Name: 단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 췌장 섬에서 미세유체 산소 조절을 이용한 간헐성 저산소증 전처리 효과 연구 방법을 실시간 현미경 모니터링과 정확한 산소 전달로 섬 생리학을 이해하는 데 활용합니다.

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이 작품은 건강 보조금 R01 DK091526 (JO), NSF 0,852,416 (DTE)의 국립 연구소와 시카고 당뇨병 프로젝트에 의해 지원되었다.

1. 마우스 독도 준비 <ol><li> C57BL / 6 쥐를 해부 및 콜라게나 소화 피콜 밀도 구배 분리에 의해 섬을 격리 할 것. (2,3에서 참조 조브 기사 참조). </li><li> 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 배양 접시에 20 mM의 HEPES를 포함하는 RPMI-1640 배지에 독도를 품다 (37 ° C, 5 % CO 2). 후 분리, 배양 실험에 사용하기 전에 24 시간 동안 섬. 일관된 결과를 보장하기 위해 1-2 일 안에 독도를 사용합니다. </li></ol> 2. 미세 유체 플랫폼 만들기 <ol><li> 각 장치 계층에 대한 투명성 포토 마스크의 미세 형상을 생성합니다 : 1) 입구와 출구, perifusion 실 2) 포도당 미세 유체 층 (8 mm 직경 × 3 mm의 150 μL), 마이크로 웰 3) 200 μm의 막 (500 μm의 직경, 100 깊은 μM), 4) 가스 미세 유체 층. </li><li> 입구와 출구 층을 제조하기에 탈기, 예비 혼합 된 PDMS를 부어2 시간 동안 80 ° C에서 빈 페트리 접시 및 치료에 1.5 mm의 높이. 2mm 직경의 입력 / 출력 포트를 펀치. </li><li> 글루코스 미세 층을 제조하기 위해, 실리콘 웨이퍼에서 04 번의 700 ㎛의 층을 형성하는 SU8-2150이 350 ㎛의 층을 스핀. <ol><li> 700 μm의 키 마스터를 생산, 개발 후 SU8에 마이크로 패턴을 전송하는 데 적합한 포토 마스크를 통해 UV 빛에 노출됩니다. </li><li> 3mm의 높이로이 마스터에 탈기, 예비 혼합 된 PDMS를 붓고 2 시간 동안 80 ° C에서 치료. 이 컷은 면도날과 모양을 PDMS. </li><li> 2mm 직경의 입력 / 출력 포트들뿐만 아니라 8mm 직경 챔버 펀치. </li></ol></li><li> 마이크로 웰과 200 ㎛ 멤브레인을 제조하기 위해, 100 μm의 SU8-2100 스핀. 이 100 μm의 키 마스터에 마이크로 웰 패턴을 전송하는 동일한 자외선 리소그래피를 적용합니다. <ol><li> 스핀은 30 초 동안 900 rpm에서이 마스터로, 예 혼합 PDMS를 탈기하고 10 분 동안 80 ° C에서 치료. SPI마이크로 웰의 패턴을 포함하는 200 ㎛ PDMS 막으로 인해 발생하는 동일한 조건을 이용하여 제 위에 NA의 두번째 층. </li><li> 이 막을 통해 2mm 직경의 입력 / 출력 포트를 펀치 </li></ol></li><li> 가스 미세 유체 층을 제조하기 위해, 100 μm의 SU8-2100 스핀. 이 100 μm의 키 마스터에 가스 미세 패턴을 전송하는 동일한 자외선 리소그래피를 적용합니다. <ol><li> 1.5 mm의 높이로이 마스터에 탈기, 예비 혼합 된 PDMS를 붓고 2 시간 동안 80 ° C에서 치료. 면도날 모양으로 PDMS를 잘라. </li><li> 이 층을 2mm 직경의 입력 / 출력 포트를 펀치 </li></ol></li><li> , 여러 레이어를 결합, 스카치 테이프로 청소 코로나 아크에 노출 한 후 다음과 같은 순서로 손으로 맞추어을 준비합니다. <ol><li> 마이크로 웰이 위를 향하도록 바닥 가스 층에 막을 본드. </li><li> 마이크로 웰 막 위에 포도당 미세 접합. </li><li> 입구와 출구 층 O를 결합n은 전체 어셈블리를 캡슐화 맨. </li><li> 상단에 1kg의 무게를 추가하고 3 시간 동안 100 ° C에서 소성하여 결합을 강화. </li></ol></li><li> 물에서 장치 전체를 침지 한 후, 수층에 물을 로딩하여 완성 장치를 누설 테스트. 이어서, 빈 주사기와 가스층을 통해 공기 흐름. </li><li> 장치를 사용할 때까지 4 ° C에 저장되어있는 PBS 버퍼와 다음 플러시 수성 층을 70 % 에탄올로 누출이 장치를 소독. </li></ol> 3. Microdispenser 설치 <ol><li> 산소 혼합 및 배달 설정을 구성하는 2 microdispensers, 5 V, 20 V DC 전원 공급 장치, 디지털 I / O 보드를 얻습니다. <ol><li> 포함 된 드라이버 유닛에 microdispensers 통제 리드를 연결합니다. </li><li> 랩뷰 컨트롤에 해당 포트에서 디지털 I / O 보드에 드라이버를 연결합니다. </li><li> 드라이브 유니에 연락처를 대응하는 5 V, 20 V 전원 공급 장치를 연결합니다TS. </li><li> 가스 제어 (부록)을위한 LabVIEW 코드를 실행하는 노트북, 디지털 I / O를 연결합니다. </li></ol></li><li> 반면 다른 압축 공기에, 모두 5 % CO 2와 질소 한 microdispenser를 연결합니다. 2 PSI에 모두 가스를 설정합니다. 이전에 마이크로 유체 장치를 입력하는 T-접합에 디스펜서 &#39;출력을 사용하여 네트워크에 연결한다. </li><li> 누설 검사 장치를 사용하여, (장치 목록 및 대표적인 결과 참조) 광섬유 산소 센서와 물에 용해 된 산소를 측정하면서, 5~21% 산소 사이 microdispensers를 순환시킴으로써 산소 변조의 과도 응답을 특성화. </li></ol> 4. 현미경으로 설정 <ol><li> 거꾸로 현미경의 가열 단계에 장치를 장착합니다. </li><li> 장치에 0 % ~ 21 % O 2 가스를 연결하고 산소 센서를 보정합니다. </li><li> 분수의 집에 포도당 미세 유체의 출력 포트를 연결합니다. </li><li> 크렙스 링거 중탄산에게 준비버퍼 (KRB) : 129 밀리미터의 NaCl, 5 mM의 탄산 수소 나트륨, 4.7 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 1 ㎜ 염화칼슘 2 · 2H 2 O, 1.2 ㎜ 망초 · 7H 2 O, 10 mM의 HEPES 산도 7.35-7.40 2 ㎜ 기저 글루코스, 5 % FBS. </li><li> 원뿔 튜브가 37 ° C의 물을 욕조에 목욕을 50 ㎖에 각각 2 ㎜, 14 mM의 포도당을 포함하는 두 개의 버퍼 솔루션을 준비합니다. </li><li> 튜브에 250 μL / 분에서 버퍼를 그리는 연동 펌프를 연결합니다. 미세 유체 장치를 입력하기 전에 37 ° C의 열판에 튜브를 흐른다. </li><li> 독도를 염색하기 위해, 각각 최종 염료 5 μM의 농도 2.5 μM에 도달 KRB 2 ㎖에 100 % 에탄올에 DMSO 및 Rh123에서의 Fura-2 오전에 추가합니다. </li><li> 10 μL 피펫으로 섬을 선택하고 37 ℃에서 30 분 동안 염료 품어 </li><li> 포도당 마이크로 입구를 통해 장치에 약 20 섬을로드합니다. T 백에 콘센트에서 버퍼를 프라이밍에 의해 챔버에 독도를 직접그는 입구. </li><li> 여분의 염료를 씻어 10 분 동안 버퍼에 독도를 Perfuse. </li></ol> 5. 동시에 산소와 포도당 자극을 실행 <ol><li> 14 mM의 자극의 15 분 뒤에 KRB2에 의해 설립 기준의 5 분으로 포도당 자극 펄스를 제공하고 KRB2에서 15 분 동안 세척한다. </li><li> Rh123 용의 Fura-2와 534 방출 녹음 380분의 340 nm의 여기 파장. </li><li> 각 실험 전에 정상 펄스 (14 mM의 정상 산소)의 측정을 수행합니다. </li><li> 산소 변조 (저산소증 / 간헐적 인 저산소증)의 경우, 만 대류 교란을 최소화하기 위해, 자극과 세척 단계와 다른 단계에있는 아무 흐름 중에 버퍼 흐름을 적용합니다. </li><li> ELISA 인슐린 분석을 위해 1 분 간격으로 혈당 콘센트에서 폐수를 수집합니다. </li></ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
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<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 섬의 저산소증 기술에 통합 된 여러 양식은 현재 몇 점은 문제를 해결하려면 여기 지적했다. 먼저 고립 된 섬이 저하 인해 선방 세포에서 소화 효소에 문화를 분해하는 것을 계속한다. 섬 격리 후 1-2 일 실험을 표준화하면 일관성있는 결과를 얻기에 따라서 중요합니다. 둘째, 수성 유동은 층류 확산 사이의 경계에서 대류 일소 방지 할 저산소증 및 간헐적 저산소증 동안 중단 하였다. 이것은 베이 전처리의 지속 시간을 제한하는 것으로 보인다. 아직도 막에서 빠른 가스 변조를 허용하면서 수성 채널에서 가스 교환의 미래 통합이 작은 간극을 제거 할 수 있습니다. 독도를로드하는 동안 셋째, 수성 튜브는 공기 방울이 방지하기 위해 (콘센트 다음 입구) 역순으로 조심스럽게 다시 연결해야합니다. 마지막으로, 미래의 장치 분포를 돕기 위해 삼진 아웃 미세 유체 분배로 보강 될 수있다사냥꾼 포켓의 배열 패턴 화 될 수있는 바닥에, 전체 챔버를 통해 독도의 클러스터 테. 포켓 배열 외에 추가로이 마이크로 유체 분포는 높은 처리량 실험 독도의 위치...

동적 저산소증은 특히 섬 이식, 생물학에서 중요하다 동적 저산소증은 많은 생물 조직에서 중요한 생리뿐만 아니라 병리 생리 학적 매개 변수입니다. 산소의 변화는, 예를 들어, 혈관 신생의 잠재적 발달 신호이다. 또한, 저산소증에 공간과 시간적 패턴 HIF1 - 알파를 조절하고 췌장 암과 같은 질병에 역할을한다. 저산소증은 섬 이식 결과에 영향을 미치는 교란 요인이다. 최근, 저산소증, 또는 간헐적 인 저산소증 (IH)의 시간적 진동은 &quot;사전 조정&quot;독도 1에 혜택을 증명하고있다. 그러나, 섬의 생리에 대한 정적 및 과도 모두 저산소증 효과는 잘 주로 섬의 미세 환경을 제어하는​​ 적절한 도구의 부족으로 이해하고, 공부 못하고있다. 독도 아니라 생체 내에서 혈관이 있습니다 췌장은 50-400입니다<html> 56, 베타 세포와 포도당 항상성에 대한 책임은 알파 세포를 포함한 내분비 세포의 M의 구상 집계. 독도 ATP에 민감한 칼륨 (K ATP) 채널과 인슐린 과립의 세포 외 유출을 유발 칼슘 유입의 결과를 열어 ATP 생산에 혈액, 흡수와 작용 리드 자극 포도당에 노출 된 경우. 산소이 심하게 대사 프로세스를 구동 및 인슐린 분비가 현저 글루코스 구배 이외에 혈류와 산소 공급의 역학에 의해 영향 중요하다. 그들은 높은 각, 췌장 관류대로 독도는 쉽게 모세 혈관에서 하나의 셀 길이 내에서 생체 내에서이 포도당 - 인슐린 반응을 수행 할 수 있습니다. 그러나 intraislet 모세관의 고밀도 네트워크는 아일렛 분리 2,3 동안 콜라게나 제에 의해 제거된다. 따라서, 산소와 영양소를 모두 공급으로 인해 확산 제한으로 100 μm의 경계에 제한됩니다. 섬의 미세 환경을 다시 단계 &quot;&gt; 현재 기술은 제한된 성공 다시 섬의 원시 산소와 포도당 역학, 생리 및 병리 생리 학적 조건을 모델링의 핵심은 정교한 흐름을 필요로하고 섬 기능의 지속적인 모니터링이 부족 표준 저산소 챔버로 달성하기가 어렵습니다. 또한, 유형 이식 치료는 I 당뇨병은 췌장 생리 (5.6 %, 40 mmHg로)에 비해 훨씬 낮은 PO 2 (&lt;2 %, 5 ~ 15 mmHg로) 가지고 간 포털 시스템 4 저산소증에 고립 된 섬을 노출합니다. 이식 후, 섬 이식은 revascularized 될 2 주 이상 걸릴. 이는 저산소 노출 아일릿의 포도당 - 인슐린 결합 메커니즘을 손상하는 것이 증명되었다. 자극 - 분비 커플 링 인자, 칼슘 신호, 미토콘드리아의 잠재력, 인슐린 반응 속도 사이에서 쉽게 미세 유체를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 이전의 마이크로 유체 기술이 재 입증알 - 시간이 하나의 섬 5,6 주위의 수성 미세 환경의 정확한 조절과 모니터링. 그러나, 섬의 저산소 성 손상의 정량화 동시 자극 및 모니터링 기술의 부족에 의해 좌절된다. 따라서, 산소 및 아일릿 모니터링 미세 유체 제어 결합 아일릿 저산소증 연구를 향상시킬 수있다. 미세 유체는 수성과 산소 미세 환경을 재현하고 변조 할 수있다 조직 문화 저산소증 연구를위한 표준 기술은 저산소 챔버를 기반으로하고있다. 일반적으로, 저산소 챔버 분 스케일 동적 저산소증과 호환 ~ 10 ~ 30 분의 평형 번에 하나의 산소 농도를 제공합니다. 최근 두 연구는 포도당에 의한 인슐린 반응 7,8에 상반되는 결과로, 전체 마우스에 간헐적 저산소 노출 작은 사용자 지정 챔버를 사용했다. 전체 동물 수준에서, 호흡으로 산소가 직접 트란 아니라는 것을 명심인해 호흡기의 컨트롤에, PO 2 모세관 섬 예정. 또한,이 연구는 표준화 된 산소 수준이 없습니다 없으며 독도의 조직 수준에서 실시간 측정을 제공 않습니다. 한편, 산소 가스가 미세 유체 채널 네트워크를 통해 산소를 제어함으로써, 이러한 한계를 넘어 설 수있다. 또한, 미세 유체는 산소 변조시 표준​​ 저산소 챔버와 위업하실 수 없습니다 라이브 영상과 호환됩니다. 이러한 신규 한 마이크로 유체의 숫자는 표적 세포 9-14 위에 미디어 흐름 마이크로 채널에 산소 농도를 용해 된 폴리 디메틸 실록산의 가스 투과성을 이용하는 접근한다. 이 소자는 또한 다수의 이산 산소 농도, 형광 기반 산소 센서 및 온 - 칩에서도 화학적 산소 발생을 통합 하였다. 액체 매화 기반의 미세 유체 내가으로 힘든 시간을 안정적, 지속적으로 그라데이션을 유지하는이T 조건 흐름에 민감하다 대류 혼합에 따라 달라집니다. 비교에서, 우리는 여기에 사용 된 기술은 산소 전달의 확산 경로를 감소에 초점을 맞춘다. 가스 매화 전단 흐름은 직접 세포 나 췌장 조직의 시드 막에 걸쳐 산소를 확산에 의해 제거된다. 이 매화를 제어하는​​ 데 필요한 여분의 마이크로 유체를 제거하고 그 자체가 인슐린 분비를 트리거 할 수있는 섬, 불필요한 전단 응력을 방지 할 수 있습니다. 이 플랫폼은 활성 산소 종 (ROS)을 설명하는 데 사용 된 최대 규제 세포 배양 1.15의과 산소 저산소 두 극단 (2-97%의 O 2)에서. 때문에 산소와 전단 흐름의 제거를 직접 배달에, 우리의 확산 기반 플랫폼은 섬 저산소증 공부를위한 최적의 미세 유체 솔루션을 제공합니다. 모드의 자극 및 모니터링 섬 마일을 공부에 적용 할 때 확산 기반의 미세 유체는 또한 추가 혜택을 제공합니다crophysiology. 확산 장벽 막을 사용함으로써, 액체는 저산소 자극 독립적 수성 글루코스 자극의 컨트롤을 가능하게 산소 변조로부터 단리 할 수​​있다. 이는 독도에 대한 공간적으로 핀 포인트 배달 샌드위치 같은 동시 자극을 만듭니다. 가스가 일시적으로 컴퓨터 microinjectors를 통해 변조 더욱이, 우리는 60 초 미만의 과도와 디지털 21-0% 산소 농도를 조절 할 수 있습니다. 현미경의 산소와 포도당의 미세 환경의 동적 컨트롤은 표준 저산소 챔버를 사용 불가능하거나 매우 성가신되지 않을 것 실시간 멀티 모드 프로토콜을 할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여, 칼슘 신호 (의 Fura-AM), 미토콘드리아 전위 (로다 민 (123)), 및 인슐린 속도론 (ELISA)을 저산소 하에서 동적 포도당 인슐린 반응의 완벽한 그림을 제공하기 위해 모니터링되었다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">< 강력 > 시약 / 재료< / 강력 ></td></tr> <tr><td>스피너</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150 / SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>디지털 핫 플레이트</td><td>PMC 데이터 플레이트</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 램프</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>다우 케미컬</td><td>실가드 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona Wand</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 디스펜서</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5V 및 20V DC 전원</td><td>라디오 판잣집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>산소 센서</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>거꾸로 된 epifluorescence 현미경</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔 관</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 형광 염료</td><td>분자 프로브, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 형광 염료</td><td>분자 프로브, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>문화 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 in 실리콘 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 in x 1/8 in</td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 인치 및 4mm</td></tr><tr><td>주사기 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>암 Luer 플러그 1/16 인치</td></tr><tr><td>스트레이트 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 in</td></tr><tr><td>엘보우 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 인치</td></tr></tbody></table>

단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

하나의 기술에서 포도당 자극 분비 커플 링 요소를 동시에 산소 및 모니터링은 특히 이식 환경에서, 섬 저산소증의 병리 생리 학적 상태를 모델링하는 것이 중요합니다. 기본 저산소 챔버 기술은 동시에 자극을 변조 또는 이용 글루코스 자극 - 분비 커플 링 요소의 실시간 모니터링을 제공 할 수 없다. 이러한 어려움을 해결하기 위해, 우리는 확산 막을 통해 수성 및 가스 위상 변조 모두를 통합하는 다층 마이크로 유체 기술을 적용 하였다. 이 형광 현미경을 통해 상기 커플 링 요소의 모니터링을 가능하게 투명 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치 내의 microscaled 섬 주위에 자극 샌드위치를​​ 만듭니다. 또한, 가스 입력은 0-21% 간의 산소의 정량적, 정 분 변조를 제공 microdispensers의 쌍에 의해 제어된다. 이 간헐적 저산소증이 섬의 새로운 현상을 조사하기 위해 적용T 전처리. 또한, 복합 현미경으로 무장 한, 우리는 이러한 저산소 발생시 상세한 칼슘과 K ATP 채널 역학 볼 수 있었다. 우리는 독도를 공부뿐만 아니라 많은 생체 조직에 가치있는 도구로, 미세 유체 저산소증, 특히이 동시 듀얼 위상 방법을 구상.

이 섬의 저산소증 기술의 중심이 분 규모의 과도와 같은 마이크로 유체 챔버에서 수성과 기상 자극을 조절하는 기능입니다. 그림 1)의 대표 결과 섬의 챔버 내에서 측정 된 듀얼 자극 및 B) 빠른 변조. 챔버에 형광의 도입으로 도시 수성 변조, 혼합 3-4 분 균형을 달성한다. 또한, 산소는 2 분 정도로 짧은 기간에 산소의 순환을 가능하게 빠른 과도로 5-21% 강화 될 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이 서로 다른 순환 안쪽과 주파수는 성취 될 수있다. 이 순환은 아일렛에 간헐적 저산소증을 생성인가되면 일반, 정상 산소 펄스,도 3a에 비해, 하나는 저산소증에 대해 독도 전처리의 이점을 관찰 할 수있다. 세포 내 칼슘 플럭스 신호 mechanis 때문에인슐린의 분비가 M-되어 실시간으로 모니터링, 저산소증과 IH의 효과는 칼슘 과도, 그림 3b의 오버 ...

미세 유체 산소 제어 생물학적 실험 저산소 챔버를 통해 단지 편리함과 속도보다 더 부여. 막을 통해 확산을 통해 구현 특히, 미세 유체 산소 마이크로 수준에서 동시 액체 및 기체 상 변조를 제공 할 수있다. 이 기술은 섬의 병태 생리를 연구하는 동적 멀티 파라미터 실험은 중요 할 수 있습니다.

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마이크로 규모의 췌도에 분 단위로 조절된 간헐적 저산소증을 적용하여 사전 적응 효과를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 얇은 가스 투과성 막을 갖춘 다중 모드 미세유체 장치를 제작합니다. 두 번째 단계는 컴퓨터 제어 산소 조절 시스템을 구축하는 것입니다.다음으로 아이렛(eyelet)을 장치에 조심스럽게 장착한 후, 액체 및 산소 미세유체 장치를 연결합니다. 마지막 단계로, 산소 조절 중에 변화하는 아이렛 파라미터를 시각화하기 위해 현미경 관찰과 다중 모드 미세유체 시스템의 동작을 조정합니다. 최종적으로, 아이렛 간헐적 저산소증 기법을 사용하여 저산소 상태에서 포도당 반응이 명확하게 손상됨을 보여줍니다.저산소증의 시간적 조절을 통해 안구 조직이 손상을 덜 입으면서 반응하도록 훈련시킬 수 있습니다. 용존 산소 조절이나 저산소 챔버 사용과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 복잡한 흐름으로 인한 전단 응력 없이 매우 짧고 미세한 시간 간격으로 정확한 산소 농도를 안검에 전달할 수 있다는 점입니다.또한 바닥 및 현미경 관찰을 통한 실시간 모니터링이 가능합니다. 이 마스터는 이식 부위의 저산소성 손상을 정의하거나 이식 결과를 개선하기 위한 전처치 요법을 결정하는 것과 같이, Alli 이식 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 따라서 이 방법은 Alli 저산소증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 방법은 중추신경계, 심장 조직, 신장 및 기타 이식 장기와 같은 다른 조직 및 계통에도 적용할 수 있습니다. 장치 제작 및 아이렛(eyelet) 취급의 많은 부분이 까다롭기 때문에 이 방법에 대한 비디오 시연이 매우 중요합니다. 이 기술은 새로운 학제간 특성으로 인해 단계를 학습하기 어렵지만, 도전적이거나 익숙해지면 효율적입니다. 먼저 미세유체 장치의 커버 층을 제작하는 것부터 시작하십시오.이를 위해 미리 혼합된 PDMS를 빈 페트리 접시에 1.5 millimeters 높이로 붓고 80 degrees Celsius에서 2시간 동안 경화시킵니다. 다음으로, 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 350 micron 두께의 SU 8 21 50 층을 두 번 스핀 코팅하여 총 700 micron 두께의 단일 층을 형성함으로써 퍼퓨전 챔버 마스터가 포함된 글루코스 미세유체 층을 제작합니다. 그런 다음, 글루코스 미세유체 층 포토마스크를 사용하여 UV 광선을 조사해 SU eight 층에 미세채널 패턴을 전사합니다.SU-8 현상액으로 노광되지 않은 부분을 씻어냅니다. 다음으로, 미리 혼합된 DGA의 PDMS를 MA 위에 3 mm 높이까지 붓고 80 °C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 포도당 미세유체 층을 모양에 맞게 절단하고, 2 mm 펀치를 사용하여 입구 및 출구 포트를 형성하며, 8 mm 직경의 펀치로 메인 챔버를 형성합니다.다음으로, 깨끗한 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 SU 8 2100을 100 micron 두께로 스핀 코팅하여 눈꺼풀 고정용 마이크로웰 마스터를 제작하고, UV 리소그래피를 사용하여 이 층에 마이크로웰 패턴을 전사합니다. 마이크로웰 마스터가 완성되면 현상액으로 노출되지 않은 영역을 씻어냅니다. PDMS를 900 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅하고, 각 층을 80 °C에서 10분 동안 경화시켜 100 micron 두께의 층을 두 번 추가합니다.완료되면, 입구 및 출구 포트에 2 mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 마지막으로, 이전 층과 동일하게 SU 8 2100을 100 µm 두께로 스핀 코팅하여 가스 미세유체 마스터를 제작하고, UV 리소그래피를 사용하여 가스 미세유체 패턴을 다시 전사합니다. 현상액으로 노광되지 않은 영역을 씻어냅니다.다음으로, 가스 미세유체 마스터 위에 PDMS를 1.5 millimeter 두께로 붓고 80 °C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 그 후 면도날을 사용하여 PDMS를 모양에 맞게 절단합니다. 이어서 다른 층들의 포트 위치와 일치하도록 커버 층에 2 millimeter 직경의 입구 및 출구 포트를 뚫어 여러 층을 서로 결합합니다.먼저, 스카치테이프로 표면을 세척하고 코로나 아크(Corona arc)에 노출시킨 후, 다음 순서에 따라 레이어를 수동으로 정렬하여 준비합니다. 우선, 마이크로웰이 위를 향하도록 하여 멤브레인을 하단 가스 레이어에 접합합니다. 그다음, 마이크로웰 멤브레인 위에 포도당 미세유체 레이어를 접합합니다.마지막으로, 가장 윗부분에 입구 및 출구 층을 접합하여 전체 조립체를 캡슐화합니다. 조립체 상단에 1kg 무게추를 올려 단단히 접합되도록 돕고, 100 °C에서 3시간 동안 베이킹합니다. 그 후 누설 검사를 수행합니다.수성층에 물을 채우고 장치를 침전시킨 후, 시린지를 사용하여 기체층으로 공기를 흘려보내며 누수 여부를 확인하여 장치를 테스트합니다. 마지막으로, 누수가 없는 장치의 수성층에 70% ethanol을 1~2분 동안 통과시켜 멸균합니다. 마이크로 디스펜서 제어 리드를 포함된 드라이버 유닛에 연결하여 마이크로 디스펜서를 설정합니다.그 다음, 드라이버를 LabVIEW 컨트롤에 해당하는 디지털 IO 보드의 포트에 연결합니다. 이어서 5 V 및 20 V DC 전원 공급 장치를 드라이브 유닛의 해당 접점에 연결하고, 동봉된 텍스트 프로토콜의 부록에 설명된 가스 제어용 LabVIEW 코드를 실행하기 위해 디지털 IO를 노트북에 연결합니다. 그런 다음 하나의 마이크로 디스펜서를 질소에, 다른 하나를 5% 이산화탄소가 포함된 압축 공기에 연결하고, 두 가스 모두 2 PSI로 설정합니다. 디스펜서 출력단을 T-접합부(T junction)로 연결하여 마이크로 유체 소자로 들어가게 합니다.다음으로, 장치에 0% 및 21% 산소를 연결한 후 도립 현미경의 가열 스테이지 위에 장치를 장착하십시오. 그다음 장치의 유체 배출구에 광섬유 산소 센서를 배치하여 배출구 내의 용존 산소량을 실시간으로 측정하십시오. 그런 다음 장치를 연동 펌프에 연결하고 250 µL/min의 속도로 장치에 물을 흘려보내기 시작하십시오.마이크로 디스펜서를 5%와 21% 산소 농도 사이에서 주기적으로 변경하여 산소 조절의 과도 응답을 특성화합니다. 연동 펌프를 미세유체 장치에 연결하고, 유체가 장치에 들어가기 전 가열될 수 있도록 튜브를 37 °C 가열판 위에 배치합니다. 또한, 포도당 미세유체 출력 포트를 분획 수집기에 연결합니다. C 57 black six 마우스를 해부하고, 조직 분리 후 JoVE에서 제공하는 다음 영상들에 설명된 콜라게나제 소화 및 Ficoll 밀도 구배 분리법을 통해 췌도 세포를 분리합니다.10% FBS, 1% penicillin streptomycin 및 20 millimolar HEPES가 포함된 RPMI 1640 배지가 담긴 페트리 접시에서 안구 조직편(eyelets)을 24~48시간 동안 배양하십시오. 일관된 결과를 얻기 위해 안구 조직편을 2일 이내에 사용하십시오. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2 millimolar glucose를 포함하는 용액과 14 millimolar glucose를 포함하는 용액을 각각 준비하여 신선한 Krebs ringer bicarbonate 완충액을 제조하십시오.50 mL 원추형 튜브에 담긴 용액들을 37 °C 항온수조에 넣어 가온합니다. 그다음, 2 mM glucose가 포함된 Krebs 완충액 2 mL에 5 µM 4:02 AM 및 DMSO와 2.5 µM RH 1 23 및 100% ethanol을 첨가하여 분리된 eyelet용 염색액을 준비합니다. 다음으로, 10 µL 피펫으로 eyelet을 채취하여 37 °C에서 30분 동안 염색액에 배양합니다.염색이 완료되면 포도당 마이크로채널 입구를 통해 약 20개의 아이렛(eyelet)을 장치에 로딩합니다. 배출구에서 입구 방향으로 버퍼를 프라이밍하여 아이렛을 챔버 내부로 유도합니다. 그 다음, 과잉 염색약을 씻어내기 위해 아이렛과 버퍼를 10분 동안 관류합니다.먼저, 정상 맥박 기선을 설정하기 위해 2 mM Krebs ringer bicarbonate 완충액을 5분 동안 시스템에 흘려줍니다. 그 다음, 14 mM 포도당 완충액으로 15분 동안 챔버를 자극하고, 이어서 2 mM 포도당 완충액으로 15분 동안 세척합니다. 이 과정 동안 340 nm와 380 nm로 여기시켜 두 가지 방출의 510 nm를 기록합니다.또한, 염료를 480 nm에서 여기시켜 RH 1 23의 530 nm 방출광을 기록하십시오. 산소 조절 중 대류 교란을 최소화하려면 자극 및 세척 단계 동안 버퍼 흐름을 적용하고, 테스트 중 다른 단계에서는 흐름을 반드시 중단하십시오. 이 비디오에서 보여준 미세 유체 접근 방식을 이용한 추가 분석에 사용하기 위해 글루코스 배출구에서 1분 간격으로 유출액을 수집하십시오. 컴퓨터 제어 마이크로 인젝터를 사용하면 얇은 PDMS 막을 지나 흐르는 산소의 백분율을 빠르게 조절할 수 있습니다.여기 1분에서 6분까지 범위의 조절 예시가 있습니다. 또한, 5%에서 21% 사이의 산소를 공급함으로써 2ppm에서 8.5ppm 사이의 산소 농도를 1분 미만 단위로 정량적으로 조절하는 것도 가능합니다. 파란색 선은 공급된 산소의 백분율을 나타내며, 녹색은 그 결과로 나타난 ppm 단위의 용존 산소량을 나타냅니다. 이러한 사이클링을 적용하여 안구 혈관(eyelets)에 간헐적 저산소증을 유도하면, 불규칙한 정상 산소 분맥과 비교하여 저산소증에 대한 안구 혈관의 사전 적응(preconditioning) 효과를 확인할 수 있으며, 이는 처리 후 개선된 비율을 통해 관찰할 수 있습니다. 저산소증과 간헐적 저산소증의 효과는 여기 파란색으로 표시된 정상 산소 반응과 비교하여 칼슘 과도 응답(calcium transients)의 오버슈트 및 진동 감쇠에서 관찰할 수 있습니다.빨간색은 저산소 응답이며, 녹색 선은 조건화된 저산소 응답입니다. 여기에는 칼슘, 미토콘드리아 전위 및 인슐린의 측정값이 표시되어 있습니다. 이는 실시간 형광 현미경 검사와 시스템의 미세유체 유출액을 이용한 오프칩(off-chip) ELISA 분석의 결과입니다. 이들을 종합하면 저산소 일시 상태에서의 포도당-인슐린 응답에 대한 다중 모드 뷰를 구축하기 시작할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있으며, 하루는 장치 제작 및 안검 세포 분리에 소요되고 나머지 하루는 안검 실험 자체에 소요됩니다. 이 절차를 시도할 때, 장치 개발 후 가스 분석기를 통해 공급된 산소 농도를 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 태아 조직 및 기타 조직 미세 생리학 분야의 연구자들이 저산소증과 일시적인 산소 패턴이 당뇨병, 심혈관 및 신경계 질환과 같은 질병에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 다중 모드 미세유체 장치를 사용하여 산소 조절 방법을 제어하고, 미세 조직을 조작하며, 조직 저산소증에 대해 재현 가능하고 의미 있는 측정값을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다.

Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.

비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

여기에서는 가능한 교란 요인을 감소시키면서 내분비 췌장 기능을 평가하기 위한 추가 기술로 온전한 췌장이 있는 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통해 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 수행하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

온전한 췌장을 가진 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통한 포도당 자극 인슐린 분비

이 프로토콜은 이중층 미세유체 칩을 제작하고 급격한 산소 진동에서 미생물 성장을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 장치의 성능은 유체 채널에서의 산소 감지와 미생물 배양을 통해 검증되었습니다.

Microfluidic Double-layer Device를 사용한 미생물 단일 세포 성장 분석에서 빠른 산소 진동 생성

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 췌장 섬에서 미세유체 산소 조절을 이용한 간헐성 저산소증 전처리 효과 연구 방법을 실시간 현미경 모니터링과 정확한 산소 전달로 섬 생리학을 이해하는 데 활용합니다.

단일 베이 수준에서 산소 미시의 양 및 시간 제어

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