Name: 단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 배우세요 단일 세포 분석을 위한 미세유체 칩 기술로 형광 및 면역분석을 활용하여 세포 내 단백질을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 세포 이질성 연구에 활용됩니다.

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저자는 기꺼이 원고, 맞춤형 압력 제어 시스템의 건설을위한 C. Bärtschi 및 H. 벤츠의 증거 독서 톰 로빈슨을 인정합니다. 우리는 또한 클린 룸 시설 FIRST 두 ETH 취리히에서 빛을 현미경 센터 (LMC)의 사용을 인정하고 싶습니다. 작품은 7 번째 프레임 워크 프로그램 (ERC 그랜트를 시작, 프로젝트 없음. 203428, nμLIPIDs)에서 머크 세로 노, 유럽 연구위원회 (ERC)에 의해 투자되었다.

1. SU-8 마스터 제작 다음과 같은 프로토콜을 사용하지만 서로 다른 마스크 패턴 (회로도 및 치수는 그림 2 참조, 유체 제어) 채널을 모두 마스터 금형을 준비합니다. 공정은도 3a에 도시된다. <ol><li> 180 ℃에서 10 분 동안 4 인치 실리콘 웨이퍼를 가열함으로써 시작 스핀 코터에 탈수 웨이퍼를 넣고 스핀 코팅 SU-8 2015 년 다음과 같은 프로토콜을 사용합니다 : <ol><li> (분배 후이 단계 닫아서 동안 SU-8을 분배, 스핀 코터의 열린 뚜껑) 20 초 동안 100 rpm에서 웨이퍼를 스핀. </li><li> 10 초 동안 500 rpm으로 회전 웨이퍼 (이것은 웨이퍼 전체에 저항을 전파합니다.) </li><li> 30 초 동안 1,750 rpm으로 회전 웨이퍼 (20 μm의 저항의 높이를 정의한다). </li></ol></li><li> 이것은, 그렇지 않으면 다음 단계에서 열판 행할 것이다 아세톤 (면봉을 사용)와 함께 웨이퍼의 에지로부터 레지스트를 제거한다. 아 웨이퍼 이동4 분 동안 95 ° C 열에서 otplate. 소프트 베이크 후, (365 nm에서 측정 된 150 엠제이 / cm 2) 자외선 마스크 얼 라이너에 유리 소다 라임에 녹화 포토 마스크를 통해 저항을 노출합니다. </li><li> 노출 후, 핫 플레이트에서 5 분 동안 95 ° C에서 다시 웨이퍼를 가열한다. RT에 웨이퍼를 냉각 한 후 4 분간 SU-8 개발자의 목욕에 젖어. 노출되지 않은 SU-8을 제거하기 위해 부드럽게 흔들어. 클린 룸 등급의 이소프로판올로 웨이퍼를 세척하고 질소로 건조한다. 개발 (특히 세포 트랩)에 성공하면 현미경으로 확인합니다. 셀 트랩이 완전히 개발하는 경우, 실리콘 웨이퍼의 반사 표시해야한다. 필요한 경우, 몇 분 동안 다시 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 180 ° C에서 2 시간 동안 오븐에서 웨이퍼를 굽는다. 단계 프로파일과 채널의 높이를 확인합니다. 높이가 원하는 높이와 다를 경우,이 프로토콜은 새로운 웨이퍼 단계 1.1에서 시작하여 반복회전 속도 (단계 1.1.3)를 변경합니다. 1H, 1H, 2H, 하룻밤 데시​​ 케이 2H-퍼플 루오로 데실-dimethylchloro 실란과 웨이퍼 silanizing하여 마스터 몰드의 제조를 완결한다. </li></ol> 2. 미세 접촉 인쇄를위한 마스터 제작 <ol><li> 마이크로 콘택트 인쇄 마스터 주형을 제조하기 위하여, 180 ℃에서 10 분 동안 실리콘 웨이퍼를 탈수 (저항이 실릴 화 표면에 잘 부착) 30 초 동안 7,500 rpm에서이 웨이퍼에 1 ㎖의 HDMS을 코트에게 스핀. AZ1518의 스핀 코트 2 ㎖ 긍정적이 프로토콜을 사용하여 저항 : <ol><li> 정적 분배는 웨이퍼에 저항한다. </li><li> 500 rpm에서 5 초 동안 웨이퍼를 스핀. </li><li> 4000 rpm에서 60 초 동안 웨이퍼를 스핀. </li></ol></li><li> 핫 플레이트에서 100 ° C에서 50 초 소프트 베이크 후, 노출하는 포토 마스크를 통해 마스크 얼 라이너에 UV 광 (365 nm에서 21 엠제이 / cm 2)에 저항한다.에게 75 초 동안 AZ (726)의 욕조에 저항을 개발한다. DI-물과 타격 D로 개발 된 웨이퍼를 씻어질소, 공예. 50 초 동안 115 ° C에서 웨이퍼를 가열하여 잔류 용매를 제거합니다. 밤새 진공 하에서 웨이퍼 Silanize. </li></ol> 3. 미세 유체 칩의 제조 이층 장치 설계는 이들 실험을 위해 사용된다. 칩 최종적 유리 슬라이드 (도 3b)에 접착되기 전에 두 층은 별도로 준비되어 함께 접착된다. 이 단계는 PDMS 층의 제조 및 마이크로 콘택트 인쇄 PDMS 스탬프를 설명한다. <ol><li> 10:1 PDMS의 혼합 및 경화제를 준비합니다. 총 약 80 g의 PDMS를 준비합니다 (우리의 디자인을 사용하여,이 10 칩 발생합니다). 혼합물이 자유로운 거품 (~ 30 분) 될 때까지 적극적으로하고 가스를 제거 두 부분 PDMS를 섞는다. </li><li> 바닥에 페트리 접시와 테이프를 내부 제어 계층과 웨이퍼를 놓습니다. 다음으로, 위에 PDMS의 ~ 50g을 넣어 완전한 보장하기 위해 80 ° C의 오븐에서 최소 2 시간 동안 웨이퍼를 넣어PDMS의 경화. ~ 20g의 PDMS가 필요한이를 위해, 마이크로 콘택트 프린팅 웨이퍼에 대해 동일한 절차를 반복한다. </li><li> 스핀 코트 웨이퍼상의 PDMS를 2000 rpm의 회전 속도로 유체 층을 약 40 ㎛의 높이 PDMS 층을 형성한다. 80 ℃에서 최소 1 시간 동안 오븐에서 PDMS 치료 </li><li> 두 부분이 경화 될 때, 웨이퍼로부터 제어 층을 제거하고 면도날 조각으로 잘랐다. 1mm 생검 펀치를 사용하여 압력 연결 구멍을 펀치. 스토리지의 경우, 채널을 통해 테이프의 조각을 넣어하는 것이 바람직하다. </li><li> 두 층을 결합하기 위해, 스핀 코팅 웨이퍼와 상단 부분을 플라즈마 클리너 (23)에 배치합니다. 플라즈마 처리 후, 신속하게 큰 작동 거리를 가진 현미경으로 두 부분을 맞 춥니 다. 배치하는 상단 부분의 주위에 약간의 여분의 PDMS를 추가합니다. 그러나이 단계는 웨이퍼로부터 PDMS의 제거를 용이하게, 필수 아니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 배치. </li><li> 조심스럽게 웨이퍼에서 PDMS를 제거하고 마이크로 칩을 잘라 메스를 사용합니다. 1.5 mm 생검 펀치와 유체 연결에 대한 액세스 구멍을 펀치. </li><li> PDMS 칩은 현재 완료와 달 동안 저장 될 수있다. 옵션 : 칩이 저수지와 함께 사용되는 경우, 200 μL 피펫 팁의 상부를 잘라 상단에 접착제 일부 예비, 반경 화 PDMS를 사용합니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C에서 다시 오븐에 칩을 넣어. </li></ol> 4. 유리 슬라이드에 결합 직접 효소 분석을위한 장치를 사용하려면, 접합 후 필요한 유일한 단계는 표면의 차단입니다. 이 프로토콜의 경우, 면역 또는 ELISA를위한 마이크로 유체 칩을 사용하는, 그러나 A.로 진행, 만 (즉, TIRF 현미경 또는 SPR에 대한) 유리 슬라이드에 결합 부위를 제한하는 프로토콜 B를 참조하십시오. 이러한 제한은 중요하지 않은 경우를 참조하지만, 단계 8.6에서 비오틴 콘쥬 게이트를 사용하여 단계 4.8를 계속프로토콜 B에 완전한 기능의 표면을 만들 수 있습니다. 이전 프로토콜 A와 B를 수행하기 : 그것은 이전의 칩에 그들을 소개에 사용 된 단백질의 모든 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 파편과 단백질 응집체는 그렇게함으로써, 분석을 위해 사용할 수있는 챔버의 수를 줄이고, 세포 트랩을 차단할 수있다. 이를 위해, 채널에 그들을 도입하기 전에 모든 해법을 필터링하는 비 단백질 흡착 필터 장치를 사용한다. 프로토콜 A (효소 분석) <ol><li> 미세 유동 장치를 마무리하기 위해, 유리 슬라이드 상에 PDMS 부품 접합. 이를 위해, 제 비누, 증류수와 에탄올을 유리 슬라이드를 청소. 질소 스트림을 사용하여 슬라이드를 건조. 스카치 테이프로 PDMS 부분을 청소합니다. </li><li> 단단한 결합을 보장하기 위해 18 W.에서 45 초 동안 플라즈마 클리너로 PDMS 부분과 청소 유리 슬라이드를 넣고 5 분 동안 핫 플레이트 (100 ° C)에 칩을 넣어. </li><li> 접합 후, F와 칩을 채우기luids. 이것을 달성하는 쉬운 방법은 원심력을 사용하는 것입니다. 200 μL 피펫 팁의 아래 부분을 잘라. 유체 채널의 경우, 블로킹 용액들을 채우기 (소 혈청 알부민 (4 % w / v) 또는 폴리-L-라이신) 그래프트 폴리에틸렌 글리콜 (0.05 % w / v) 및 유입구에 팁을 배치. 물 중 하나 또는 삼투 성 용액, 예를 들면 PBS로 제어 계층의 입구를 입력합니다. 5 분 동안 원심 분리기 (800 XG)에 칩을 놓습니다. 채널은 이제 완전히 액체로 가득해야합니다. 되지 않은 경우,이 단계를 반복합니다. </li><li> 실온에서 적어도 30 분 동안 블로킹 용액을 배양한다. 주사기 펌프를 이용하여 10 μL / 분의 유속으로 PBS와 유체 층 중 용액을 씻는다. 이 장치는 현재 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 프로토콜 B (면역) 이후 단계 4.7 표면 개질의 전체 개요는 표 1을 참조하십시오. <ol start="5"><li> 에BBSA / BSA 용액 (예를 들어 1 ~ 100)와 미세 접촉 인쇄를위한 cubate PDMS 스탬프. 30 분 후, 증류수로 철저히 우표를 청소하고 질소의 흐름에 따라 스탬프를 건조. 빨리 청소 유리 슬라이드 (그림 4)에서 스탬프를 배치합니다. </li><li> 함께 플라즈마 클리너 최대 전력 (18 W)에서 45 초 동안 산소 플라즈마에 미세 유체 칩의 상단 부분에 스탬프 유리 슬라이드를 노출합니다. 플라즈마 처리 후, 스탬프를 제거하고 장치의 microchambers 아래에 인쇄 된 표면에 정렬. 50 ℃의 핫 플레이트에 30 분 동안 칩을 놓습니다 </li><li> 나머지 표면을 차단하려면 원심 분리기와 칩에 멸균 여과 BSA 용액 (4 %를 (W / V) PBS에서) (단계 4.2 참조) 소개합니다. 1 시간 동안 품어 PBS와 유체 층 (단계 4.3 참조) 밖으로 솔루션을 씻어. 이 칩은 습기가 상자에 4 ° C에서 직접 사용 또는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다. </li><li> 완전한 기능의 결합 계면에 대한전자, 저수지에 아비딘 (0.025 % (W / V) PBS에)을 소개합니다. 유체 채널을 통해 아비딘 용액을 인출을 30 분 동안 5 μL / 분의 유속을 사용한다. 그 후, 10 분 동안 PBS를 플러시. 철저하게 탱크를 씻어. </li><li> 그 후, 단백질 G (0.0025 % (W / V) PBS에) 또 다른 30 ​​분 동안 세척을 추가합니다. 그 후 또 다른 10 분 동안 PBS로 세척. 다음, 10 분 동안 관심의 항체 (0.0001 % (W / V) PBS에있는)를 추가합니다. 10 분 후, 바인딩 할 수 있도록 15 분 동안의 흐름을 중지합니다. 다음, 10 분 동안 PBS로 세척. </li></ol> 5. 세포 실험 프로토콜은있을 수 있기 때문에 분석의 다양성의 일반적인 용어로 작성됩니다. 예로서 G6PDH 독성 분석에 필요한 시약은 주어진다. 장치의 초기 셀 포집 효율 즉, 200 세포 중 5 갇혀되며, 약 2.5 %이다. 세포 트랩의 최종 인원은 강력하게 사용되는 세포주 일시 중단하는 프로토콜에 따라 달라집니다세포주 및 시간은 셀 채널을 통해 플러싱된다. 자연적으로 (예 : U937)를 서스펜션에서 성장 세포를 들어, 하나의 세포는 몇 분 후 챔버의 75 % 정도에서 찾을 수 있습니다. 다른 챔버들 중 하나 가득, 또는 두 개 이상의 셀에 의해 점유되지 않는다. 일반적으로, 단일 셀 점유도는 점착성 세포주 작다. 여기에 제시된 오히려 온화한 현탁 프로토콜을 사용하는 경우, 비율 (HEK MLT 세포)를 대략 30 %로 감소한다. 단일 셀 점유도는 세포를 트립신 처리에 의해 개선 될 수 있지만,이 또한 실험 결과를 변경할 수있다. 표적 분자에 따라, PDMS에 흡착 또는 흡수가 결과에 영향을 미칠 수있다. 흡착 BSA 또는 PLL-g-PEG를 가진 표면을 차단함으로써 감소 될 수있다. 흡수는 대부분 친수성 ​​생체 분자에 대한 확률이지만, (소) 친 유성 세포 성분에 대해 검사되어야한다. <ol><li> 특정 프로토콜에 따라 세포를 준비 (예를 들어 </EM&gt; 약물 중독). 정지 세포의 경우, 칩에 직접 세포를 추가합니다. 접착제 세포주, 세포 현탁액을 생성 효소 프리 해리 완충액을 사용한다. 셀 클러스터의 양을 줄이기 위해 칩에 도입하기 전에 세포를 필터. </li><li> 주사기 펌프 및 순방향 흐름을 이용하여 칩 상에 세포를 넣고보다는 세포 현탁액을 철회. 채널 벽에 세포의 비특이적 부착을 감소시키기 위해 이후 접착제 셀 현탁 세포주 및 20 μL / 분의 높은 유량을위한 5 μL / 분의 유속을 사용한다. </li><li> 트랩이 채워지면, 실을 닫습니다. 많은 세포 표면에 비특이적으로 부착하는 경우, 10-30 μL / 분의 유속으로 세포 해리 완충액으로 그들을 씻어 흘려하려고. </li></ol> 프로토콜 A (효소 분석) <ol start="4"><li> 칩을 통해 용해 버퍼를 철회. 이것은 예를 들어, 현재의 버퍼가 추가 트윈 20 (10 mM 트리스 - 염산, (10)와 버퍼이다 hypoosmolar밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 1 % (V / V) 트윈 20). 용해를 들어, 신속하게 개폐 챔버 (즉, 10 ~ 50 μL / 분 7,21의 유량을 500 밀리 초). G6PDH 분석의 경우, 2 mM의 포도당 -6 - 인산, 0.5 ㎜ NADP, 0.5 U / ㎖ 디아 포라 제 및 용해 버퍼에 레사 주린 0.3 ㎜를 추가합니다. 즉시 용해 후 운동 반응을 모니터링하기 시작합니다. </li></ol> 참고 : 분석에 적합합니다 모든 버퍼를 선택 (트리톤, SDS 등) 강한 세제를 Lyse 세포가 즉시 실 개방시 분석의 손실로 이어질 것입니다 염두에 그러나 벌거 벗은. 프로토콜 B (면역) ELISA 세포 실험 (유량, 챔버 상태 등)에 대한 간단한 설명은 표 1을 참조하십시오. <ol start="5"><li> ELISA에 직접 용해 버퍼에 필요한 검출 시약 (예를 들면 차 항체, 표지 항원)를 추가합니다. 여기에는 트위 추가N (20)는 비특이적 흡착을 줄일 수 있습니다. 5.4 단계에 따른 세포를 Lyse. (사용 된 항원과 항체에 따라 배양 시간)를 결합 할 수 있도록 10 ~ 15 분 혼합물을 품어. </li><li> 채널 벽에 비특이적으로 흡착 항체 효소 복합체는 이미 저장 및 채널 내부 검출 시약의 변환으로 이어질 수 있습니다. 이 흡착에서 문제를 줄이려면 (검출 시약을 추가하기 전에, 챔버는 폐쇄) 배양 시간 동안 칩을 사용 감지 효소의 영구 억제제를 플러시. HRP의 경우, 영구적으로 비특이적으로 흡착 효소를 불 활성화하기 위해 물에 20 mM의 염산을 사용합니다. </li><li> 배양 시간 후에 칩 검출 시약 (예 Amplex 빨간색과 HRP 과산화수소)를 소개한다. 멀리 nonbound 차 항체를 씻어 곧 다시 실을 열고 검출 시약을 추가 할 수 있습니다. 즉시 운동 반응을 모니터링 시작합니다. </li><li> 교정 : 무력화관심의 대상에 대한 항체. 닫기 실. 버퍼 또는 오프 칩 (off-chip) 세포 용 해물에 분석의 서로 다른 농도를 준비합니다. 칩의 농도를 적용하고 신속하게 챔버 (개관 시간 500 밀리 초) 내부의 볼륨을 교환한다. 이 개방 시간은 추가 축적 분석 플러싱에서 발생하지 않도록 충분히 짧고, microchamber의 볼륨에서 분자 만 특정 번호가 검색됩니다. 용액 안에 항원의 알려진 농도와 챔버 체적 (625 PL)에서, 챔버 내부의 양을 계산한다. 그 후, 단계 5.5 계속 검출 부분을 소개합니다. </li></ol>

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<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

미세 유체 기술은 단일 세포 분석을위한 새로운 매혹적인 가능성을 열었습니다. 특히, 트랩 가능성 및 미세 도구를 사용하여 개별적으로 세포를 고정화는 단일 셀의 속성과 응답에 대한 체계적인 장단기 연구를 허용했다. 또한, 마이크로 칩에서 생성 고주파 미세 방울, 셀의 캡슐화는, 통상적 계측법 장치로 수행 할 수없는 단일 세포 분비 연구를 사용할 수있다. 의 microdroplet 방법은, 그러나, 배양 및 세척 단계를 분석 프로토콜에 필요한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리의 접근 방법은 셀 포착 및 분리의 개념을 모두 겸비하고 따라서, 표면에 고정화 된 항체에 근거 면역 포함한 더 복잡한 분석을 수행하기 용이하게한다. 또한, 상기 방법은 애플리케이션과 타겟 분석 물에 대해 매우 유연하다. 마이크로 칩의 설계는 (I) effi 수cient 셀 트래핑 각종 버퍼 및 시약 (ⅱ) 공급하고, 매우 작은 양의 (III)의 안정적인 절연 필수. 이러한 방식으로 타겟 분자의 희석은 회...

과거의 많은 연구는 세포에 세포 대 세포 인구 1-3 이내의 차이, 특히 신호 4를 처리, 또는 단백질 5,6, 대사 및 보조 인자 7,8 세포 내 생체 분자의 양을 제시했습니다. 이러한 이질성은 세포의 적응과 진화 9 근본적으로 중요 할뿐만 아니라, 암과 10-13과 같은 질병의 출현 및 치료에 중요한 역할을하는 것으로 간주됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 연구는 이러한 연구는 생리 활성 화학 물질로 처리 한 후 다른 세포 반응을 표시하는 경우 특히, 생물학적, 약리학 적 연구에 높은 관심이다. 최근, 많은 분석 플랫폼은 하나의 살아있는 세포의 분석이나 세포 함량의 화학 성분을 용이하게 개발되었다. 형광 활성 세포 정렬 (FACS)는 금 성 동안andard 단일 살아있는 세포의 매우 높은 처리량 분석을 위해,이 방법은 세포 내 또는 분비 화합물의 정량에 이용 될 수 없다. 미세 유체 플랫폼의 출현 위치, 치료 및 단일 세포의 관찰에 대한 새로운 분석 전략을 약속했다. 미세 유체의 이정표가 지진 및 동료 (14, 15)에 의해 실현 유연한 PDMS 밸브의 통합에 도달 하였다. 그들은 칩 영역을 분리 할 수 있기 때문에이 밸브가 유용합니다, 예를 들어, 두 문화 (16)를 분리합니다. 게다가, 그들은 단일 세포 분석에 특히 적용 가능하며, 따라서 분석 희석의 문제를 줄일. 단일 세포 분석을위한이 방법의 파워는 최근 한센 평행 17 단셀 수백 개 유전자 발현을 분석하는 동료에 의해 ​​입증되었다. 단백질 및 대사 산물을 대상으로하는 경우, 분석 인해 최적의 부족으로 아주 어렵다mplification 방법, 다른 본 발명의 화합물 및 화학 특성에서의 변화의 큰 수입니다. 또한, 대부분의 세포 내 생체 분자가 몇 가지 수만 18의 순서로 낮은 사본 번호에 존재하는 것으로 예상된다, 따라서 사용 된 분석 방법은 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이러한 면역 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)와 같은보다 강력한 분석은 여러 세척 및 배양 단계뿐만 아니라 표면의 고정을 필요로하기 때문에 마이크로 유체 장치에 통합하기가 어렵습니다. 때문에 이러한 문제로, 그것은 단백질 또는 대사 산물이 단일 세포 수준에서 정량화 된 곳에서만 몇 가지 예는보고 된 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, 형광 화합물의 분비 연구 19,20보고되었다. 최근, ELISA와 구현은 세포 배양에서 분비 (비 형광) 단백질 (THP-1 세포) (21)와 하나의 (난의 분석을 제시했다mmune) 세포 10. 세포 내 단백질을 표적시 등이. 면역 측정법 (11)의 수단에 의해 종양 세포에서의 신호 전달 경로의 분석을위한 세포 내 단백질의 식별을 용이하게 미세 유동 장치를 개발했다. 그러나, 단백질의 단지 상대적인 양을 결정하고, 어떤 효소 증폭 낮은 풍부한 단백질에 대한 신호를 증가하는 데 사용되지 않았다. 최근에는 형광 분석법 (8) 및 면역 분석 (22)와 단일 셀 트래핑 마이크로 디바이스 (도 1)에 결합 할 수 있었다. 세포는 수동적으로 공급하고 세포의 움직임이없는 매체 및 기타 화학 물질의 (빠른) 교환을 할 수 microsized 장애물 구조에 갇혀있다. 각 트랩의 주위에 고리 모양의 밸브는 매우 작은 양 ( &quot;microchamber&quot;)에서 세포의 분리를 가능하게한다. 이 밸브는 바로 그가, 세포 용균 (hypoosmolar) 버퍼를 도입 한 후 작동되는NCE 멀리 확산 세포 내 분자 또는 분자의 분비를 방지한다. 가장 중요한 점으로 인해 부피 (625 PL)의 작은 사이즈에 분자의 대규모 희석은 회피된다. 용해 및 분석을 칩의 동일 위치에서 수행되기 때문에 한층, 운송에 의한 분석 물질의 손실이 없다. 여기에 설명 된 칩 설계는 60 microchambers 총 7,8 어느 microchambers 13 교번 행을 포함한다. 라인을 따라 교차 오염이 배제되도록 챔버, 행에 작동된다. 플랫폼은 형광 분석법뿐만 아니라 면역 분석법 (도 1D)와 조합하여 사용할 수있다. 후자의 경우에, 우리는 칩 생산 및 조립 공정과 호환되는 항체의 고정화를위한 프로토콜을 확립. 따라서 플랫폼은 단일 세포 수준에서, 중요한 신뢰성과 정량 분석​​을위한 길을 엽니 다. 지금까지, 우리는 I의 분석 장치를 사용했다ntracellular 분비 효소 (효소 분석에 의해 상대 정량), 세포 내 보조 인자, 단백질과 작은 분자 (엔드 포인트 분석 또는 ELISA에 의한 절대 정량). 이하에서, 우리는 마이크로 콘택트 프린팅 및 표면 화학에 의해 다층 소프트 리소그래피 및 항체의 패터닝을위한 프로토콜에 의해 칩의 제조 공정을 설명한다. 또한, 칩의 사용과 작업의 몇 가지 예는 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>시약</td><td>회사</td> 이름 <td>카탈로그 번호</td><td>코멘트 (선택 사항)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Germany)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-diacetylchitobioside hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck VWR (독일 다름슈타트)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (독일 비스바덴)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 개발자</td><td>AZ Electronic Materials (독일 비스바덴)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 비오틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 완충액</td><td>인비트로젠</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔(HDMS)</td><td>시그마 알드리치</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>플루카</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Merck VWR (독일 다름슈타트)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (독일 베를린)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>이식 비오틴</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protein G, biotin</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Si-Mat (Kaufering, 독일)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1610716 트윈 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Name</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m PES 주사기 필터</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 mm 생검 펀처</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 필터 20 &micro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Hotplate</td><td></td></tr> <tr><td>HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>마스크 aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M 현미경</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너 PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>모듈 SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>프로파일러 Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프 neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

우리는 병렬로 복수의 단일 세포에서 세포 내 생체 분자의 정량적 측정을 가능하게하는 미세 유체 장치를 제시한다. 이를 위해, 세포는 수동적 microchamber의 중간에 갇혀있다. 제어 층의 활성화시에, 셀은 작은 챔버에서 주변 볼륨으로부터 분리된다. 주변 음량은 고립 셀에 영향을주지 않고 교환 될 수있다. 그러나, 챔버의 짧은 개방 및 폐쇄시에, 챔버 내 용액을 몇 백 밀리 초 내에서 대체 될 수있다. 때문에 실의 가역성에, 세포 배양, 세척, 및 최종적으로, 세포 용해 예 : 고도로 제어 가능한 방식으로 다른 솔루션을 순차적으로 노출 할 수있다. 단단히 밀봉 microchambers은 해물의 유지를 가능하게 최소화하고 세포 용해 후 희석을 제어 할 수 있습니다. 용해 및 분석은 동일한 위치에서 발생하기 때문에, 고감도가 유지되어 더 이상의 D보기 때문에분석의 ilution 또는 손실이 운송 중에 발생합니다. microchamber 디자인 따라서 각각의 세포에서 방출 세포 내 분자 (아토 몰, zeptomoles)의 매우 작은 크기의 숫자의 신뢰성과 재현성 분석을 가능하게한다. 또한, 많은 microchambers 적합한 광학 기기가 모니터링을 위해 사용되는 관련 한번에 많은 세포의 분석을 가능하게 배열 형식으로 배열 될 수있다. 우리는 이미 세포 내 단백질, 효소, 보조 인자 및 상대 또는 절대 하나를 정량화 할 수있는 방법으로 두 번째 메신저를 분석하기 위해 개념 증명 연구를위한 플랫폼을 사용하고 있습니다.

우리의 플랫폼에 존재하거나 단일 세포에 의해 생산 세포뿐만 아니라 다양한 분비 분자를 분석 할 수있다. 여기에서, 우리는 가능한 분석의 다양성을 강조하기 위해 다른 예를 들어 연구를 제시하고 싶습니다. 우리는 분비 효소 (그림 5a)뿐만 아니라 세포 내 효소 (그림 5b)와 단백질 (그림 5C와 D)에 대한 예를 제공합니다. 이러한 보조 인자 또는 작은 분자로 더 많은 예제를 위해, Eyer 등. Eyer 등으로 (2012) 참조하여주십시오. (2013). 첫째, 우리는 분비되는 효소 (그림 5a)에 대한 분석을 제시한다. 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)를 활성화시에, 사람의 단핵구는 리소자임의 분비, 세균 세포 용해를 유도 효소를 유도한다. 이 분석을 위해, 세포는 완충액 4 - 메틸 움 β-D...

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 또는 면역 분석법을 사용하여 단일 세포 용해물을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미세유체 장치를 제작하고 내부 챔버를 항체로 코팅합니다. 그런 다음, 단일 세포를 트랩에 고정시키고 두 번째 단계에서 다양한 시약에 노출시켜 세포 반응을 유도합니다.링 모양의 밸브를 빠르게 닫고 장치에 용해 버퍼를 흘려보냅니다. 링 모양의 밸브를 잠시 열면 마이크로 챔버 내에서 세포가 용해되며, 작은 부피 덕분에 방출된 단백질이 고농도로 항체에 결합할 수 있게 됩니다. 다음으로, 링 모양의 밸브를 엽니다.챔버를 세척하고, 밀폐된 마이크로 챔버에 검출 시약을 주입합니다. 형광 현미경을 사용하여 시간에 따른 형광 강도의 증가를 모니터링하며, 그 결과는 개별 세포에서 방출된 목적 분석물을 정량적이고 신뢰성 있게 검출하는 이 시스템의 능력을 입증합니다. 이 방법은 단일 세포 분석 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.특히, 화학적 환경 변화에 따른 세포 반응에 대한 체계적인 조사가 이루어졌습니다. 우리는 화학적 자극의 결과로 세포 내 분자의 상향 또는 하향 조절을 확인할 수 있습니다. 이 기술에는 두 가지 주요 장점이 있습니다.첫 번째 장점은 고정화된 세포를 일정하거나 주기적으로 변화하는 정의된 화학적 환경에 노출시킬 수 있다는 점입니다. 두 번째로, 교차 오염이나 운송으로 인한 분석물의 손실 없이 샘플에 대한 매우 민감하고 특이적인 분석을 수행할 수 있습니다. 시작하려면 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세 가지 서로 다른 SU-8 마스터 웨이퍼를 제작하십시오.하나는 유체층을 만드는 데, 하나는 제어층을 만드는 데, 그리고 세 번째는 마이크로 컨택 스탬프를 만드는 데 사용합니다. 그 다음, PDMS와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 준비하는 것으로 마이크로 유체 칩 제작을 시작합니다. 두 성분을 격렬하게 혼합하고, 용액 내의 기포가 모두 제거될 때까지 또는 30분 동안 탈기합니다.다음으로, 페트리 접시 내부의 제어층(control layer) 안에 웨이퍼를 놓고 바닥에 테이프로 고정합니다. 그 위에 PDMS 약 50g을 부어 4~5mm 두께의 층을 형성하고, PDMS가 완전히 경화되도록 80°C 오븐에 최소 2시간 동안 둡니다. 마이크로 접촉 인쇄(micro contact printing) 웨이퍼에 대해서도 동일한 절차를 반복하되, 50g 대신 약 20g의 PDM

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

Millifluidic 장치는 나노 물질, 반응 메커니즘과 지속적인 흐름 촉매의 시간 분해 분석의 제어 합성에 이용된다.

화학 합성 및 시간 - 해결 기계론의 연구 Millifluidics

우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

우리는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICPMS) 미국 이산 액적 샘플 도입 시스템을 제시한다. 그것은 90 내지 7000 Hz의 주파수로 40-60 ㎛의 크기 범위 고도로 단 분산 액 적을 생성 저렴하고 일회용 미세 유체 칩에 기초한다.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

유체 구성 요소와 통합된 미세 가공 장치는 생체 내 미세 환경을 모방한 세포 연구를 위한 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리는 단일 또는 공존하는 화학적/전기적/전단 응력 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩을 개발했습니다.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.

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여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

이 보고서는 여러 단일 세포의 고효율 페어링 및 현미경 분석을 달성할 수 있는 단일 세포 배양 실험을 설정하는 미세 유체 칩 기반 방법을 설명합니다.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

이 프로토콜은 개별 인간 말초 혈액 단핵 세포의 사이토카인 분비 역학을 정량적으로 측정하기 위한 고급 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 예를 들어 지질다당류로 자극된 각 개별 세포에 대해 최대 3개의 사이토카인(IL-6, TNFα 및 IL-1β)을 병렬로 측정합니다.

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법 

배우세요 단일 세포 분석을 위한 미세유체 칩 기술로 형광 및 면역분석을 활용하여 세포 내 단백질을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 세포 이질성 연구에 활용됩니다.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

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