단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마이크로 규모의 췌도에 분 단위로 조절된 간헐적 저산소증을 적용하여 사전 적응 효과를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 얇은 가스 투과성 막을 갖춘 다중 모드 미세유체 장치를 제작합니다. 두 번째 단계는 컴퓨터 제어 산소 조절 시스템을 구축하는 것입니다.

다음으로 아이렛(eyelet)을 장치에 조심스럽게 장착한 후, 액체 및 산소 미세유체 장치를 연결합니다. 마지막 단계로, 산소 조절 중에 변화하는 아이렛 파라미터를 시각화하기 위해 현미경 관찰과 다중 모드 미세유체 시스템의 동작을 조정합니다. 최종적으로, 아이렛 간헐적 저산소증 기법을 사용하여 저산소 상태에서 포도당 반응이 명확하게 손상됨을 보여줍니다.

저산소증의 시간적 조절을 통해 안구 조직이 손상을 덜 입으면서 반응하도록 훈련시킬 수 있습니다. 용존 산소 조절이나 저산소 챔버 사용과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 복잡한 흐름으로 인한 전단 응력 없이 매우 짧고 미세한 시간 간격으로 정확한 산소 농도를 안검에 전달할 수 있다는 점입니다.

또한 바닥 및 현미경 관찰을 통한 실시간 모니터링이 가능합니다. 이 마스터는 이식 부위의 저산소성 손상을 정의하거나 이식 결과를 개선하기 위한 전처치 요법을 결정하는 것과 같이, Alli 이식 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 따라서 이 방법은 Alli 저산소증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 중추신경계, 심장 조직, 신장 및 기타 이식 장기와 같은 다른 조직 및 계통에도 적용할 수 있습니다. 장치 제작 및 아이렛(eyelet) 취급의 많은 부분이 까다롭기 때문에 이 방법에 대한 비디오 시연이 매우 중요합니다. 이 기술은 새로운 학제간 특성으로 인해 단계를 학습하기 어렵지만, 도전적이거나 익숙해지면 효율적입니다. 먼저 미세유체 장치의 커버 층을 제작하는 것부터 시작하십시오.

이를 위해 미리 혼합된 PDMS를 빈 페트리 접시에 1.5 millimeters 높이로 붓고 80 degrees Celsius에서 2시간 동안 경화시킵니다. 다음으로, 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 350 micron 두께의 SU 8 21 50 층을 두 번 스핀 코팅하여 총 700 micron 두께의 단일 층을 형성함으로써 퍼퓨전 챔버 마스터가 포함된 글루코스 미세유체 층을 제작합니다. 그런 다음, 글루코스 미세유체 층 포토마스크를 사용하여 UV 광선을 조사해 SU eight 층에 미세채널 패턴을 전사합니다.

SU-8 현상액으로 노광되지 않은 부분을 씻어냅니다. 다음으로, 미리 혼합된 DGA의 PDMS를 MA 위에 3 mm 높이까지 붓고 80 °C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 포도당 미세유체 층을 모양에 맞게 절단하고, 2 mm 펀치를 사용하여 입구 및 출구 포트를 형성하며, 8 mm 직경의 펀치로 메인 챔버를 형성합니다.

다음으로, 깨끗한 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 SU 8 2100을 100 micron 두께로 스핀 코팅하여 눈꺼풀 고정용 마이크로웰 마스터를 제작하고, UV 리소그래피를 사용하여 이 층에 마이크로웰 패턴을 전사합니다. 마이크로웰 마스터가 완성되면 현상액으로 노출되지 않은 영역을 씻어냅니다. PDMS를 900 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅하고, 각 층을 80 °C에서 10분 동안 경화시켜 100 micron 두께의 층을 두 번 추가합니다.

완료되면, 입구 및 출구 포트에 2 mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 마지막으로, 이전 층과 동일하게 SU 8 2100을 100 µm 두께로 스핀 코팅하여 가스 미세유체 마스터를 제작하고, UV 리소그래피를 사용하여 가스 미세유체 패턴을 다시 전사합니다. 현상액으로 노광되지 않은 영역을 씻어냅니다.

다음으로, 가스 미세유체 마스터 위에 PDMS를 1.5 millimeter 두께로 붓고 80 °C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 그 후 면도날을 사용하여 PDMS를 모양에 맞게 절단합니다. 이어서 다른 층들의 포트 위치와 일치하도록 커버 층에 2 millimeter 직경의 입구 및 출구 포트를 뚫어 여러 층을 서로 결합합니다.

먼저, 스카치테이프로 표면을 세척하고 코로나 아크(Corona arc)에 노출시킨 후, 다음 순서에 따라 레이어를 수동으로 정렬하여 준비합니다. 우선, 마이크로웰이 위를 향하도록 하여 멤브레인을 하단 가스 레이어에 접합합니다. 그다음, 마이크로웰 멤브레인 위에 포도당 미세유체 레이어를 접합합니다.

마지막으로, 가장 윗부분에 입구 및 출구 층을 접합하여 전체 조립체를 캡슐화합니다. 조립체 상단에 1kg 무게추를 올려 단단히 접합되도록 돕고, 100 °C에서 3시간 동안 베이킹합니다. 그 후 누설 검사를 수행합니다.

수성층에 물을 채우고 장치를 침전시킨 후, 시린지를 사용하여 기체층으로 공기를 흘려보내며 누수 여부를 확인하여 장치를 테스트합니다. 마지막으로, 누수가 없는 장치의 수성층에 70% ethanol을 1~2분 동안 통과시켜 멸균합니다. 마이크로 디스펜서 제어 리드를 포함된 드라이버 유닛에 연결하여 마이크로 디스펜서를 설정합니다.

그 다음, 드라이버를 LabVIEW 컨트롤에 해당하는 디지털 IO 보드의 포트에 연결합니다. 이어서 5 V 및 20 V DC 전원 공급 장치를 드라이브 유닛의 해당 접점에 연결하고, 동봉된 텍스트 프로토콜의 부록에 설명된 가스 제어용 LabVIEW 코드를 실행하기 위해 디지털 IO를 노트북에 연결합니다. 그런 다음 하나의 마이크로 디스펜서를 질소에, 다른 하나를 5% 이산화탄소가 포함된 압축 공기에 연결하고, 두 가스 모두 2 PSI로 설정합니다. 디스펜서 출력단을 T-접합부(T junction)로 연결하여 마이크로 유체 소자로 들어가게 합니다.

다음으로, 장치에 0% 및 21% 산소를 연결한 후 도립 현미경의 가열 스테이지 위에 장치를 장착하십시오. 그다음 장치의 유체 배출구에 광섬유 산소 센서를 배치하여 배출구 내의 용존 산소량을 실시간으로 측정하십시오. 그런 다음 장치를 연동 펌프에 연결하고 250 µL/min의 속도로 장치에 물을 흘려보내기 시작하십시오.

마이크로 디스펜서를 5%와 21% 산소 농도 사이에서 주기적으로 변경하여 산소 조절의 과도 응답을 특성화합니다. 연동 펌프를 미세유체 장치에 연결하고, 유체가 장치에 들어가기 전 가열될 수 있도록 튜브를 37 °C 가열판 위에 배치합니다. 또한, 포도당 미세유체 출력 포트를 분획 수집기에 연결합니다. C 57 black six 마우스를 해부하고, 조직 분리 후 JoVE에서 제공하는 다음 영상들에 설명된 콜라게나제 소화 및 Ficoll 밀도 구배 분리법을 통해 췌도 세포를 분리합니다.

10% FBS, 1% penicillin streptomycin 및 20 millimolar HEPES가 포함된 RPMI 1640 배지가 담긴 페트리 접시에서 안구 조직편(eyelets)을 24~48시간 동안 배양하십시오. 일관된 결과를 얻기 위해 안구 조직편을 2일 이내에 사용하십시오. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2 millimolar glucose를 포함하는 용액과 14 millimolar glucose를 포함하는 용액을 각각 준비하여 신선한 Krebs ringer bicarbonate 완충액을 제조하십시오.

50 mL 원추형 튜브에 담긴 용액들을 37 °C 항온수조에 넣어 가온합니다. 그다음, 2 mM glucose가 포함된 Krebs 완충액 2 mL에 5 µM 4:02 AM 및 DMSO와 2.5 µM RH 1 23 및 100% ethanol을 첨가하여 분리된 eyelet용 염색액을 준비합니다. 다음으로, 10 µL 피펫으로 eyelet을 채취하여 37 °C에서 30분 동안 염색액에 배양합니다.

염색이 완료되면 포도당 마이크로채널 입구를 통해 약 20개의 아이렛(eyelet)을 장치에 로딩합니다. 배출구에서 입구 방향으로 버퍼를 프라이밍하여 아이렛을 챔버 내부로 유도합니다. 그 다음, 과잉 염색약을 씻어내기 위해 아이렛과 버퍼를 10분 동안 관류합니다.

먼저, 정상 맥박 기선을 설정하기 위해 2 mM Krebs ringer bicarbonate 완충액을 5분 동안 시스템에 흘려줍니다. 그 다음, 14 mM 포도당 완충액으로 15분 동안 챔버를 자극하고, 이어서 2 mM 포도당 완충액으로 15분 동안 세척합니다. 이 과정 동안 340 nm와 380 nm로 여기시켜 두 가지 방출의 510 nm를 기록합니다.

또한, 염료를 480 nm에서 여기시켜 RH 1 23의 530 nm 방출광을 기록하십시오. 산소 조절 중 대류 교란을 최소화하려면 자극 및 세척 단계 동안 버퍼 흐름을 적용하고, 테스트 중 다른 단계에서는 흐름을 반드시 중단하십시오. 이 비디오에서 보여준 미세 유체 접근 방식을 이용한 추가 분석에 사용하기 위해 글루코스 배출구에서 1분 간격으로 유출액을 수집하십시오. 컴퓨터 제어 마이크로 인젝터를 사용하면 얇은 PDMS 막을 지나 흐르는 산소의 백분율을 빠르게 조절할 수 있습니다.

여기 1분에서 6분까지 범위의 조절 예시가 있습니다. 또한, 5%에서 21% 사이의 산소를 공급함으로써 2ppm에서 8.5ppm 사이의 산소 농도를 1분 미만 단위로 정량적으로 조절하는 것도 가능합니다. 파란색 선은 공급된 산소의 백분율을 나타내며, 녹색은 그 결과로 나타난 ppm 단위의 용존 산소량을 나타냅니다. 이러한 사이클링을 적용하여 안구 혈관(eyelets)에 간헐적 저산소증을 유도하면, 불규칙한 정상 산소 분맥과 비교하여 저산소증에 대한 안구 혈관의 사전 적응(preconditioning) 효과를 확인할 수 있으며, 이는 처리 후 개선된 비율을 통해 관찰할 수 있습니다. 저산소증과 간헐적 저산소증의 효과는 여기 파란색으로 표시된 정상 산소 반응과 비교하여 칼슘 과도 응답(calcium transients)의 오버슈트 및 진동 감쇠에서 관찰할 수 있습니다.

빨간색은 저산소 응답이며, 녹색 선은 조건화된 저산소 응답입니다. 여기에는 칼슘, 미토콘드리아 전위 및 인슐린의 측정값이 표시되어 있습니다. 이는 실시간 형광 현미경 검사와 시스템의 미세유체 유출액을 이용한 오프칩(off-chip) ELISA 분석의 결과입니다. 이들을 종합하면 저산소 일시 상태에서의 포도당-인슐린 응답에 대한 다중 모드 뷰를 구축하기 시작할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있으며, 하루는 장치 제작 및 안검 세포 분리에 소요되고 나머지 하루는 안검 실험 자체에 소요됩니다. 이 절차를 시도할 때, 장치 개발 후 가스 분석기를 통해 공급된 산소 농도를 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 태아 조직 및 기타 조직 미세 생리학 분야의 연구자들이 저산소증과 일시적인 산소 패턴이 당뇨병, 심혈관 및 신경계 질환과 같은 질병에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 다중 모드 미세유체 장치를 사용하여 산소 조절 방법을 제어하고, 미세 조직을 조작하며, 조직 저산소증에 대해 재현 가능하고 의미 있는 측정값을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.