2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

이 프로시저의 전반적인 목표는 2단계 콜라게나제 관류법을 사용하여 인간 간세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 관류 캐뉼라를 사용하여 간 조직 조각의 혈관에 캐뉼라를 삽입함으로써 수행됩니다. 그 후 콜라게나제를 사용하여 간 조직 조각을 관류 및 소화시킵니다.

세 번째 단계는 글리슨 캡슐(glisson's capsule)을 제거하여 분리된 간세포를 방출시키는 것입니다. 마지막 단계는 저속 원심분리를 통해 간세포를 단리하는 것입니다. 최종적으로, 간세포는 위상차 현미경이나 면역세포화학법을 이용한 알부민 염색으로 확인할 수 있으며, 간세포의 생존율과 수율은 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion assay)을 사용하여 결정합니다.

캐뉼레이션과 소화 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 캐뉼레이션에 정교한 기술이 필요하며 소화 완료 시점을 식별하기 어려울 수 있기 때문입니다. 이 기술이 처음인 분들을 위해 제 실험실의 기술자인 Natalie Lun이 절차를 시연하겠습니다.

본 시연에서는 인간의 간 조직 대신 양의 간 조각을 사용하겠습니다. 간 조각 관류를 위한 장비를 다음과 같이 설치하고, 용액이 간 조각에 도달했을 때 37 °C가 되도록 항온수조의 온도를 적절하게 설정하십시오. 용액 1, 2, 3의 경우 41 °C가 적당하며, 자켓형 유리 응축기의 용액 4는 콜라게나제(collagenase) 활성 손실을 줄이기 위해 37 °C로 유지해야 합니다. 관류 시작 직전에 산소 공급 장치의 가스 조절기를 켜십시오. 병리과 의사로부터 글리슨 캡슐(glisson's capsule)이 대부분 또는 완전히 온전하고 절단면이 하나만 있는 간 조각을 확보하여 배치하십시오.

타공 필터 디스크가 포함된 뷰히너 깔때기에 간 조각을 올린 후, 이제 낮은 유량으로 용액 1을 사용하여 관류 시스템을 프라이밍해야 합니다. 올리브 팁이 달린 곡선형 관류 캐뉼라를 간 조각 절단면의 더 큰 혈관에 삽입하십시오. 혈액이 간에서 씻겨 나감에 따라, 관류가 잘 되는 부위의 조직 색이 밝아집니다. 사용되는 캐뉼라의 수는 간의 크기에 따라 다릅니다.

일반적으로 20g 미만에서 80g 이상의 간 조직에 대해 4개에서 8개의 캐뉼라를 사용해야 합니다. 캐뉼라가 꽉 맞고 안정적으로 고정될 수 있도록 게이지를 선택하십시오. 버퍼가 조직에서 배출될 수 있도록 작은 혈관들은 열어 둡니다.

이제 연동 펌프의 유량을 분당 110에서 460 밀리리터 사이로 높입니다. 사용된 유량 범위 내에서 간 조각의 색이 전체적으로 밝아지면 관류가 잘 이루어지고 있는 것입니다. 이는 간의 크기에 따라 다르며, 간의 크기가 클수록 더 높은 관류 속도를 사용합니다.

일반적으로, 다양한 간 무게 범위에 걸쳐 캐뉼라당 분당 44 mL의 평균 관류 속도가 이상적입니다. 선택한 유량은 간 조각이 약간 부풀어 오르는 정도여야 합니다. 관류 동안 생리식염수에 적신 거즈 조각으로 간 조각을 덮어 습윤 상태를 유지하십시오.

조직에 용액 1을 1L 관류하여 간 조직 내에 남아 있는 혈액을 모두 씻어냅니다. 관류액을 용액 2로 교체하고 10분 동안 관류합니다. 다음으로, 관류액을 용액 3으로 전환하여 0.5L를 관류합니다.

이제 관류액을 collagenase가 포함된 솔루션 4로 교체하십시오. 이 관류를 순환 방식으로 9~12분 동안 또는 간이 충분히 소화될 때까지 수행합니다. 간 조직은 글리슨 캡슐(glisson capsule) 아래에서 약간 분해되는 것처럼 보여야 합니다.

메스(scalpel)의 뭉툭한 면으로 눌러보았을 때 간이 부드럽게 느껴져야 합니다. 과도한 소화는 간세포의 생존율을 낮출 수 있고, 소화가 부족하면 간세포의 회수율이 낮아질 수 있으므로 간 조각을 정확한 시간 동안 소화시키는 것이 중요합니다. 먼저 연동 펌프(peristaltic pump)를 끄고 간 조각에서 캐뉼라(cannula)를 제거하십시오.

그런 다음 조직을 100 내지 200 milliliters의 용액이 담긴 결정화 접시에 넣습니다. 다섯째, 글로머루스 캡슐을 조심스럽게 제거하고 세포를 부드럽게 흔들어 배출합니다. 관류가 제대로 되지 않은 부위가 있는 경우, 메스를 사용하여 해당 부위를 절단하여 내부에 포함된 세포를 방출시킬 수 있습니다.

과정 중에 필요에 따라 용액 5를 더 추가하고, 최종적으로 용액 5의 부피가 500 milliliters가 되도록 맞춥니다. 이제 세포 현탁액을 두 번 여과합니다. 먼저, 210 micron 나일론 메쉬를 통해 세포를 1 liter 원추형 플라스크에 여과합니다.

그 다음, 70 micron 나일론 메쉬를 통해 세포를 1리터 원추형 플라스크에 여과합니다. 세포 현탁액을 동일한 부피로 나누어 200 milliliter 원심분리 튜브 두 개에 붓습니다. 그런 다음, 여과된 세포 현탁액을 4 °C에서 72 Gs로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 흡입하고 세포 펠릿을 약 200 milliliters의 용액에 부드럽게 재현탁합니다. 다섯째, 원심분리와 재현탁 과정을 3회 반복합니다. 마지막 원심분리 후, 세포를 냉각 보관 용액에 재현탁하여 최종 농도가 milliliter당 200만에서 500만 개의 간세포가 되도록 합니다. 헤모사이토미터를 사용해 trypan blue 분석으로 세포 수를 정확하게 측정할 수 있습니다.

여기에 648회 분리된 trypan blue 염색 간세포가 제시되어 있습니다. 분리된 인간 간세포의 평균 생존율은 77 ± 10%였습니다. 면역형광법을 통해 측정한 간세포의 평균 수율은 간 1g당 13 ± 11 million hepatocytes였습니다. 간세포 순도를 결정하기 위해 albumin에 대해 녹색으로 양성 염색된 분리 간세포의 순도를 측정한 결과 94 ± 1%였습니다.

면역형광 염색은 5회의 반복 실험을 포함하여 총 4회 수행되었습니다. 위상차 현미경을 통해 간세포의 큰 세포 크기와 다각형 모양과 같은 형태학적 특성을 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 2단계 콜라게나제 관류법을 사용하여 인간 간세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.