July 30th, 2013
이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 조건 장소 선호 패러다임의 개별 단계에서 표적 유전자를 선택적으로 제거하여 시간이 지남에 따라 이러한 행동에 대한 기여도를 테스트하는 것입니다. 이는 Cree 재조합효소를 발현하는 재조합 eno 관련 바이러스 벡터를 최초로 입체택시 마이크로에 주입함으로써 달성됩니다. 다음으로, 생쥐는 최대 C 재활성화를 위해 10-14일 동안 가정용 케이지에서 회복할 수 있습니다.
절차의 세 번째 단계는 획득, 소멸 및 복원 단계를 포함하여 조건화된 장소 선호에서 마우스를 테스트하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 주입된 마우스에 대한 조직학적 검사를 수행하여 올바른 마이크로 주입 배치를 검증하는 것입니다. 궁극적으로, 조건 장소 선호 행동 테스트를 통해 유전자 녹아웃에 대한 반응으로 획득, 사멸 및/또는 복원 행동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
CRE lock P 짝짓기 시스템과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 유전자 녹아웃의 보다 구체적인 타이밍 및 해부학적 특이성을 개별적으로 허용하여 행동의 각 단계에서 유전자 손실을 조사할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 함의는 중독 행동 치료로 확장되는데, 이는 상황적 단서에 대한 노출이 중독자의 갈망과 재발을 유발할 수 있는 코카인 관련 기억을 어떻게 유발할 수 있는지에 대한 기초가 될 수 있는 유전적 기초를 더 잘 이해하는 것을 포함하기 때문입니다. 시작하려면 열 잠금 장치에 침구가 있는 마우스 케이지를 놓고 수술 후 회복을 위해 따뜻하게 합니다.
머리를 면도하기 위한 전기 면도기를 설치하고 두피를 살균하기 위해 에탄올과 요오드를 설정합니다. 70% 에탄올을 사용하여 5마이크로리터 해밀턴 주사기를 사용하여 스테레오 공격의 이어바와 입 홀드를 닦아냅니다. 5마이크로리터의 바이러스 벡터를 추출하여 스테레오 공격에 대한 주사기 홀더에 설정합니다.
케타민 자일라진 칵테일의 IP 주사를 마우스에 주입한 후 스테레오 공격에 전자레인지 가열 패드 또는 전기 패드를 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 꼬리 꼬집기를 수행하여 진정 수준을 확인합니다. 다음으로, 귀와 눈 사이의 머리를 면도하고 멸균 면 애플리케이터를 사용하여 에탄올과 요오드를 번갈아 가며 세척합니다.
그런 다음 마우스를 스테레오 공격 0의 가열 된 패드로 옮깁니다. 치아 바와 이어 바는 스케일링하고 마우스의 치아를 치아 바에 놓고 주둥이와 이어 바를 나사로 조입니다. 흔들림이나 수염의 움직임이 관찰되는 경우.
케타민 자일라진 칵테일의 추가 용량을 투여합니다. 그런 다음 눈이 건조하지 않도록 윤활제를 바르십시오. 그런 다음 메스 컷을 사용하여 두피를 귀 바로 뒤까지 엽니다.
두피 모서리에 불독 클립을 놓고 두개골 피부를 벗겨냅니다. Bgma 및 Lambda를 쉽게 볼 수 있는지 확인합니다. bgma에서 Lambda로의 봉합사가 정렬되었는지 확인하고 필요한 경우 헤드의 위치를 변경합니다.
스테레오 어택 설정이 0으로 설정된 것을 확인한 후 bma에서 바늘 끝을 제자리에 놓습니다. BMA와 lambda 모두에 대한 dorsal ventral, medial, lateral and anterior posterior coordinates를 측정합니다. 그런 다음 BMA와 람다의 복부 좌표가 서로 0.02mm 이내가 될 때까지 머리를 조정합니다.
바늘 끝을 bgma의 중앙에 다시 놓고 그 지점에서 전방 후방 방향으로 원하는 좌표로 이동합니다. 다음으로 원하는 좌표에 시추공을 뚫습니다. 바늘이 두개골에 의해 방해받지 않고 들어갈 수 있는지 확인한 다음 바늘을 원하는 복부 좌표로 내립니다.
좌표에 도달하면 약 10초 동안 0.015mm 아래로 내려가 분당 약 0.1마이크로리터의 속도로 바이러스 벡터를 위한 작은 포켓을 만들고, 바이러스 벡터가 확산될 때까지 3분 동안 기다린 후 원하는 양의 바이러스 벡터를 주입한 다음 바늘 끝을 0.015mm 올리고 2분 더 기다립니다. 주사가 완료되면 뼈 귀지를 바르고 두 구멍을 모두 밀봉한 다음 두피를 봉합합니다. 마지막으로 상처 부위에 신경 차단을 적용한다.
스테레오 공격에서 마우스를 제거하고 열 블록의 따뜻한 케이지에 넣어 45분에서 1시간 동안 회복합니다. 마우스가 최대한의 재활성화를 위해 최소 10일 동안 회복되도록 합니다. 동물에게 물을 주고 음식을 부드럽게 하고 회복 후 통증에 필요한 경우 하루에 두 번 부프레노르핀을 투여하고, 단두대 문을 닫은 상태에서 62번째 습관 기간 동안 쥐를 3개의 방 장소 선호 장치의 중앙 방에 넣습니다.
습관화한 후 단두대 문을 열고 생쥐가 1200초 동안 세 개의 방을 모두 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. Med PC four 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 각 방에서 동물이 보낸 시간을 기록합니다. 사전 테스트 중 성능에 따라 마우스를 컨디셔닝 챔버에 할당합니다.
다음 3일 동안 아침 세션에서 1kg당 10mg의 코카인을 주입하고 즉시 할당된 챔버에서 1200초 동안 결합합니다. 생쥐를 4 시간 동안 집 우리로 되돌려 놓은 다음 식염수를 주입하고 즉시 1200 초 동안 쥐를 반대쪽 방에 가둡니다. 획득을 테스트하기 위해 쥐를 62번째 습관 기간 동안 단두대 문을 닫은 중앙 챔버에 놓습니다.
단두대 문을 열고 1200초 동안 자유롭게 탐색하거나 녹음할 수 있습니다. 모든 챔버에서 보낸 시간은 코카인 쌍 챔버에서 보낸 시간에서 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간을 빼서 선호도를 계산합니다. 마이크로 주입된 마우스에서 CPP를 수행한 후 특정 챔버에 대한 선호도를 획득한 것으로 간주됩니다.
코카인 쌍 챔버에서 보낸 시간으로 정의된 코카인 선호도에서 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간을 뺀 값이 기준선 선호도 점수에 비해 유의하게 높습니다. 코호트 대조군으로 주입된 마우스가 코카인 쌍 챔버 또는 쇼에 대한 선호를 보이지 않는 경우, 혐오 배치는 조직학을 통해 즉시 확인되고 잘못된 배치를 가진 마우스는 연구에서 제외됩니다. 선호가 일반적으로 대조군 주입 코호트에 의해 획득되는 경우, 패러다임은 멸종을 시작함으로써 확장됩니다.
마우스는 특정 챔버에 대한 약물 유도 선호도를 소멸시킨 것으로 간주됩니다. 이틀 연속 멸종일 동안의 코카인 선호도가 이 시기의 획득 선호도 점수에 비해 현저히 낮을 경우, 약물 프라임으로 복귀할 수 있습니다. 약물 프라임 투여 후 선호도 점수가 인수 시점의 선호도 점수와 통계적으로 구별할 수 없는 경우, 해당 코호트는 정량적 PCR을 사용하여 약물 쌍 챔버에 대한 약물 유도 선호도를 복원했다고 합니다.
이 그림은 관심 유전자가 실제로 RAAV의 L 유형 칼슘 채널 동형, CAV 1.2 무리를 가진 핵 측좌체에 RAAV Cree GFP의 마이크로 주입 후 마이크로 주입 마우스에서 녹아웃되었음을 보여줍니다. 크리어 주입 펀치는 여기에 표시된 A-A-V-G-F-P를 주입한 마우스에 비해 유전자 발현이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. GFP를 위한 측좌핵의 면역조직화학 분석은 이 절차에 따라 마이크로 주입된 RAAV 크리어의 적당한 양측 배치를 계시합니다.
정량적 real-time PCR 및 웨스턴 바디링과 같은 다른 기술은 다른 관심 유전자의 발현 수준에 대한 유전자의 넉다운의 영향에 관한 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 입체택시 미세주입 바이러스 벡터를 사용하여 마우스 뇌의 표적 유전자를 선택적으로 제거하는 방법을 더 잘 이해하게 되어 조건 장소 선호 패러다임의 획득, 소멸 및 복원에서 이러한 유전자의 역할을 선택적으로 테스트할 수 있습니다.
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이 기사는 마우스 뇌에 바이러스 벡터를 미세 주입하고 조건부 장소 선호 패러다임에서 그 효과를 테스트하는 절차를 설명합니다. 이 연구에는 행동 변화를 평가하기 위해 습득, 소멸 및 재개 단계가 포함됩니다.
This technique enables precise temporal and spatial control of gene knockout in discrete brain regions, allowing interrogation of gene function across distinct phases of cocaine-conditioned place preference. By linking target gene ablation to specific behavioral phases (acquisition, extinction, reinstatement), it supports mechanistic de-risking in addiction target validation. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by isolating gene contributions to cue-triggered relapse mechanisms relevant to therapeutic development.
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of gene function in reward circuitry, proceeds to screening via standardized behavioral readouts, and supports translational research through phase-specific analysis of cocaine-related behaviors.