Name: 크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 생쥐 뇌에 바이러스 벡터를 정위 미세 주입하여 특정 유전자를 선택적으로 제거하는 방법입니다. 이 기법은 조건된 장소 선호 패러다임의 획득, 소멸, 재활성화 단계에서 유전자의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 확장 에어컨 장소 기본 프로토콜을 확립 그들의 도움을 ANNI 리와 모린 이른에게 감사의 말씀을 전합니다.

모든 절차는 웨일 코넬 의과 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 규칙에 따라 진행됩니다. 1. 준비 및 바이러스 성 벡터의 정위 납품 설치 <ol><li> 장비, 멸균 면봉, 또는 멸균 장갑을 착용 손 비 멸균 표면과 접촉에 의해 오염되는 경우 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 기기를 폐기하거나 다시 소독 면봉을 삭제하거나 새로운 멸균 장갑을 변경합니다. </li><li> 수술 후 회복을 따뜻하게 열 블록 침구 마우스 케이지를 놓습니다. </li><li> 두피를 소독 머리와 에탄올과 요오드를 면도 전기 면도기를 설정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 귀 바, stereotax의 입 홀드를 닦아냅니다. </li><li> 5 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 바이러스 벡터 (1 X 10 6 바이러스 입자 / μL)의 5 μl를 수립하고 stereotax에 주사기 홀더에 설정합니다. </li><li> 마이크로파 가열 패드 나에 전기 패드를 켜stereotax에 차 장소. 화상의 위험을 줄이기 위해 깨끗한 흡수성 패드로 커버. 마우스 모니터 체온 (97-99.5 ° F 사이) 자주 절차를 걸쳐. </li><li> 케타민 (100 mg / kg)과 xylazine (20 MG / kg)의 혼합물로 마우스를 (22-35g 사이의 무게) 주입. 마우스가 마취되면, 핀치 꼬리 끝은 마우스의 반사를 확인하고 마우스가 적절하게 마취 있는지 확인하기 위해 어떤 움직임이나 반응에 유의한다. </li><li> 눈과 귀 사이의 머리를 면도. </li><li> 에탄올과 요오드 살균면 도포를 번갈아 면도 헤드를 청소합니다. </li><li> stereotax에 가열 패드에 마우스를 전송합니다. </li></ol> 2. 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입 <ol><li> 수술을 통해 멸균 장갑을 착용 할 것. 장갑은 비 멸균 표면을 만져 어느 시점에서 오염 된 경우 장갑을 변경합니다. </li><li> 제로 치아 바, 귀 막대 저울. </li><li> 치아 줄에 이빨을 설정합니다. </li><li> 총구에 고정합니다. 방도를 강구 또는 수염 이동하는 경우MENT 언제든지 지적이다, 케타민 (100 mg / kg)과 xylazine (20 MG / kg)의 혼합물 IP 부스터 선량 (~ 0.05 cc) 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 귀 막대에 고정합니다. </li><li> PuraLube로 눈을 윤활. </li><li> 바로 메스 귀 뒤에 열린 두피를 잘라. </li><li> 피부 껍질 떨어져 두개골에서의 두피의 모서리에 장소 불독 클립. 브레 그마 및 람다 쉽게 볼 수 있어야합니다. </li><li> 브레 그마에서 람다에 제대로 봉합을가 똑바로 정렬됩니다. 봉합은 머리의 비뚤어진 재조정 위치됩니다. </li><li> stereotax의 모든 설정이 제로되어 있는지 확인합니다. </li><li> 브레 그마의 장소에 바늘 끝을 넣어. </li><li> 브레 그마 및 람다 모두의 모든 좌표를 측정합니다. 이 복부 / 지느러미, 측면 / 내측과 전방 / 후방 좌표를 포함합니다. </li><li> 브레 그마 및 람다의 복부 좌표가 각각 0.02 mm 이내가 될 때까지 머리를 조정합니다. </li><li> 일단 (M / L) 측면 / 중간 좌표로 내측 브레 그마에서 나가 정렬. 확인왼쪽과 오른쪽은 각각 0.02 mm 내에서 정렬됩니다. </li><li> 브레 그마에서 거기에서 다시 중심 바늘 끝은 원하는 후방 / 전방 좌표 (A / P) 후방 / 전방 방향으로 이동합니다. </li><li> 필요한 경우, 각 한 방향으로 바늘과 stereotax가 잠겨 있는지 확인합니다. (- 1.52 + /) 왼쪽 M / L 좌표로 가서 </li><li> 시추공을 뚫은 후 참조로 사용하는 두개골의 상단 복부 위치를 측정합니다. </li><li> 원하는 좌표에서 멸균 드릴 비트를 사용하여 시추공을 뚫습니다. 바늘이 두개골을 중단 입력 할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 원하는 복부 좌표에 바늘을 낮 춥니 다. </li><li> 일단 좌표 딥 0.015 mm은 바이러스 벡터에 대한 작은 포켓을 만드는 ~ 10 초 동안 아래에 도달한다. </li><li> ~ 0.1 μL / min의 속도로 바이러스 벡터의 원하는 볼륨을 주입한다. 완전 확산 바이러스 벡터에 대한 3 분을 기다립니다. 바늘 끝 0.015 mm를 올리고 추가로 2 분을 기다립니다. </li><li>반대 방향으로 바늘을 (각도 주사하는 경우) 찍어. 다시 두개골의 상단에 대한 참조로 복부 위치를 기록합니다. </li><li> (양자 주사하는 경우) 반대편에 바이러스 벡터를 주입하는 첫 번째면에서 같은 단계를 반복합니다. </li><li> 멸균면 도포 구 끝의 나무 끝​​을 사용하여 밀봉하는 두 구멍 뼈 왁스를 적용합니다. </li><li> 두피를 봉합. </li><li> 상처 영역에 신경 차단을 적용합니다. </li><li> 45 분 복구하는 열 블록 따뜻하게 새장에 stereotax에서 마우스와 장소를 제거합니다. </li><li> 등 통증의 징후를 모니터 : 전체 활동이나 불안을 감소 음식과 물 소비를 증가 또는 발성 감소했다. 부 프레 노르 핀은 (0.05-0.2 ㎎ / ㎏) 필요한 경우 통증 일주일 동안 매일 두 번 관리 할 수​​ 있습니다. 사용 가능한 대안은 다음을 포함한다 : meperidine (20-60 ㎎ / ㎏), pentazocine (10 ㎎ / ㎏), nalbuphine (4-8 ㎎ / ㎏). </li></ol> 3. 에어컨 장소 설정 : AcquisitioN, 멸종, 그리고 차후 <ol><li> 단두대 문 60 초 이니 기간 동안 3 챔버 위치 기본 설정 장치 (메드 어소 주식 회사, 세인트 알 반스, VT, USA)의 중앙 챔버에 넣고 쥐가 닫힙니다. </li><li> 이니, 오픈 단두대 문을 한 후에는 MedPC IV 소프트웨어 (메드 어소 주식 회사)를 사용하여 기록되는 각 챔버에 소요되는 시간 1,200 초 동안 모든 3 챔버 쥐 무료로 탐사를 할 수 있습니다. </li><li> 사전 테스트 기간 동안 자신의 실적에 따라 조절 챔버에 마우스를 할당합니다. 기본 사전 테스트 기간 동안 최소 선호했다 구획 이후 삼일 동안 편견 디자인 페어 약물 관리를 사용하여. </li><li> 초 주입 직후 1,200 아침 세션과 할당 된 챔버를 한정, 향후 3 컨디셔닝 일 동안, 코카인 (IP 10 ㎎ / ㎏)과 쥐를 주입. 세션 후 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환합니다. 4 시간 후 (식염수 쥐를 주입 0.01 ML / G체중)와 1,200 초 오후 세션에 대한 반대 챔버를 한정. </li><li> 인수 테스트하기 위해, 단두대 문 중앙 챔버의 장소 마우스는 60 초 이니 기간 동안 폐쇄. 오픈 단두대 문 MedPC IV 소프트웨어 (메드 어소 시에이 츠, 주식 회사)에 의해 기록 된 모든 실에서 보낸 시간 1200 초 동안 무료로 탐사를 허용합니다. 코카인 한 쌍이 챔버에서 보낸 시간의 양의 생리 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간의 양을 뺀 기본 설정을 계산합니다. </li><li> 장소 환경 설정을 소화하기 위해, 취득을위한 시험 후 24 시간을 시작하기 적어도 2 시간으로 구분하여 동일한 장치에서 매일 무료 탐사의 두 20 분 세션에 쥐를 노출합니다. 모든 챔버에서 보낸 시간을 다시 기록해야하고 초기 CPP의 크기는 각 멸종 세션과 비교해야한다. </li><li> 쥐가 파에 대한 여부를 환경 설정을 평가하여 약물 유발 환경을 소멸 여부를 확인연속 멸종 일에 걸쳐 ticular 챔버 인수 기본 점수에 비해 크게 낮다. </li><li> 코카인의 프라이밍 용량 (5 ~ 10 ㎎ / kg, IP)과 쥐를 재개하고 무료 탐사를 허용하는 장치에 다시 노출하고 각 구획에 소요되는 시간을 기록합니다. </li><li> Euthasol 안락사 솔루션 (150 ㎎ / ㎏) 관리 할 수​​ 있습니다. Transcardially 4 % paraformaldehyde (PFA)로 마우스를 붓는다하고 정확한 microinjection의 배치를 확인하기 위해 조직 학적 검사를 수행합니다. </li></ol>

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멸종과 복직 단계를 포함 CPP와 함께 바이러스 성 벡터의 정위 microinjection을 통해 지역적 및 시간적 특정 유전자 제거 중독성이 같은 행동의 세 가지 단계에 유전자의 특정 기여 조사 할 수 있습니다. 기존 크레-LoxP 시스템을 활용하여 달성 조건부 녹아웃 시공 - 일시적으로 제한 유전자 제거를 위해 제공하고 있지만, stereotaxically floxed 생쥐의 개별 뇌 영역에 Cre 호텔 - 재조합을 microinjecting은 언제 어디서 유전자가 기절됩니다에서도 엄격하게 제어 할 수 있습니다. 또한이 때로는 녹아웃 마우스에서 관찰 제한 표현형의 변이를 차지하고 개발 과정에서 발생하는 보상 변화의 가능성을 우회. 또한, 동작 중 다양한 시간 지점에서 미세 주입 한 쥐의 동료를 사용하여 유전자 발현의 변화와 행동의 변화 사이에 만들어 질 인과 관계 링크는 허용 할 수 있습니다. impo하고rtantly,이 기술은 자기 관리와 정신 과민성 등 여러 가지 코카인 행동 패러다임에 적용 할 수 있습니다. <...

코카인은 매우 강화 각성제이다. 반복 노출에 따라 여러 가지 분자 및 세포 적응이 강박의 결과로 생각된다 보상 관련 뇌 회로에서 발생하는 약물 추구 심각한 임상 문제 1 포즈 재발의 높은 속도를 자극하는 행동을. 코카인은 유전자 발현을 조절하여이 오래 지속 행동 효과를 발휘한다. 만성 코카인 사용에서 발생 적응을 연구, 전임상 설치류 모델은 광범위하게 사용되어왔다. 하나의 모델은 에어컨 장소 환경 설정 (CPP) 패러다임이다. 이 모델은 이전에 중립적 환경과 코카인의 보람 속성 간의 배운 협회의 발전을 포함한다. 특정 챔버 코카인의 여러 쌍 후, 동물은 자유롭게 코카인 페어링 비 코카인 한 쌍이 환경을 탐색 할 수 있습니다 그리고 그들은 약 한 쌍이 함을 선호하는 경우, 그들은 코카인 유도 plac에 인수했다고하는전자 환경. 또한, 멸종 훈련 기간에 따라,이 패러다임은 코카인을 추구하는 행동의 특정 컨텍스트 회복을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 중독성 모방보다 정확하게 생각되는 장기 코카인에 의한 행동 및 분자 소성 2,3과 자기 관리 (SA) 연구하는 데 사용되는 정신 과민성, 같은 중독성이 같은 행동의 다른 행동 모델에 비해 와 같은 인간에있는 행동, CPP 패러다임은 코카인 상황에 맞는 학습 4를 연구하는 간단한 절차입니다. CPP 프로토콜은 편리 유사 약물 갈망과 재발 5-7과 어떤 인간에서 발생하는 측면 요점을 되풀이 것으로 추정된다 약물 추구 행동과 약물을 기본 메커니즘을 조사 할 수 SA에 멸종과 복직 단계를 포함하도록 확장 할 수 있습니다 - 그리고 큐 유발 재발 8-10. 하나의 메커니즘 그게 기초가수집, 멸종, 그리고 복직 등 CPP의 서로 다른 단계의 각각의 특징이다 코카인 유도 행동 가소성은 다른 뇌 영역 내에서 유전자 발현의 고유 한 서명의 활성화이다. 직접 행동 변화를 코카인 유도 중재 보상 관련 뇌 영역 내에서 어떤 유전자 테스트하기 위해, 지역적으로 고유의 방식으로 선택적으로 조작 할 수있을 때 유용합니다. 이 달성하는 한 가지 방법은 표현 Cre 호텔 재조합이 LoxP 사이트 (floxed 마우스)에 의해 측면 표적 유전자를 생쥐의 서로 다른 뇌 영역에, 정위 수술을 사용하는 재조합 adenoassociated 바이러스 (rAAV) 벡터를 microinject하는 것입니다. 이 방법은 언제, 어디서 유전자가 면역 반응은 11-13 유발하지 않고, 모두 분할 및 비 나누어 뉴런에서 소작하는 동안 매우 정확한 시간적 및 지역 제어 할 수 있습니다. 이 수준의 제어는 floxed 쥐에게 w를 사육 전통적인 크레-LoxP 기술에 중요한 이점을 나타냅니다점에서, 내생 유전자 프로모터의 통제하에 Cre 호텔 재조합을 표현하는 i 번째 마우스는 타이밍과 유전자 삭제 분포는보다 긴밀하게 조정할 수 있습니다. 또한, 바이러스 벡터를 매개로 유전자 녹아웃은 기존의 녹아웃 전략을 사용하여 발생할 수있는 발달 보상 효과를 우회. 자기 관리와 정신 과민성 등의 별도의 단계를 포함하는 행동 패러다임에 재하 적용 할 수있는 특정 유전자의 역할을 평가하기 위해 floxed 생쥐의 두뇌로, 여기 rAAV - Cre 호텔의 microinjection에 설명되어 코카인 CPP,뿐만 아니라. 예를 들어, 우리 연구실은 코카인 정신 과민성 14 카 V 1.2 L-타입 칼슘 2 + 채널의 역할을 연구하는 rAAV - Cre 호텔 기술을 활용하고있다. 특히, rAAV - Cre 호텔은 보여주기 위해 유전자 인코딩 칼슘 V 1.2 floxed과 생쥐의 핵의 accumbens (NAC)에 미세 주입 한 해당 CA V </suB&gt; 1.2이 지역 중재에 정신 과민성 14,15의 발현 단계 행동. 정신 과민성 캘리포니아 V 1.3 L-타입 칼슘 2 + 채널의 역할을 평가할 때 그 floxed 유전자를 가진 마우스가 존재하지 않는 경우, rAAV - Cre 호텔 전략을 사용할 수 없습니다, 우리의 경험이었다. 조건부 마우스가 관심의 특정 유전자가 존재하지 않는 경우 따라서, rAAV - Cre 호텔을 사용의 제한 자체를 제공합니다. 그러나 우리는 칼슘 V 1.3 채널 14,15의 역할을 검토했던 것처럼 표현의 siRNA가 최저 목표 유전자로 사용할 수 있습니다 rAAVs. floxed 생쥐의 분리 된 뇌 영역에 rAAV - Cre 호텔을 Microinjecting하고 CPP 패러다임을 테스트하는 다양한 중독과 같은 행동의 단계와 그들이 어디 행동하는을 중재 특정 유전자에 조사 할 수 있습니다. 이 패러다임의 사용은 본질적으로 반복 코카인 투여 BR을 탈취하는 방법에 대한 우리의 이해에 주었AINS 보상 회로는 중독 상태 1,16,17로 이어질 것을 분자 신호 전달 경로와 유전자 발현의 부적응 변화를 일으키는.

<table><tbody><tr><td>컨디셔닝 장소 선호 활동 챔버</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>마우스용 입체 정렬 시스템</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>모델 900</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, 미국 펜실베니아 주 필라델피아</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

관심 선택적으로 녹아웃 유전자 뚜렷한 마우스 뇌 영역에 크레 재조합을 표현하는 재조합 adenoassociated 바이러스 (rAAV) 벡터를 Microinjecting은 기존의 방법에 비해, 유전자 삭제의 강화 시간적 및 지역적 특정 제어 할 수 있습니다. 조건부 삭제는 floxed 유전자를 운반 쥐 특정 유전자 프로모터의 통제하에 표현 Cre 호텔 재조합이 정위 microinjection의 관심의 실험 정해진 시간 지점에서 분리 된 뇌 영역의 대상을 허용하는 짝짓기 마우스에 의해 달성 될 수 있지만. 코카인 에어컨 장소 환경, 그리고 자기 관리 또는 철회, 멸종 및 / 또는 회복 단계를 포함 할 수 정신 과민성 등의 코카인 행동 패러다임의 맥락에서,이 기술이 별개로 표적 유전자의 독특한 공헌을 탐험에 특히 유용합니다 코카인에 의한 소성의 행동 모델의 단계. 특히,이 기술은 시간에 걸쳐 행동에 대한 그들의 공헌을 테스트하는 행동의 개별 단계에서 표적 유전자를 선택적으로 제거 할 수 있습니다. 궁극적으로,이 이해는 습관성 행동의 각 단계에서 자신을 제시 가장 강력한 위험 요소를 해결하는 것이 가장 수 있습니다 더 많은 표적 치료 할 수 있습니다.

CPP 미세 주입 생쥐에 CPP를 수행 한 후, 하나는 제어 주입의 코호트 (rAAV-GFP) 마우스는 일반적으로 약물 쌍 챔버 (그림 1A, 1B)에 대한 선호도를 획득했는지 확인해야합니다. 마우스는 코카인 환경 (염분 쌍 챔버에 소요되는 코카인 한 쌍이 실을 뺀 시간에 소요되는 시간)이 기준 기본 점수 (그림 1B, 대 B)에 비해 유의하게 높은 경우 특정 챔버에 대한 선호도를 획득 한 것으로 간주됩니다 . 집단으로 제어 주입 마우스는 코카인 한 쌍이 실에 대한 환경 설정을 표시하거나 혐오감을 표시하지 않는 경우, 배치가 조직학 (rAAV 주입 항을 참조)과 잘못된 위치로 마우스를 통해 즉시 확인해야합니다는 폐기해야합니다. 기본 설정은 일반적으로 컨트롤 주입 집단에 의해 취득 된 경우, 하나는 연속적으로 (그림 1A 시작 멸종 패러다임을...

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

본 절차의 전반적인 목표는 조건 장소 선호 패러다임의 특정 단계 동안 표적 유전자를 선택적으로 제거함으로써, 시간에 따른 해당 행동에 대한 유전자의 기여도를 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 Cre 리콤비나아제를 발현하는 재조합 Adeno-associated 바이러스 벡터를 정위 고정 미세 주입함으로써 수행됩니다. 그 다음, Cre의 최대 재활성화를 위해 마우스가 홈 케이지에서 10~14일 동안 회복하도록 합니다.절차의 세 번째 단계는 획득, 소멸 및 재발 단계를 포함하는 조건 장소 선호도 검사를 통해 마우스를 테스트하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 주입된 마우스의 조직학적 검사를 수행하여 마이크로 주입 위치가 정확한지 확인하는 것입니다. 최종적으로, 조건 장소 선호도 행동 테스트를 통해 유전자 녹아웃에 반응하여 획득, 소멸 및/또는 재발 행동에 나타나는 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.CRE lock P 교배 시스템과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 유전자 넉아웃의 타이밍과 해부학적 특이성을 더욱 정밀하게 조절할 수 있어, 행동의 각 단계에서 유전자 결손의 영향을 조사할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 맥락적 단서에 대한 노출이 어떻게 중독자의 갈망과 재발을 유도하는 코카인 관련 기억을 촉발하는지에 대한 유전적 기반을 더 깊이 이해하게 함으로써, 중독 행동 치료로 그 응용 가능성을 확장할 수 있습니다. 시작 단계로, 수술 후 회복을 위해 베딩이 깔린 마우스 케이지를 히팅 패드 위에 올려 따뜻하게 데워 둡니다.머리 제모를 위한 전기 면도기와 두피 소독을 위한 에탄올 및 요오드를 준비합니다. 5 µL Hamilton 시린지를 사용하여 실체 현미경의 이어 바(ear bars)와 마우스 홀더(mouth hold)를 70% ethanol로 닦아냅니다. 5 µL의 바이러스 벡터를 흡입하여 실체 현미경의 시린지 홀더에 장착합니다.마우스에 ketamine xylazine 칵테일을 IP 주사한 후, 정위 고정 장치 위에 전자레인지 가열 패드 또는 전기 패드를 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 꼬리를 집어 진정 수준을 확인합니다. 다음으로 귀와 눈 사이의 머리 부분을 제모하고, 멸균 면봉을 사용하여 에탄올과 요오드로 해당 부위를 교대로 세척하여 소독합니다.그런 다음 마우스를 실체 현미경의 가열 패드로 옮깁니다. 치아 바와 귀 바의 눈금을 확인하고, 치아 바에 마우스의 치아를 고정한 뒤 주둥이 고정 나사와 귀 바를 조입니다. 흔들림이나 수염의 움직임이 관찰되는지 확인합니다.케타민 자일라진 칵테일의 추가 용량을 투여합니다. 그 다음, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 도포합니다. 이어서 메스로 두피를 절개하여 귀 바로 뒤쪽까지 엽니다.두피 모서리에 불독 클립을 집어 피부를 두개골에서 벗겨냅니다. 이때 Bgma와 Lambda가 잘 보이도록 합니다. bgma에서 Lambda까지의 봉합선이 일직선이 되도록 확인하고, 필요한 경우 머리 위치를 다시 조정하십시오.정위 고정 장치의 설정값이 0으로 맞춰졌는지 확인한 후, 바늘 끝을 bma 위치에 둡니다. BMA와 lambda 모두에 대해 등-배측, 내-외측 및 전-후측 좌표를 측정합니다. 그다음, BMA와 lambda의 배측 좌표 차이가 0.02 millimeters 이내가 되도록 머리 위치를 조정합니다.바늘 끝을 bgma에 다시 맞춘 다음, 해당 지점에서 전후 방향으로 원하는 좌표까지 이동시킵니다. 이어서 원하는 좌표에 보어홀(borehole)을 뚫습니다. 바늘이 두개골에 걸리지 않고 진입할 수 있는지 확인한 후, 바늘을 원하는 복측 좌표까지 내립니다.좌표에 도달하면, 약 0.1 µL/min의 속도로 0.015 mm 아래까지 약 10초 동안 진입시켜 바이러스 벡터를 위한 작은 포켓을 생성합니다. 바이러스 벡터가 확산될 수 있도록 3분간 대기한 후, 원하는 부피의 바이러스 벡터를 주입하고 바늘 끝을 0.015 mm 들어 올린 뒤 추가로 2분간 더 대기합니다. 주입이 완료되면 본 왁스(bone wax)를 도포하여 두 구멍을 모두 밀봉한 다음 두피를 봉합합니다. 마지막으로 상처 부위에 신경 차단을 실시합니다.마우스를 정위 고정 장치에서 분리하여 가열 블록 위의 따뜻한 케이지에 넣고 45분에서 1시간 동안 회복시킵니다. 최대 재활성화를 위해 마우스를 최소 10일 동안 회복시킵니다. 회복 후 동물에게 물과 부드러운 먹이를 제공하고, 통증이 있을 경우 필요에 따라 부프레노르핀을 하루 두 번 투여합니다. 이후 길로틴 도어를 닫은 상태로 마우스를 3챔버 장소 선호도 장치의 중앙 챔버에 넣고 60초 동안 적응 기간을 갖게 합니다.순화 과정 후, 기요틴 도어를 열어 마우스가 1200초 동안 세 개의 챔버 전체를 자유롭게 탐색하도록 합니다. 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 Med PC four 소프트웨어를 사용하여 동물이 각 챔버에서 보낸 시간을 기록합니다. 사전 테스트 동안의 수행 능력을 바탕으로 마우스를 조건화 챔버에 배정합니다.향후 3일 동안, 오전 세션에 cocaine 10 mg/kg을 투여한 후 즉시 지정된 챔버에 1200초 동안 함께 둡니다. 생쥐를 홈 케이지로 옮겨 4시간 동안 유지한 다음, 식염수를 투여하고 즉시 반대쪽 챔버에 1200초 동안 가둡니다. 습득 여부를 테스트하기 위해, 기요틴 도어를 닫은 상태로 생쥐를 중앙 챔버에 배치하여 62번째 순화 기간을 갖게 합니다.길로틴 도어를 열고 1200초 동안 자유롭게 탐색하게 하거나 이를 녹화합니다. 모든 챔버에서 보낸 시간을 측정하며, 코카인 쌍 챔버에서 보낸 시간에서 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간을 빼서 선호도를 계산합니다. 미세 주입된 마우스에 대해 CPP를 수행한 후, 특정 챔버에 대한 선호도를 획득한 것으로 간주합니다.코카인 쌍 챔버에서 보낸 시간에서 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간을 뺀 값으로 정의된 코카인 선호도가 기선 선호도 점수에 비해 유의하게 높을 때를 기준으로 합니다. 만약 대조군 주입 마우스 집단이 코카인 쌍 챔버에 대한 선호도를 보이지 않거나 혐오 반응을 보인다면, 조직학적 분석을 통해 즉시 배치 오류 여부를 확인하고, 배치가 잘못된 마우스는 연구에서 제외합니다. 대조군 주입 집단에서 정상적으로 선호도가 획득되면, 소거 단계에 진입하여 패러다임을 확장합니다.생쥐가 특정 챔버에 대해 약물로 유도된 선호도가 소거된 것으로 간주합니다. 2일 연속 소거일 동안의 코카인 선호도가 이때의 획득 선호도 점수보다 유의하게 낮을 때, 약물 프라이밍(drug prime)으로 재발을 유도할 수 있습니다. 약물 프라이밍 투여 후의 선호도 점수가 획득 시의 점수와 통계적으로 차이가 없다면, 해당 코호트는 quantitative PCR을 사용하여 약물 쌍 챔버에 대해 약물로 유도된 선호도가 재발된 것으로 봅니다.이 그림은 L 타입 칼슘 채널 아이소폼인 CAV 1.2 플록의 RAAV를 보유한 마우스의 nucleus accumbens에 RAAV Cree GFP를 미세 주입한 후, 실제로 표적 유전자가 넉아웃되었음을 보여줍니다. RAAV Cree가 주입된 펀치 시료는 여기에 표시된 A-A-V-G-F-P 주입 마우스에 비해 유전자 발현이 유의미하게 감소한 것을 보여줍니다. 이 절차 이후 nucleus accumbens에 대한 GFP 면역조직화학 분석 결과, 미세 주입된 RAAV Cree가 양측에 적절하게 배치되었음을 확인할 수 있습니다.특정 유전자의 넉다운(knockdown)이 관심 대상인 다른 유전자들의 발현 수준에 미치는 영향에 대한 의문을 해결하기 위해 quantitative real-time PCR 및 Western blotting과 같은 다른 기술들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는, 조건 장소 선호도(condition place preference) 패러다임의 습득, 소거 및 재발 과정에서 해당 유전자들의 역할을 선택적으로 테스트하기 위해, 정위 고정 미세 주입(stereotaxic microinjection) 바이러스 벡터를 이용하여 생쥐 뇌의 표적 유전자를 선택적으로 제거하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.

stereotaxic-microinjection-viral-vectors-expressing-cre-recombinase

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작...

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.

광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제

학습하세요 생쥐 뇌에 바이러스 벡터를 정위 미세 주입하여 특정 유전자를 선택적으로 제거하는 방법입니다. 이 기법은 조건된 장소 선호 패러다임의 획득, 소멸, 재활성화 단계에서 유전자의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

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