2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 2단계 콜라겐분해효소 관류 절차를 사용하여 인간 간세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 관개 캐뉼라로 간 조각의 혈관을 캐뉼러함으로써 수행됩니다. 그 다음에는 콜라겐 분해 효소를 사용하여 간 조각의 관류 및 소화가 이루어집니다.

세 번째 단계는 해리된 간 세포를 방출하는 반짝이는 캡슐을 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 간세포를 분리하는 저속 원심분리입니다. 궁극적으로, 간세포는 위상차 현미경 검사 또는 트리암 블루 배제 분석을 사용하여 결정된 간세포의 생존력 및 수율과 함께 면역 세포 화학을 사용한 알부민 염색으로 식별할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 캐뉼레이션 및 분해 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 캐뉼레이션에는 약간의 기교가 필요하고 소화 완료를 식별하기 어려울 수 있기 때문입니다. 이 기술을 처음 접하는 사람들을 위해 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Natalie Lun이 시연할 것입니다.

이 시연에서는 인간의 조각 대신 램프 간 조각을 사용하고, 간 조각의 관류 장비를 다음과 같이 설정하고, 용액이 간에 도달했을 때 섭씨 37도가 되도록 수조를 적절한 온도로 설정합니다. 조각. 섭씨 41도는 용액 1, 2, 3에 적합하며 재킷 유리 응축기 용액 4의 경우 콜라겐분해효소 활성의 손실을 줄이기 위해 섭씨 37도에 있어야 합니다. 풍부하기 직전에 가스 조절기를 켜십시오 병리학자로부터 산소화 장치의 경우 이상적으로 대부분 또는 완전히 손상되지 않은 반짝이는 캡슐과 절단된 표면 위치가 하나뿐인 간 조각을 얻으십시오.

천공된 필터 디스크가 포함된 Buchner 깔때기의 이 간 조각은 이제 간 조각의 절단된 표면에 있는 더 큰 혈관에 올리브 팁이 있는 곡선형 관개 캐뉼라를 삽입하는 저유속을 사용하여 솔루션 1로 프라이밍해야 합니다. 간에서 혈액이 흘러나오면 관류가 잘 되는 부위의 조직이 가벼워집니다. 사용되는 캐뉼라의 수는 간에 따라 다릅니다.

일반적으로 20g 미만에서 80g 이상의 간에는 4-8개의 캐뉼라를 사용해야 합니다. 꼭 맞고 안전하게 맞도록 캐뉼라의 게이지를 선택하십시오. 완충액이 조직에서 배출될 수 있도록 작은 혈관을 열어 두십시오.

이제 연동 펌프의 유량을 분당 110-460밀리리터 사이로 높입니다. 간 조각이 사용된 유속 전체에 걸쳐 더 밝은 색인 경우 좋은 관류입니다. 관류 속도가 더 높은 간의 크기에 따라 다르며 간이 큰 경우 사용됩니다.

일반적으로 캐뉼라당 분당 44밀리리터의 평균 관류 속도는 다양한 간 중량에 걸쳐 이상적입니다. 선택한 유속은 간 조각이 약간 통통하게 부풀어 오르는 결과를 낳아야 합니다. 관류하는 동안 식염수에 적신 거즈 조각으로 덮어 간 조각을 촉촉하게 유지하십시오.

1리터의 용액으로 조직을 관류한 후 간 조각에 남아 있는 혈액을 씻어냅니다. 관류 유체를 용액 2로 변경하고 10분 동안 관류합니다. 다음으로, 관류 유체를 용액 3으로 전환하고 반 리터로 관류합니다.

이제 관류 유체를 콜라겐 분해 효소가 포함된 용액 4로 변경합니다. 9분에서 12분 동안 또는 간이 충분히 소화될 때까지 재순환 방식으로 이 관류를 수행합니다. 간 조직은 반짝이는 캡슐 아래에서 약간 부서지는 것처럼 보여야 합니다.

간은 또한 메스의 뭉툭한 면으로 짠 때 부드러워진 느낌이 들어야 합니다. 과도하게 소화되면 간세포의 생존력이 낮아질 수 있고 과소 소화는 간세포의 수율을 낮출 수 있으므로 정확한 시간 동안 간 조각을 소화하는 것이 중요합니다. 연동 펌프를 끄고 간 조각에서 캐뉼라를 제거하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 100-200 밀리리터의 용액이 들어있는 결정 접시에 조직을 놓습니다. 5. 번들거림 캡슐을 조심스럽게 제거하고 세포를 부드럽게 흔듭니다. 관류가 잘 되지 않는 영역이 있는 경우 메스를 사용하여 이러한 영역을 절단하여 그 안에 포함된 세포를 방출할 수 있습니다.

프로세스 중에 필요에 따라 용액 5를 더 추가하면 궁극적으로 용액 5의 부피가 500밀리리터가 됩니다. 이제 셀 현탁액을 두 번 필터링합니다. 먼저 210미크론 나일론 메쉬를 통해 세포를 1리터 원추형 플라스크로 여과합니다.

그런 다음 70미크론 나일론 메쉬를 통해 세포를 1리터 원추형 플라스크로 필터링합니다. 동일한 부피의 셀 현탁액을 200ml 원심분리기 튜브에 붓습니다. 그런 다음 여과된 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 72Gs로 원심분리합니다.

스내트를 흡인하고 세포 펠릿을 약 200ml의 용액에 부드럽게 재현탁합니다. 5. 최종 원심분리 후 원심분리 및 재현탁액을 3회 반복하고 세포를 냉장 보관 용액에 재현탁시켜 최종 농도를 밀리리터당 2-500만 개의 간세포로 재현탁합니다. triam blue assay는 혈구 분석기를 사용하여 세포 수를 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 648개의 분리에서 추출한 트리안 블루 염색 간세포입니다. 분리된 인간 간세포의 평균 생존력은 77 플러스 마이너스 10%였다 간세포의 평균 수율은 면역형광을 통해 간 1그램당 13 플러스 마이너스 1,100만 간세포였다. 녹색에서 알부민에 대해 양성으로 염색된 분리된 간세포는 간세포 순도를 결정하기 위해 94 플러스 또는 마이너스 1%의 순도를 가졌습니다.

면역형광 염색은 시험당 5회 반복하여 4회 실시했습니다. 위상차 현미경은 큰 세포 크기 및 다각형 모양과 같은 간세포의 형태학적 특성을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 2단계 콜라겐분해효소 관류 절차를 사용하여 인간 간세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.