ol><li> 대식 세포에서 곰팡이를 해방하려면, 미디어를 제거 PBS로 3 회 세척하고,0.5 ML 멸균 물을 추가합니다. 이러한 조건에서, 대식 세포 용해하고 곰팡이 세포는 그대로 유지됩니다. </li><li> 상온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 얼음에 보관, 멸균 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 별도의 튜브에 20 ㎕의 해물을 전송 한 후 20 μL AO / PI 솔루션을 추가합니다. &quot;샘플 준비 이미지 유세포 분석을위한&quot;5 단계로 진행 </li></ol> 3. CFU 도금 <ol><li> 미디어 해물의 10 배 희석 (단계 2.3) 수행합니다. </li><li> 각 희석 플레이트 (100) μL는 HMM-아가 플레이트에 복제합니다. 7-8일에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 챔버에서 번호판을 품어. </li><li> 수동으로 최소 100 1,000 별개의 식민지의 최대 표시 판에 식민지를 계산합니다. </li></ol> 4. 라이브 식세포 내 균류의 시각화 <ol><li> 라이브 식세포를 수집하려면, PBS로 세포를 3 회 세척한다. 4시 30 분 0.5 ML PBS과 부화를 추가 ° C.</li><li> 조직 문화 우물에서 대 식세포를 제거하려면 부드럽게 여러 번 위아래로 피펫. 얼음에 보관, 멸균 튜브에 액체를 전송합니다. </li><li> 별도의 튜브에 20 ㎕의 샘플을 전송 후, 20 μL AO / PI 솔루션을 추가합니다. &quot;이미지 유세포 분석을위한 샘플 준비&quot;5 단계로 진행합니다. </li></ol> 5. 이미지 유세포 분석을위한 시료 준비 <ol><li> 철저하게 대상 시료를 피펫하고 일회용 세포 계수 챔버에 시료 20 μl를 전송합니다. </li><li> 세포가 30 초 동안 챔버에 정착하도록 허용합니다. </li><li> 이미지 cytometer에에 실을 계산 삽입합니다. </li></ol> 6. Cellometer 장비 설정 <ol><li> 시스템에 VB-535-402 및 VB-660-502 그리고 그들은 제자리에 고정되어 있는지 확인하십시오 : 형광 광학 모듈을 삽입합니다. <ol><li> VB-535-402은 (475 nm의 여기, 535 nm에서 방출) 아 크리 딘 오렌지와 GFP 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> VB-660-502 (excitati540 nm에서 660 nm의 방출은)의 propidium 요오드 검출에 사용됩니다. </li></ol></li><li> 이미지 cytometer에 전원을 켜고 함께 제공되는 소프트웨어를 엽니 다. </li></ol> 7. Cellometer 소프트웨어 설치 <ol><li> 사전 &quot;분석 유형&quot;및 분석 드롭 다운 메뉴에서 &quot;셀 유형&quot;을 선택합니다. <ol><li> 생존을 위해, 분석은 크리 딘 오렌지와의 propidium 요오드 검출에 최적화되어 있습니다. </li><li> 칸디다 감염의 탐지를 위해, 분석은 GFP 감지에 최적화되어 있습니다. </li></ol></li><li> 상단의 &quot;옵​​션&quot;을 선택하고 &quot;테이크 배경 이미지&quot;를 클릭하고 작업을 완료 할 수 있습니다. </li><li> &quot;미리 시야 이미지&quot;를 클릭하십시오. </li></ol> 8. 이미지 수집 절차 <ol><li> 이미지 cytometer에로 준비된 샘플 챔버를 삽입합니다. </li><li> 초점 노브를 사용하여 초점을 조정합니다. </li><li> 일단 초점 &quot;조사&quot;를 클릭하고 이미지 수집 작업을 완료 할 수 있습니다. </li><li> 레모일회용 계산 챔버를 쉬게하고 적절하게 폐기하십시오. </li></ol> 9. 이미지 데이터 분석 <ol><li> 농도와 생존 능력 측정 <ol><li> 계산이 완료되면, 대상 세포의 농도와 생존은 결과 페이지에 표시됩니다. </li><li> 칸디다 감염 실험에서 GFP의 세포 인구 분석을위한 FCS 익스프레스 4로 데이터를 내보내려면 &quot;내보내기&quot;를 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 칸디다 감염 세포의 FCS 인 분석 <ol><li> FCS 인 4 줄거리 형광 히스토그램의 결과로. &quot;NXDAT&quot;파일을 가져옵니다. </li><li> 칸디다 감염 세포의 인구 비율을 결정하는 히스토그램 세포 인구 게이트를 적용합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
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<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

저자 레오 리튬 잉 찬과 벤자민 파라는 Nexcelom 생명 LLC의 직원입니다.

이미지 세포 계측법은 사용자가 고품질 이미지를 캡처 전문 소프트웨어를 사용하여 세포의 빠른 정량화를 수행 할 수 있습니다. 미생물 병인의 분야에있는 이미지 세포 계측법의 채택에 하나의 잠재적 인 문제는 계산되는 미생물 포유류 숙주 세포를 포함한 세포의 혼합 인구에 존재하는 것입니다. 여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 체외 대식 세포 감염시 가능한 병원성 효모의 정량화를 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법론은 체외 대식 세포 감염 시험 법의 동안 관찰 곰팡이의 성장과 생존에 충실 recapitulates 동향뿐만 아니라, 기존의 CFU 분석 13에 비해 향상된 감도를 표시뿐만 아니라. 효모 세포의 정량화 CFU 열거 나 유동 세포 계측법 하나와 비교할 때 이미지 세포 계측법은 몇 가지 실질적인 이점을 제공합니다. CFUs을 도금 할 때, 실험실 노동자 플레이트 여러 dilut...

자신의 호스트 및 / 또는 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 연구는 종종 시간 과정을 통해 또는 다른 감염 조건 하에서 가능한 진균 세포의 정량화가 필요합니다. 집락 열거 형 (CFU)이 가능한 진균 세포의 수를 측정 한하는 표준 방법입니다, 그러나,이 방법은 몇 가지 단점과 한계가있다. 첫째, 많은 곰팡이 종은 천천히 성장하고있다. 고체 매체에 표시 식민지의 성장은 크게 연구의 속도를 둔화, 1-3 주 소요될 수 있습니다. 여러 희석은 식민지의 셀 수있는 숫자를 보장하기 위해 도금해야하기 때문에 둘째, CFU 도금 동안 시료의 조작은, 힘든 과정입니다. 도금 효율은 물론 100 % 이하이기 때문에 셋째, CFU의 수는 도금 가능한 유기체의 수보다 일반적으로 낮다. 예를 들어, 동종 이형의 진균 병원체 Histoplasma capsulatum에 대한 도금 효율은 90 %로 높은 수 있지만, 같은 일상적으로 낮은 수30 %는 관련 곰팡이 dimorph의 Paracoccidioides의의 brasiliensis 1, 2 (10 %)도 낮다. 칸디다 albicans에 대한 도금 효율도 변화 3에 따라 달라질 수 있습니다. 많은 경우에, 그것은 죽은 및 / 또는 대사 비활성 셀의 존재와 농도를 결정하는 것이 유용 할 것이다 반면 마지막으로, CFU 분석은 고체 매체에 성장을 수립 할 수있는 유일한 라이브 적극적으로 나누어 세포를 차지하고 있습니다. 이전에 여러 가지 병원성 진균의 정량화를위한 ​​유세포 방법은 4-6에 설명되어 있습니다. 그러나 공유 흐름 cytometers에 바이오 안전성 수준 2 (BSL2) 또는 BSL3 수준의 병원체를 사용하여 관련 바이오 안전성 봉쇄 문제로 인해,이 기술의 채택이 제한되었습니다. 유동 세포 계측법 마찬가지로, 이미지 세포 계측법 세포 정량의 민감하고 빠른 방법입니다. 그러나 이미지 세포 계측법은 비교 결과 7 적은 비용으로 수행 할 수 있습니다 -11. 여기, 우리는 호스트 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 이미지 세포 계측법을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 사람의 곰팡이 병원균을 사용하여 우리의 방법을 보여줍니다 Histoplasma capsulatum 및 칸디다 균 albicans를 H.. capsulatum는 호흡기 질환을 일으키는 동종 이형의 진균 병원체, 인간, 그것은 같은 신진 효모 성장하고 폐포 대 식세포 내에서 복제 칸디다 때때로 칸디다증을 일으키는 인간의 공생 종입니다.. 우리는 이미지 세포 계측법 시각화 기능과 함께,이 효모의 빠른 정량화 할 수 있는지 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI 솔루션</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>일회용 계수 챔버</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

이러한 칸디다 알비 칸스, Histoplasma capsulatum, 그리고 크립토 neoformans를 같은 병원성 효모의 세포 발병 메커니즘의 연구는 일반적으로 단위 분석이나 유동 세포 계측법을 형성 식민지을 사용하여 효모 정량 뒤에 포유류의 호스트 또는 호스트 세포 (즉, 대 식세포)의 감염을 사용합니다. 콜로니 형성 단위 열거 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 방법 왔지만,이 기술은 성장을 비교할 때 특별한 관심입니다 고체 미디어 및 저 및 / 또는 변수 도금 효율에 약간의 곰팡이 종의 성장 둔화 등 단점과 한계를 가지고 야생형과 돌연변이 균주. 유동 세포 계측법 효모의 생존에 대한 신속한 정량 정보를 제공 할 수 있습니다, 그러나, 병원성 효모에 대한 유세포 검출 채택 높은 비용과 바이오 안전성 고려 등 실제적인 이유로 제한되었습니다. 여기에서, 우리는 이미지 기반을 보여대식 세포와 공동 배양 가능한 병원성 효모의 정량 Cellometer 비전 (생명 Nexcelom, LLC)를 사용하여 유세포 방법. Histoplasma capsulatum과 칸디다 H. :. 우리의 연구는 두 가지 인간의 곰팡이 병원균의 검출에 초점을 capsulatum는 대식 세포 phagosome에 내 복제하여 폐포 대 식세포를 정착, 그리고 여기, 우리는 양적 H.의 성장을 평가 이미지 세포 계측법과 함께 크리 딘 오렌지 /의 propidium 요오드 염색을 사용하여 RAW 264.7 대 식세포에서 capsulatum 효모. 우리의 방법 충실 단위 열거 형을 형성하는 전통적인 식민지로 측정 recapitulates 성장 동향,하지만 크게 증가 감도. 또한, 우리가 직접 C.의 GFP 발현 균주 라이브 대식 세포의 감염을 평가 알비 칸스. 우리의 방법론은 협회의 재치있는 중요한 인간의 곰팡이 병원균의 검출 및 정량화, 신속 정확하고 경제적 인 방법을 제공합니다H 호스트 세포.

우리는 H.의 성장을 모니터링하는 Cellometer 비전 이미지 cytometer에 사용 대식 세포 capsulatum. RAW 264.7 세포는 H. 감염된 다양한 시간 지점에서 capsulatum 효모 세포는 샘플 이미지 기반의 유세포 분석에 의해 다음 AO / PI 염색을 실시 하였다. 병렬로, 샘플은 기존 CFU 열거 형으로 분석 하였다. 각 시점에서 시료는 대식 세포를 용해 물에 배양하였으며, 해방 효모 세포는 Cellometer 비전 소프트웨어 (도표 1A와 1B)에 의해 확인되었다. 각 시점 (그림 1C)에서 이미지 기반의 유세포 분석 및 CFU 열거 형에 의해 발견으로 우리는 가능한 효모의 농도에서 매우 유사한 경향을 관찰합니다. 예상대로, AO / PI 염색에 의해 감지 살아있는 효모의 절대 값 기호를 강조 CFU 분석에 의해 평가로 고체 배지에서 집락 형성 할 수있는 효모의 수보다 지...

여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

이 절차의 전반적인 목표는 콜로니 형성 단위(CFU)를 도말하지 않고 호스트 세포와 연관된 병원성 효모를 정량화하는 것입니다. 먼저, 대식세포에 H capsulation 또는 C albicans 효모 세포를 감염시킨 후, 감염된 대식세포를 acridine orange와 propidium iodide로 염색하여 살아있는 효모 세포를 시각화합니다. 그런 다음 이미징 사이토미터를 사용하여 일련의 이미지를 캡처하고, 크기와 모양 파라미터를 분석하여 효모 세포의 수를 정확하게 산출합니다.이미지 사이토메트리(image cytometry) 결과는 숙주 세포와 연관된 병원성 효모의 양을 정량화하는 데 효과적으로 사용될 수 있습니다. 저는 진균 병원성 분야의 연구를 수행하던 중, 병원성 진균인 Histoplasma capsule의 정량화를 위해 반복적으로 평판 도말을 하고 집락 형성 단위(colony forming units)를 계산해야 했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. CFU 계수라는 표준 방법에 비해 이미지 사이토메트리가 갖는 주요 장점은, 숙주 세포 내에서 야생형 및 돌연변이 균주의 성장을 비교할 때 CFU의 다단계 연속 희석액을 도말, 배양 및 계수하는 노동 및 시간 집약적인 단계들을 제거함으로써 속도를 높일 수 있다는 점입니다.이 방법은 고체 배지에서 양질의 성장을 유도하는 능력의 차이로 인해 발생할 수 있는 잠재적 편향을 제거합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 이미지 사이토메트리 장비 및 소프트웨어 사용에 어려움을 겪을 수 있습니다.원하는 밀도로 대식세포를 배양하여 절차를 시작합니다. 24-well 플레이트에 로그 성장기(log phase growth)의 진균 세포를 첨가한 후, 식세포 작용이 일어날 수 있도록 90분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포 외 진균을 제거하기 위해 PBS로 대식세포를 3회 세척하고, 시료 분석 전 실험적으로 정의된 시간 동안 배양합니다. 낮은 감염 다중도(multiplicity of infection)에서는 감염된 대식세포가 수일 동안 생존하므로, 약 12~24시간마다 시료를 분석할 수 있습니다.PBS로 3회 세척한 후, 감염된 대식세포에 멸균수 0.5 milliliters를 첨가합니다. 대식세포로부터 진균을 분리하기 위해 상온에서 5분간 배양합니다. 그 다음 용해물을 멸균 튜브에 수집하여 얼음 위에 보관합니다.용해물 20 µL를 별도의 튜브로 옮깁니다. 즉각적인 이미지 세포 분석(image cytometric analysis)을 위해 아쿠아-오렌지 프로피디움 요오드화물(acridine orange propidium iodide) 용액 20 µL를 첨가합니다. 배지 내에서 용해물을 10배 희석합니다.그런 다음, 각 희석액 100 µL를 HMM aros 플레이트에 두 번씩 분주합니다. 플레이트를 5% CO2가 포함된 습윤 챔버에서 37 °C로 7~8일 동안 배양합니다.플레이트에서 100개 이상 1000개 이하의 뚜렷한 콜로니가 나타나는 것을 확인하여 수동으로 콜로니 수를 측정합니다. 살아있는 대식세포를 수집하기 위해, PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그 후 PBS 0.5 milliliters를 첨가하고 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.부드럽게 피펫팅하여 조직 배양 웰에서 대식세포를 제거합니다. 액체를 멸균 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관합니다. 가속도계 장치를 설정하려면 형광 광학 모듈을 시스템에 삽입하고 제대로 고정되었는지 확인합니다.소프트웨어의 분석 드롭다운 메뉴에서 이미지 사이토미터를 켭니다. 생존율(viability)에 대해 미리 설정된 분석 유형과 세포 유형을 선택하십시오. 이 분석은 Candida albicans 감염 검출을 위해 아크리딘 오렌지(acridine orange) 및 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 검출에 최적화되어 있습니다.본 분석법은 GFP 검출에 최적화되어 있습니다. 이제 옵션 탭을 열고 배경 이미지 촬영(take background image)을 클릭하십시오. 작업이 완료되면 A OPI 생존율 측정을 위해 명시야 이미지 미리보기(preview brightfield image)를 클릭하십시오. 샘플 20 µL와 A OPI 20 µL를 혼합한 후, Candida albicans 감염률 확인을 위해 계수 챔버에 피펫으로 분주하십시오.시료를 잘 섞은 후 카운팅 챔버에 직접 피펫팅합니다. 세포가 챔버 내에 가라앉으면, 이미지 획득을 위해 카운팅 챔버를 이미지 사이토미터에 삽입합니다. 시료의 초점을 맞춘 다음, count를 클릭합니다.이미지 획득 작업이 완료되면 일회용 카운팅 챔버를 제거하고 적절하게 폐기하십시오. A OPI 측정의 경우, candida albicans 감염률을 결정하기 위해 농도 및 생존율 결과가 카운팅 결과 페이지에 표시됩니다. 카운팅 결과를 얻은 후 내보내기를 클릭하십시오.그런 다음 GFP의 세포군 분석을 위해 데이터를 FCS express 4로 전송합니다. FCS express에서 데이터 파일을 가져와 결과를 형광 히스토그램으로 도식화합니다. 다음으로, 히스토그램에 세포군 게이트를 적용하여 candida albicans 감염 세포의 군집 백분율을 결정합니다.본 실험에서는 특정 시점에서 hcaps Lotum 효모에 감염된 대식세포의 성장을 모니터링합니다. 샘플을 염색한 후 이미지 기반 유세포 분석기로 분석합니다. 감염된 대식세포로부터 방출된 효모 세포는 Soter vision 소프트웨어를 통해 식별합니다.여기서 검출된 살아있는 효모의 절대 수는 고체 배지에서 콜로니를 형성할 수 있는 효모보다 더 많습니다. 이러한 데이터는 생존해 있으나 배양 불가능한 세포가 상당수 존재함을 강조합니다. 이 골수 유래 대식세포는 A DH one 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질을 발현하는 C albican 효모 세포로 감염되었습니다.0.1에서 10 범위의 감염 다중도(Multiplicities of infection)에 따라 감염된 대식세포 내 GFP 강도와 감염된 대식세포의 총 백분율이 점진적으로 증가했습니다. 숙련된 후에는 이 기법을 적절히 수행할 경우 샘플당 단 몇 분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 숙주 세포가 아닌 진균 세포만 계수되도록 파라미터를 설정하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청하신 후에는 이미지 사이토메트리를 사용하여 숙주 세포와 연관된 병원성 효모를 정량화하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 병원성 진균을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 반드시 개인 보호 장구를 착용하고 적절한 생물학적 위험 폐기물 처리 절차를 준수하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

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숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

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