Name: 2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 2단계 콜라게나제 관류법을 이용한 인간 간세포 분리 방법을. 이 기술은 높은 생존율과 수율을 제공하여 간 재생, 약물동태학 및 독성학 연구에 적합합니다.

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이 작품은 연구를위한 인간의 조직이 사용할 수 있도록 인체 조직 및 세포 연구 재단에 의해 가능하게되었다. 그리고 Hepacult GmbH의이 작품에 대한 재정 지원은 연방 교육 연구부 (: 가상 간 네트워크, 인증 번호 0315759 부여 이름)에서 ​​받았습니다. 우리의 감사는 또한 간 관류 및 간세포 분리를 수행하기 위해 간 샘플 및 세포 격리 코어 시설의 기술 조수의 수집에 대한 Grosshadern 병원 조직 은행의 기술 조수로 이동합니다. 특히, 우리는 비디오에서이 절차를 시연에 Natalja 뢰벤에게 감사의 말씀을 전합니다. 마지막으로, 우리는 비디오의 개략도 그림 1의 그림과 그림을 만들기위한 Natalja 뢰벤 및 Edeltraud Hanesch에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 관류 및 격리 솔루션의 제조 <ol><li> 간 조각과 표 1에 따라 간세포의 분리의 관류에 필요한 솔루션을 준비합니다. 솔루션을 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 살균 필터 0.22 μm의 필터를 사용하는 모든 솔루션을 제공합니다. </li><li> 간장과 접촉 모든 솔루션은 멸균해야한다. </li></ol> 2. 살포 장비 및 솔루션의 준비 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 간 매의 관류를위한 장비가 설정되어야한다. </li><li> 수욕은 각 특정 실험 장치에서 다른 적절한 온도, 설정해야 그들이 간 부분에 도달 할 때 용액이 37 ° C의 온도에 있는지 등. 이 경우, 물 욕 해법 1, 2, 3 및 재킷 유리 응축기 따뜻하게 41 °의 C로 설정된다. 해결 방법 4로 예열한다콜라게나 제 활성의 손실을 줄이기 위해 사용하기위한 별도의 물을 욕조에 37 ° C에서. </li><li> 얼마 간 관류하기 전에, 95 %, O2 / 5 % CO 2 산소 장치 (그림 1E)를 가스를 포함하는 가스 탱크의 조절기의 전원을 켭니다. </li></ol> 3. 간 관류 <ol><li> 단 1 컷 표면에 이상적으로 가능하고 많은 그대로 Glisson의 캡슐 간 조각은 관류에 대한 병리학에서 확인하셔야합니다. </li><li> 천공 필터 디스크 (그림 1B)를 포함하는 뷰 흐너 깔때기에이 간 조각을 놓습니다. </li><li> 관류 시스템 솔루션 1 프라이머해야합니다. </li><li> 낮은 유량, 올리브 팁 만곡 관개 캐 뉼러는 간 매 절단면에 큰 혈관에 삽입되어야한다. 혈액이 간에서 플러시으로, 조직은 좋은 관류와 지역에서 가벼운됩니다. 다양한 크기에 사용되는 캐 뉼러의 수간의 그림 2A에 표시됩니다. 선택 게이지 크기는 장소에 캐 뉼러를 개최한다 아늑한 적합을 초래할 것이다. 작은 혈관이 간 조각 밖으로 배출하는 관류 버퍼 개방해야한다. </li><li> 간 (그림 2B)의 크기에 따라 ㎖ / 분 110-460 사이에 연동 펌프의 유량을 증가시킨다. 이 44 ± 16의 평균 유량 ml / 분 정맥 당 (그림 2C)가 발생합니다. 선택된 속도는 간 조각에 의존하고 간 부분에 약간의 플럼 핑의 최대 발생한다. 경우에 따라서는 상기 소 플럼 핑을 달성하기 위해 미세 혈관 클램프 개방 용기의 일부를 차단 클램핑 할 필요가있다. 간 조각에 걸쳐 밝은 색 때 좋은 관류가 관찰 할 수있다. </li><li> 식염수에 적신 거즈로 덮어 관류 동안 촉촉한 간 조각을 유지합니다. </li><li> 어떤 연구를 플러시 해결 방법 1의 1 L에 Perfuse간 피스에 혈액을 emaining. </li><li> 해결 방법 2로 관류 액을 변경하고 10 분 동안 perfuse. </li><li> 해결 방법 3으로 관류 액을 전환하고 0.5 L.와 perfuse </li><li> 콜라게나 제 (표 2)의 0.1 ~ 0.15 %를 함유 솔루션 4에 관류 액을 변경합니다. </li><li> 간을 충분히 소화 될 때까지이 단계를 들어, 관류는 9-12 분 동안 순환 방식으로 수행하거나되어야한다 간 조직은 Glisson의 캡슐에서 약간 떨어져 휴식과의 무딘면을 탐색 할 때 부드럽게 느낌이 나타납니다 메스. </li></ol> 4. 간세포의 분리 <ol><li> 연동 펌프를 끄고 간 조각에서 캐 뉼러를 제거합니다. </li><li> 해결책 5의 100 ~ 200 ㎖에 들어있는 결정화 접시에 간 조각을 놓습니다. </li><li> 주의 깊게 Glisson의 캡슐을 제거하고 부드럽게 세포를 흔들어. 잘 관류하지 영역이있을 경우, 메스 극복하는데 사용될 수있다이 지역에 포함 된 세포를 분리합니다. 등의 과정에서 필요한 더 많은 해결책 5를 추가합니다. </li><li> 500 ㎖의 최종 부피에 도달 할 때까지 더 많은 해결책 5를 첨가. </li><li> 두 번 세포 현탁액을 필터, 먼저 70 μm의 나일론 메쉬 다음에 210 μm의 나일론 메쉬를 통해. 다음으로, 200 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 붓는다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 72 g에서 세포 현탁액을 원심 분리기 기음 뜨는 부드럽게 해결책 5 200 ㎖에 부드럽게에 resuspend 세포 펠렛. </li><li> 세척 단계 번호 4.6 세 번 반복합니다. 최종 원심 분리 단계에서 냉장 솔루션에 resuspend 세포 (물질의 목록 참조). 세포는 혈구 기반 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 수율과 생존 능력의 평가를위한 밀리리터 당 약 2-5000000 간세포해야한다. </li><li> 트리 판 블루 배제 분석을 수행하기 위해, 트리 판 블루 soluti입니다 0.5 ㎖를 포함하는의 미세 관 (≈ 2-5000000 / ml)을 적절하게 희석 세포의 0.1 ML를 추가(0.4 % 트리 판 블루는 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해) 및 0.4 ml의 PBS. 철저 세포 현탁액을 혼합 한 후, 현탁액을 혈구로드 100X 배율로 현미경으로 조사한다. 살아있는 세포는 흠이 표시하는 동안 현미경에서 죽은 세포는 파란색 물들 일 것이다. 혈구에 표시된 1mm 2 그리드의 각에 살고있는 전체 세포의 수를 계산합니다. 생존 능력 (%), 살아있는 세포의 수율은 (ML 차가운 스토리지 솔루션 (CSS) 100 만 간세포 또는 G 간 100 만 간세포) 아래의 공식을 사용하여 계산 될 수있다. </li></ol><img alt="식 (1)" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> 주 :이 경우에, 트리 판 블루 희석 계수는 10이며, 혈구 계수는 10000이다.

<ol><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
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<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+III%3A+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li>
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<li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue%3A+a+one+hundred+liver+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222(2011).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

이 프로토콜의 최적화는 부분적으로 Hepacult GmbH의 교부금에 의해 투자되었다. 박사 볼프강 Thasler는 Hepacult GmbH의의 창시자 중 하나이며,이 회사의 이사회 멤버 중 하나 남아있다. Maresa Demmel의 고용은 Hepacult에 의해 부분적으로. 마리아 Hauner는 Hepacult GmbH에 의해 사용된다. Hepacult 동의 및 연구 목적으로 오픈 액세스와 인간의 간세포를 제공하는 대학에서 스핀 오프 생물 공학 회사입니다.

이 프로토콜은 높은 생존 능력 및 순도 인간 간세포의 분리가 발생합니다. 이러한 결과를 달성하기 위해, 간 적합한 장으로 시작하는 것이 중요하다. 간 조각은 1 절단면을 제외한 모든 표면에 그대로 Glisson의 캡슐이 있어야합니다. 또 다른 중요한 요인은 다른 배치 소화 11 후 간세포의 생존 정도에서 현저한 차이가 발생할 수 있으므로, 사용 콜라의 특정 배치입니다. 따라서, 콜라게나 제의 다른 배치는 테스트해야하고 최고의 가능성과 간세포를 생성하는 일괄 대량으로 얻을 수 있어야합니다. 마지막으로, 적절한 소화 시간은 얻어지는 세포의 수율 및 생존 능력에 기초하여 선택되어야한다. 예를 들어, 낮은 수율과 높은 생존 능력이 불충분 한 소화 시간을 표시 할 수 있고, 낮은 생존율과 높은 수익률은 소화 시간이 너무 긴 것을 나타낼 수 있습니다. 이 방법은 t을 적용 할 수 있습니다O 같은 간 조각에서 비 실질 세포와 간세포를 분리. 이 작업을 수행하는 한 가지...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

간세포 현탁액을 기계적 또는 효소 적 방법에 의해 간장에서 제조 될 수있다. 전체 간 세포를 제조하는 데 사용되는 기계적인 방법은, 투박한 (2)를 통해 간을 강제 칸 통 3 유리 구슬 간 조각을 흔들면서, 수년에 걸쳐 등 느슨한 방앗 공이 4,5 유리 균질를 사용하는 등, 기계적인 방법 중 추락 인해 세포막에 손상 및 절연 6,7 간세포의 기능의 상실로 선호. 따라서, 효소 방법의 사용은 현재 간세포의 분리를위한 주요 방법입니다. 베리와 친구 8 쥐의 문맥을 통해 간을 콜라와 히알루을 관류 할 때 효소의 방법을 사용하여 간세포의 분리는 크게 향상되었다. 이것은 재관류 프로세스에 이르는, 효소는 세포의 대부분에 밀착 할 수 있도록 혈관을 살린간세포 8의 수율이 6 배 증가. 또한,이 방법은 사실상 고립 된 소포에 소포체없이 변환없이 미토콘드리아 손상 8, 구조적 무결성을 유지 세포를 얻었다. 이 방법은 간 세포 분리를위한 두 단계 관류 절차를 개척 Seglen 1에 의해 수정되었다. 이 절차에서는 쥐의 간은 칼슘 2 + 1을 포함하는 콜라게나 버퍼 관류 다음에 칼슘 2 + 무료 버퍼 관류한다. 두 번째 단계에서 칼슘 2 +의 첨가가 최적의 콜라게나 제 활성 1,9 필요하면서 제 1 단계에서 칼슘 2 +의 제거는, 데즈 모섬을 방해하도록 돕는다. 상기 게시 된 작품은 쥐에서 수행 된 점을 감안,이 문서는 콧노래에서 높은 가능성을 가진 간세포의 분리에 사용할 수있는 수정 절차를 설명하는 것을 목표로간. 인간 간세포의 사용은 translational 연구를위한 동물 모델을 사용하여 실험을 검증하기위한 중요한 남아있다. 이 연구에 사용 된 인간의 간 조각은 인간의 조직과 세포 연구 재단, 국영 비영리 재단 (10)를 통해 지배 구조에 대한 동의를 획득했다. 병리학 진단에 필요한 있었는지를 제거 한 후, 간 조각이 남아있는 조직에서 수집되었다. 병리학 자에 의해 떨어져 구분 조직 형태 학적으로 간 절제술 후 절제에서 얻은 건강한 조직이었다.

<table><tbody><tr><td>버블 트랩</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 재킷 콘덴서</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>41 > C 수조</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>37 &도; C 수조</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>압축 가스 실린더 (95 % O2/5 % CO2)</td><td>Linde</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>가스 투과성 튜빙</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>메스</td><td>깃털</td><td>320010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>겸자</td><td>옴니랩</td><td>5171014</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>원뿔형 플라스크 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>원뿔형 플라스크 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비커</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 ml 원심분리기 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>결정화 접시</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>볼 팁이 있는 곡선형 관개 캐뉼러</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 혈관 클램프</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml; chner 깔때기</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나일론 메쉬 210 &mu; m</td><td>네올랩</td><td>4-1413</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나일론 메쉬 70 &mu; m</td><td>네올랩</td><td>4-1419</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.22 &무; m 멸균 필터</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>500ml 병</td><td>Schott Duran</td><td>2180144</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L 병</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 파스퇴르 피펫</td><td>브랜드</td><td>747715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>전동 피펫 필러 (Pipette boy acu)</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>재냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>층류</td><td>Kendro</td><td>Hera safe-KS9</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>흡인기 (저유량 수술용 흡입 펌프)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>실험실 가스 버너</td><td>Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>일회용 실험실 코트</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>바이저가 있는 수술용 마스크</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>수술용 후드</td><td>배리어</td><td>42072</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>라텍스 장갑</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 (배치 번호 NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 디하이드레이트</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E4378</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 염화</td>물 <td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>헤페스</td><td>로스</td><td>9105.3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Serva</td><td>26868</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>알부민</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>포도당</td><td>세르바</td><td>22700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소듐 수소 카보네이</td>트 <td>Serva</td><td>30180</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.4% Trypan 블루 솔루션</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>냉장 보관 솔루션</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

간, 뛰어난 재생 능력을 가진 기관은 이러한 해독, 대사 및 항상성 같은 광범위한 기능을 수행한다. 이와 같이, 간세포 연구 문제의 큰 다양성을위한 중요한 모델이다. 특히, 인간 간세포의 사용은 약물 동력학, 독성, 간 재생 및 병진 연구의 분야에서 특히 중요하다. 따라서,이 방법은 Seglen 한 바와 같이하여 간세포를 분리하는 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차의 수정 된 버전을 나타낸다. 이전 간세포 기계적 방법에 의해 고립되었다. 그러나, 효소 방법은 간세포 분리 후 자신의 구조적 안정성과 기능을 유지하기로 우수한 것으로 나타났다. 여기에 제시된이 방법은 77 ± 10 %의 가능성을 가진 간세포의 큰 수율 인간의 간 조각과 결과 쥐의 간을 위해 이전에 설계 방법을 적응시킨다. 주이 절차의 차이는 혈관 cannulization의 과정이다. 또한, 여기에 설명 된 방법은 또한 대등 간 또는 혈관 크기를 가진 다른 종에서의 간 적용될 수있다.

관류 설치 간 관류에 필요한 장비는 그림 1에 따라 설정해야합니다. 생존과 고립 된 인간의 간세포의 수익률 고립 된 인간 간세포의 평균 생존율은 77 ± 10 % 였고, 간세포의 평균 수익률은 ± 표준 편차를 의미로 표현 값으로, 13 ± 1100 만 간세포 / g 간이었다. 간세포 아이솔레이션의 수는이 평균 648 아이솔레이션이 1999년 1월에서 2012년 12월까지에서 실시했다 얻기 위해 실시했다. 적당한 관류 매개 변수 성공적인 플러싱 및 간 혈류를 수행하기 위해, 사용되는 캐 뉼러의 개수는 간 (도 2a)의 무게에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 4-8 캐 뉼러는 20g 이하에서 80 G까지 간 사용해야합니다. 관류의...

인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 2단계 콜라게나제 관류법을 사용하여 인간 간세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 관류 캐뉼라를 사용하여 간 조직 조각의 혈관에 캐뉼라를 삽입함으로써 수행됩니다. 그 후 콜라게나제를 사용하여 간 조직 조각을 관류 및 소화시킵니다.세 번째 단계는 글리슨 캡슐(glisson's capsule)을 제거하여 분리된 간세포를 방출시키는 것입니다. 마지막 단계는 저속 원심분리를 통해 간세포를 단리하는 것입니다. 최종적으로, 간세포는 위상차 현미경이나 면역세포화학법을 이용한 알부민 염색으로 확인할 수 있으며, 간세포의 생존율과 수율은 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion assay)을 사용하여 결정합니다.캐뉼레이션과 소화 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 캐뉼레이션에 정교한 기술이 필요하며 소화 완료 시점을 식별하기 어려울 수 있기 때문입니다. 이 기술이 처음인 분들을 위해 제 실험실의 기술자인 Natalie Lun이 절차를 시연하겠습니다.본 시연에서는 인간의 간 조직 대신 양의 간 조각을 사용하겠습니다. 간 조각 관류를 위한 장비를 다음과 같이 설치하고, 용액이 간 조각에 도달했을 때 37 °C가 되도록 항온수조의 온도를 적절하게 설정하십시오. 용액 1, 2, 3의 경우 41 °C가 적당하며, 자켓형 유리 응축기의 용액 4는 콜라게나제(collagenase) 활성 손실을 줄이기 위해 37 °C로 유지해야 합니다. 관류 시작 직전에 산소 공급 장치의 가스 조절기를 켜십시오. 병리과 의사로부터 글리슨 캡슐(glisson's capsule)이 대부분 또는 완전히 온전하고 절단면이 하나만 있는 간 조각을 확보하여 배치하십시오.타공 필터 디스크가 포함된 뷰히너 깔때기에 간 조각을 올린 후, 이제 낮은 유량으로 용액 1을 사용하여 관류 시스템을 프라이밍해야 합니다. 올리브 팁이 달린 곡선형 관류 캐뉼라를 간 조각 절단면의 더 큰 혈관에 삽입하십시오. 혈액이 간에서 씻겨 나감에 따라, 관류가 잘 되는 부위의 조직 색이 밝아집니다. 사용되는 캐뉼라의 수는 간의 크기에 따라 다릅니다.일반적으로 20g 미만에서 80g 이상의 간 조직에 대해 4개에서 8개의 캐뉼라를 사용해야 합니다. 캐뉼라가 꽉 맞고 안정적으로 고정될 수 있도록 게이지를 선택하십시오. 버퍼가 조직에서 배출될 수 있도록 작은 혈관들은 열어 둡니다.이제 연동 펌프의 유량을 분당

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

이것은 간에서 조직 세포 외 소포 (EV)를 격리하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 콜라게나아제 관류와 관련된 2단계 과정을 설명하고 간 조직 EV를 분리하기 위한 차동 초원심분리를 설명합니다.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

학습하세요 2단계 콜라게나제 관류법을 이용한 인간 간세포 분리 방법을. 이 기술은 높은 생존율과 수율을 제공하여 간 재생, 약물동태학 및 독성학 연구에 적합합니다.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

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