단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 또는 면역 분석을 사용하여 단일 세포 용해물을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 장치를 만들고 내부 챔버를 항체로 코팅함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단세포는 트랩에서 고정되고 다양한 시약에 노출되어 두 번째 단계에서 세포 반응을 자극합니다.

링 모양 밸브가 빠르게 닫히고 용해 버퍼가 장치를 통해 흐릅니다. 고리 모양의 판막은 짧은 시간 동안 열리고 세포가 마이크로 챔버 내에서 용해되어 방출된 단백질이 부피가 작기 때문에 고농도로 항체에 결합할 수 있습니다. 다음으로 링 모양의 밸브가 열립니다.

챔버가 세척되고 검출 시약이 밀폐된 마이크로 챔버에 도입됩니다. 형광 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 형광 강도의 증가를 모니터링하며, 그 결과는 개별 세포에서 방출된 관심 분석물을 정량적이고 안정적으로 검출할 수 있는 이 시스템의 능력을 보여줍니다. 이 방법은 단일 A 세포 분석 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

특히, 화학적 환경의 변화에 대한 세포 반응에 대한 체계적인 조사를 수행했습니다. 우리는 화학적 자극의 결과로 세포 내 분자의 상향 또는 하부 조절을 볼 수 있습니다. 이 기술에는 두 가지 주요 장점이 있습니다.

첫 번째는 고정되지 않은 세포를 일정하거나 주기적으로 변하는 정의된 화학적 환경에 노출시킬 수 있다는 것입니다. 둘째, 교차 오염이나 운송으로 인한 분석물 손실 없이 염료의 매우 민감하고 특이적인 분석을 개혁할 수 있습니다. 먼저, 수반되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3개의 서로 다른 SU 8 마스터 웨이퍼를 제작한다.

하나는 유체 층을 만드는 데 사용되고, 하나는 제어 층에, 세 번째는 마이크로 접촉 스탬프를 만드는 데 사용됩니다. 그런 다음 PDMS와 경화제의 10:1 혼합물의 준비로 시작하는 미세유체 칩을 제작합니다. 두 부분을 세게 혼합하고 30분 동안 또는 혼합물에 거품이 없어질 때까지 용액의 가스를 제거합니다.

다음으로, 페트리 접시 내부의 제어 층 내에 있는 웨이퍼를 놓고 바닥에 테이프로 붙입니다. 그 위에 약 50g의 PDMS를 부어 4-5mm 두께의 층을 만들고 PDMS의 완전한 경화를 보장하기 위해 섭씨 80도의 오븐에 웨이퍼를 최소 2시간 동안 놓습니다. 마이크로 접촉 인쇄 웨이퍼에 대해 동일한 절차를 반복하되 50g 대신 약 20g의 PDMS를 사용하여 4-5mm 두께의 PDMS 층을 만듭니다.

바닥 층을 준비하려면 미세유체 층이 있는 웨이퍼에 40미크론 높이의 PDMS 층을 스핀 코팅합니다. 2000 초 동안 60 RPM의 회전 속도를 사용합니다. 모든 부품이 경화되면 섭씨 80도의 오븐에서 1시간 동안 PDMS 층을 경화합니다.

웨이퍼에서 제어 층을 제거하고 면도날 보조 장치로 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1mm 생검 구멍을 뚫어 압력 연결 구멍을 뚫고 보관을 위해 테이프로 채널을 덮습니다. 다음으로, 마이크로 컨택트 인쇄 웨이퍼 위에서 PDMS를 제거하고 챔버 영역 크기의 스탬프를 준비합니다.

사용할 때까지 서랍에 먼지가 없는 상태로 보관하십시오. 그런 다음 스핀 코팅된 웨이퍼와 4-5mm 두께의 제어 층을 플라즈마 클리너에 넣습니다. 0.75mbar의 산소 플라즈마를 사용하여 18와트에서 45초 동안 조각을 노출시킵니다.

플라즈마 처리 후 작동 거리가 큰 현미경으로 두 층을 빠르게 정렬합니다. 웨이퍼에서 PDMS를 쉽게 제거할 수 있도록 배치된 상단 부품 주위에 여분의 PDMS를 추가합니다. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 80도의 오븐에 최소 1시간 동안 넣습니다.

경화되면 메스를 사용하여 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 제거하고 1.5mm 생검 천공으로 유체 연결을 위한 마이크로칩 펀치 액세스 구멍을 잘라냅니다. 또한 200마이크로리터 피펫 팁의 상부를 절단하고 여분의 반경화 PDMS를 사용하여 마이크로칩에 저장소를 만듭니다. 위에 붙입니다.

그런 다음 섭씨 80도의 오븐에서 최소 1시간 동안 칩을 경화시킵니다. 먼저 유리 슬라이드와 PDMS 부품을 청소합니다. 비누로 유리 슬라이드를 청소하십시오.

증류수로 헹구고 다시 에탄올로 헹굽니다. 질소 흐름을 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 테이프를 사용하여 PDMS에서 이물질과 먼지 입자를 제거합니다.

그런 다음 PDMS 부품과 청소된 유리를 놓습니다. 18와트에서 45초 동안 플라즈마 클리너에 밀어 넣어 단단히 접착되도록 하고, 플라즈마 처리 후 5분 동안 칩을 핫 플레이트에 올려 놓습니다.접착 후 200마이크로리터 피펫 팁 몇 개의 하단 부분을 잘라냅니다. 10-15마이크로리터의 4%BSA가 함유된 여과된 PBS를 채우고 장치의 입구에 넣습니다.

그런 다음 10-15 마이크로 리터의 PBS가 추가 된 절단 팁을 사용하여 제어 채널에 넣으십시오. 다음으로, 칩을 원심분리기에 넣고 5분 동안 중력의 800배로 회전시켜 채널을 유체로 채웁니다. 채널에 공기가 남아 있으면 채널이 완전히 채워질 때까지 이 단계를 반복합니다.

차단 용액을 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 분당 10마이크로리터의 유속으로 PBS를 사용하여 유체 층에서 용액을 세척합니다. 이 장치는 이제 주사기 펌프를 사용하여 깨끗한 페트리 접시에서 0.5% 비오틴화된 BSA가 포함된 PDMS 마이크로 접촉 인쇄 스탬프를 배양하는 면역분석용 유리 슬라이드를 사전 인쇄하기 위한 세포 실험을 수행할 준비가 되었습니다.

30 분 후, 증류수로 스탬프를 철저하고 신속하게 청소하고 질소 흐름으로 스탬프를 건조시킵니다. 건조되면 세척된 유리 슬라이드에 스탬프를 빠르게 올려 패턴이 있는 비오틴화된 BSA를 침전합니다. 스탬프를 놓은 후에는 움직이지 말고 스탬프가 유리 슬라이드에 닿아 있는지 확인하십시오.

약간이 아니라면 스탬프를 두드리되 세게 누르지 마십시오. 그런 다음 플라즈마 챔버에 미세 유체 칩의 상단 부분과 함께 스탬프를 놓고 45 초 동안 18 와트의 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 플라즈마 처리 후 유리 슬라이드에서 스탬프를 제거하십시오.

표면에서 숨을 쉬면 패턴이 보입니다. 인쇄된 표면 위에 마이크로 챔버를 정렬합니다. 정렬이 완료되면 칩을 섭씨 50도의 핫 플레이트에 30분 동안 올려 놓고 나머지 표면을 막고, 앞서 그림과 같이 PBS의 4% 멸균 여과 BSA 용액을 원심 분리기로 칩에 주입하고, 마이크로칩을 최소 30분 동안 배양한 다음 분당 10마이크로리터의 유속으로 PBS로 유체 층에서 용액을 세척합니다.

주사기 펌프를 사용하여 칩을 직접 사용하거나 습한 상자에 넣어 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관하십시오. 다음으로, PBS의 아바돈을 저장소에 도입하여 완전한 기능을 갖춘 결합 표면을 만듭니다. 나중에 유체 채널을 통해 아바돈을 끌어오기 위해 용액을 흐르게 합니다.

저장소를 철저히 헹구고 PBS로 채널을 세척합니다. 그런 다음 단백질 G를 저장소에 추가하고 채널을 통해 당깁니다. 저장통과 칩을 PBS로 헹궈 여분의 단백질 G를 씻어냅니다.

다음으로, 관심 항체를 저장소에 추가하고 채널을 통해 흐릅니다. 그런 다음 PBS로 채널을 형광으로 세척하기 전에 결합을 허용하기 위해 흐름을 중지하고, 라벨이 붙은 아날로그를 사용하여 세포를 채널에 도입하기 전에 인쇄 공정의 품질을 확인할 수 있습니다. 여기에 표시된 HE 2 9 3 세포와 같은 부착 된 세포를 효소가없는 분리 완충액을 사용하여 수확 한 다음 여과하여 세포 클러스터의 수를 줄이기 위해 여과 한 후 주사기에 적재합니다.

300에, 밀리리터 당 000의 세포, 이들과 같은 접착성 세포를 위한 분당 10에서 20 마이크로리터의 비율로 대략 3 분 동안 주사통 펌프에 앞으로의 교류를 사용하여 칩에 세포를 적재하십시오 함정이 채워질 때 세포의 비 특정한 부착을 방지하기 위하여 3개의 막대기로 최상층을 가압해서 약실을 닫으십시오. 그런 다음 현미경을 사용하여 챔버를 검사합니다. 많은 세포가 챔버 내부 표면에 비특이적으로 부착되어 있는 것으로 확인되면 신속하게 세포를 열고 분당 10-30마이크로리터의 유속으로 세포 해리 버퍼로 씻어내십시오.

포도당 6 인산염 탈수소효소 또는 G 6 PDH 분석의 경우 2 밀리몰 포도당, 6 인산염 0.5 밀리몰, DP 0.5 유닛 / 밀리리터 DIA 어레이 및 0.3 밀리몰 RIN을 용해 완충액에 추가하고 잘 혼합되었는지 확인합니다. 채널이 제거되면 분당 30마이크로리터의 유속으로 칩을 통해 G six PDH 용해 버퍼를 끌어옵니다. 용해 완충액이 흐르고 있을 때 챔버를 빠르게 열고 닫은 후 500밀리초 동안 열어 두어 용해가 운동 반응을 모니터링하기 시작한 직후 챔버에 용해가 들어갈 수 있도록 합니다.

이 예에서는 형광 제품을 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 주황색 식품 염료로 채워진 다음 마이크로 챔버 위의 제어 층에 압력을 가하여 닫힌 챔버의 배열입니다. 챔버 폐쇄 후, 챔버의 견고성을 보여주기 위해 채널을 통해 녹색 식품 염료를 헹궈냈습니다.

각 챔버에는 lys 세포에서 방출되는 분자의 농도를 분석에 충분히 높게 유지하는 625피코리터의 유체 부피만 포함되어 있습니다. 또한, 밸브는 챔버 간의 교차 오염을 제거하는 방식으로 열고 닫을 수 있습니다. 이러한 챔버 내에서는 단일 PMA 활성화 U 9 37 세포에서 방출되는 리소솜의 양과 같은 분석물을 측정할 수 있으며, 이는 챔버 내 형광 분자의 생성을 효소로 촉매하기 때문입니다.

녹색 선은 한 세포가 차지하는 챔버에 대한 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 나타냅니다. 또한 검은색 점선으로 표시되는 세포가 없는 챔버의 형광 강도도 표시됩니다. 비교를 위해 이 분석법은 세포 내 효소 G six PDH를 측정하여 독성 분자가 멤브레인 무결성에 미치는 영향을 보여줍니다.

검은색 선은 독성 영향이 없는 대조군 샘플을 나타내고, 주황색 선은 표시된 독소의 영향을 받는 세포를 나타냅니다. 다음은 세포 내 단백질에 대한 면역 분석의 예입니다. GFP 항 GFP 항체는 표면에 고정되고 세포가 용해되면 GFP 단백질의 결합 동역학을 잔디 현미경을 사용하여 시각화했습니다.

시간 0.1은 시간 0.2 GFP가 표면에 축적되기 시작할 때 용해 버퍼가 도입됨을 의미하며, 이는 세포 용해가 발생하고 GFP가 표면으로 확산되었음을 의미합니다. 항체에 대한 GFP의 결합은 시간 0.3에서 완료됩니다. 이 마지막 예에서는 표면에서 항체를 포획하기 위해 결합된 유리된 GA DH와 HRP 결합 검출 항체가 추가되었습니다.

모든 비결합 검출 항체가 씻겨 나가면 검출 시약이 도입되고 시간이 지남에 따라 반응이 이루어졌습니다. 다음은 이 방법을 사용하여 측정된 U 9 37 및 HEC 2 93 세포 사이의 동물 수량에서 이전 세포 내 GA DH의 양을 비교한 것입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 미세유체 칩을 준비하는 방법, 면역 분석이 가능하도록 표면을 수정하는 방법, 마지막으로 단일 세포 분석을 위해 장치를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 방법은 단세포 생물학 분야에서 많은 질문을 촉발하는 데 도움이 되는 데 사용할 수 있습니다.