단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

이 절차의 전반적인 목표는 미시적 췌장 구멍에 분 규모의 간헐적 저산소증을 적용하여 사전 조정 효과를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 얇은 가스 투과성 멤브레인을 가진 다중 모드 미세유체 장치를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 컴퓨터화된 산소 조절 시스템을 만드는 것입니다.

다음으로 구멍을 조심스럽게 장치에 넣은 다음 액체 및 산소 미세유체역학을 연결합니다. 마지막 단계는 산소 조절 중에 변경되는 구멍 매개변수를 시각화하기 위해 다중 모드 미세유체역학(multimodal microfluidics)과 현미경 검사를 조정하는 것입니다. 궁극적으로, 작은 구멍, 간헐적 저산소증 기법은 저산소증에서 포도당 반응이 명백히 손상되었음을 보여주기 위해 사용됩니다.

저산소증의 시간적 조절은 작은 구멍이 덜 손상으로 반응하도록 훈련시킬 수 있습니다. 용존 산소 또는 저산소 챔버 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정확하다는 것입니다. 산소 농도는 복잡한 흐름으로 인한 순전한 스트레스 없이 빠르고 미세한 시간 간격으로 눈꺼풀에 전달될 수 있습니다.

또한 바닥 및 현미경 검사를 통한 실시간 모니터링이 가능합니다. 이 마스터는 이식 부위의 저산소 장애를 정의하거나 이식 결과를 개선하기 위한 사전 컨디셔닝 요법과 같은 Alli 이식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 따라서 이 방법은 Alli 저산소증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 중추 신경계, 심장 조직, 신장 및 기타 이식 기관과 같은 다른 조직 및 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 비디오 시연은 많은 장치 제작 및 구멍 핸들로 인해 중요합니다. 이 단계는 기술의 새로운 학제 간 특성으로 인해 배우기가 어렵지만 본질적으로 도전적이거나 친숙 한 것은 미세 유체 장치의 덮개 층을 제작하여 시작합니다.

이를 위해 DGA를 1.5mm 높이로 사전 혼합한 PDM을 빈 페트리 접시에 붓고 섭씨 80도에서 2시간 동안 경화시킵니다. 다음으로, 4인치 실리콘 웨이퍼에 단일 700미크론 층을 형성하기 위해 SU 8 21 50의 350미크론 두께의 층 2개를 스핀 코팅하여 풍부한 챔버 마스터로 포도당 미세유체 층을 제작합니다. 그런 다음 포도당 미세유체층 포토 마스크를 사용하여 UV 광선에 노출시켜 미세채널 패턴을 SU 8층으로 전달합니다.

SU eight 현상액으로 노출되지 않은 부분을 헹굽니다. 다음으로, DGA가 사전 혼합된 PDM을 MA에 최대 3mm 높이까지 붓고 섭씨 80도에서 2시간 동안 경화합니다. 경화되면 포도당 미세유체층을 모양으로 자르고 2mm 펀치를 사용하여 입구 및 출구 포트를 형성하고 메인 챔버에 8mm 직경의 펀치를 사용합니다.

다음으로, 깨끗한 4인치 실리콘 웨이퍼에 100미크론 두께의 SU 8 2100 층을 스핀 코팅하여 눈꺼풀 고정을 위한 마이크로 웰 마스터를 제작한 다음 UV 리소그래피를 사용하여 마이크로 웰 패턴을 이 층에 전사합니다. 마이크로웰 마스터가 완료되면 현상액으로 노출되지 않은 부분을 헹굽니다. 900RPM에서 30초 동안 스핀 코팅하여 100미크론 PDMS 층 2개를 추가한 다음 섭씨 80도에서 10분 동안 경화하여 각 층을 생성합니다.

완료되면 출구 포트에 2mm 직경의 흡입구를 펀칭합니다. 마지막으로 이전 층에서와 같이 두께 100 미크론에 SU 8 2100을 회전시켜 가스 미세유체 마스터를 제작하고 UV 리소그래피를 사용하여 가스 미세유체 패턴을 다시 이송합니다. 현상액으로 노출되지 않은 부분을 헹굽니다.

다음으로, 1.5mm 두께의 PDMS 층을 기체 미세유체 마스터에 붓고 섭씨 80도에서 2시간 동안 경화합니다. 그런 다음 면도날로 PDMS를 모양에 맞게 자릅니다. 그런 다음 두 개의 밀리미터 직경의 입구 및 출구 포트를 커버 레이어에 펀칭하여 다른 레이어에서 발견되는 위치와 정렬하여 여러 레이어를 함께 결합합니다.

먼저 스카치 테이프로 표면을 청소하고 코로나 아크에 노출시킨 다음 다음 순서로 수동으로 레이어를 정렬하여 준비합니다. 먼저 마이크로 웰이 위를 향하도록 하여 멤브레인을 하단 가스층에 접착합니다. 그런 다음 마이크로 웰 멤브레인 위에 포도당 미세유체 층을 접착합니다.

마지막으로 맨 위에 입구와 출구 층을 접착하여 전체 어셈블리를 캡슐화합니다. 어셈블리 위에 1kg의 무게를 추가하고 섭씨 100도에서 3시간 동안 굽는 것으로 단단한 결합을 형성하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 누출됩니다.

수성층에 물을 적재하고 장치를 담그고 주사기로 가스 층을 통해 공기를 흐르게 하면서 누출을 찾아 장치를 테스트합니다. 마지막으로, 1-2분 동안 수성층을 통해 70% 에탄올을 통과시켜 누출이 없는 장치를 살균합니다. 먼저 마이크로 디스펜서 제어 리드를 포함된 드라이버 장치에 연결하여 마이크로 디스펜서를 설정합니다.

그런 다음 드라이버를 lab view 컨트롤에 해당하는 포트에서 디지털 IO 보드에 연결합니다. 다음으로, 5V 및 20V DC 전원 공급 장치를 구동 장치의 해당 접점에 연결하고 디지털 IO를 랩톱에 연결하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 부록에 설명된 대로 가스 제어를 위한 실험실 보기 코드를 실행합니다. 그런 다음 하나의 마이크로 디스펜서를 질소에 연결하고 다른 하나를 압축 공기에 연결하며, 둘 다 5%의 이산화탄소를 포함하고 두 가스를 모두 두 PS로 설정합니다. 나는 미세유체 장치에 들어가기 전에 디스펜서 출력을 T 접합부에 연결합니다.

다음으로, 장치에 0%와 21%산소가 연결된 도립 현미경의 가열된 스테이지에 장치를 장착합니다. 그런 다음 장치의 유체 출력에 광섬유 산소 센서를 배치하여 출력 내의 용존 산소를 실시간으로 측정합니다. 그런 다음 장치를 연동 펌프에 연결하고 분당 250마이크로리터로 장치를 통해 물을 흐르게 합니다.

마이크로 디스펜서를 5%에서 21% 산소 사이로 순환시켜 산소 조절의 과도 반응을 특성화합니다. 연동 펌프를 미세유체 장치에 연결하고 튜브를 섭씨 37도 열판 위에 배치하여 유체가 미세유체 장치에 들어가기 전에 유체를 예열합니다. 또한, 포도당 미세유체역학의 출력 포트를 분획 수집기에 연결하여 C 57 black six 마우스를 해부하기 시작하고 콜라겐분해효소 분해 및 F ccal 밀도 구배 분리에 의해 췌장 구멍을 분리합니다.

페트리 접시에 10%FBS, 1%페니실린 스트렙토마이신 및 20밀리몰 힙을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 구멍을 24-48시간 동안 배양합니다. 일관된 결과를 보장하기 위해 2일 이내에 구멍을 사용하십시오. 다음으로, 2 밀리몰 포도당을 포함하는 용액과 14 밀리몰 포도당을 포함하는 다른 용액을 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 새로운 Krebs ringer 중탄산염 완충액을 준비합니다.

50ml 원뿔형 튜브에 담긴 용액을 섭씨 37도의 수조에 넣어 따뜻하게 합니다. 그런 다음 2 밀리 몰의 포도당을 포함하는 Krebs 완충액의 2 밀리리터에 4:02 AM 및 DMSO의 5 마이크로 몰과 RH 1, 23 및 100 % 에탄올의 2.5 마이크로 몰을 추가하여 분리 된 구멍의 염색을 준비합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터 피펫으로 구멍을 집어 섭씨 37도에서 30 분 동안 염색 상태로 배양합니다.

염색이 완료되면 포도당 미세채널 주입구를 통해 장치에 약 20개의 구멍을 로드합니다. 배출구에서 흡입구로 다시 완충액을 프라이밍하여 구멍을 챔버로 유도합니다. 그런 다음 구멍을 관류하고 10분 동안 버퍼링하여 과도한 염료를 씻어냅니다.

먼저, 5분 동안 시스템을 통해 2개의 밀리몰 크렙스 링거 중탄산염 완충액을 추출하여 정상적인 펄스 기준선을 설정합니다. 그런 다음 14 밀리몰 포도당 완충액으로 15분 동안 챔버를 자극한 다음 2 밀리몰 포도당 완충액으로 15분 동안 세척합니다. 이 과정에서 340 나노 미터와 380 나노 미터의 다이어트를 자극하여 두 가지 방출에 대해 510 나노 미터를 기록합니다.

또한 480 나노 미터에서 염료를 여기하여 RH 1 23의 530 방출을 기록하십시오. 산소 조절 중 대류 장애를 최소화하려면 자극 및 세척 단계에서 완충 흐름을 적용하고 테스트 중에는 다른 단계에서 흐름을 중지해야 합니다. 이 비디오에 표시된 미세유체 접근법을 사용하여 추가 분석에 사용하기 위해 1분 간격으로 포도당 배출구에서 유출물을 수집하면 컴퓨터화된 마이크로 인젝터를 사용하여 얇은 PDMS 멤브레인을 빠르게 통과하는 산소의 비율을 조절할 수 있습니다.

다음은 1분에서 6분에 이르는 이 변조의 예입니다. 또한 5에서 21% 사이의 산소를 전달하여 2에서 8.5ppm 사이의 산소의 정량적 미만 변조를 제공할 수 있습니다.파란색 선은 전달된 산소의 백분율을 나타내고 녹색은 결과적으로 생성된 용존 산소(ppm)입니다. 이 사이클링이 구멍에서 간헐적 저산소증을 생성하기 위해 적용될 때, 저산소증 및 간헐적 저산소증의 치료 효과가 오버슈트에서 관찰될 수 있고 여기에서 파란색으로 표시된 것처럼 칼슘 과도 현상의 진동 댐핑에서 관찰할 수 있는 후 비율이 개선되는 것을 관찰함으로써 불규칙 규산소증 펄스에 대한 저산소증에 대한 작은 구멍의 사전 조정 이점을 관찰할 수 있습니다.

빨간색은 저산소 반응이고 녹색 선은 조건화된 저산소 반응입니다. 칼슘, 미토콘드리아 전위 및 인슐린의 측정값이 여기에 나와 있습니다. 이는 시스템의 미세유체 유출을 함께 사용하여 실시간 형광 현미경 검사와 오프 칩프 EISA 분석의 결과이며, 저산소 과도 상태에서 포도당 인슐린 반응에 대한 다중 모드 보기를 구축하기 시작합니다.

일단 숙달되면이 기술은 적절하게 수행되면 이틀 안에 완료 할 수 있으며, 하루는 장치 제작 및 눈꺼풀 세포 분리에, 다른 하루는 눈꺼풀 실험 자체에 사용됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 개발 후 장치의 가스 발생기와 결합하여 전달된 산소 농도를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 태아 배출구 및 기타 조직 미세 생리학 분야의 연구자들이 저산소증과 일시적인 산소 패턴이 당뇨병, 심혈관 및 신경 장애와 같은 질병에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다중 모드 미세유체 장치를 사용하여 산소 조절을 제어하고, 미세 조직을 조작하고, 조직 저산소증에 대한 반복 가능하고 의미 있는 측정을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.