단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 또는 면역 분석법을 사용하여 단일 세포 용해물을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미세유체 장치를 제작하고 내부 챔버를 항체로 코팅합니다. 그런 다음, 단일 세포를 트랩에 고정시키고 두 번째 단계에서 다양한 시약에 노출시켜 세포 반응을 유도합니다.

링 모양의 밸브를 빠르게 닫고 장치에 용해 버퍼를 흘려보냅니다. 링 모양의 밸브를 잠시 열면 마이크로 챔버 내에서 세포가 용해되며, 작은 부피 덕분에 방출된 단백질이 고농도로 항체에 결합할 수 있게 됩니다. 다음으로, 링 모양의 밸브를 엽니다.

챔버를 세척하고, 밀폐된 마이크로 챔버에 검출 시약을 주입합니다. 형광 현미경을 사용하여 시간에 따른 형광 강도의 증가를 모니터링하며, 그 결과는 개별 세포에서 방출된 목적 분석물을 정량적이고 신뢰성 있게 검출하는 이 시스템의 능력을 입증합니다. 이 방법은 단일 세포 분석 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

특히, 화학적 환경 변화에 따른 세포 반응에 대한 체계적인 조사가 이루어졌습니다. 우리는 화학적 자극의 결과로 세포 내 분자의 상향 또는 하향 조절을 확인할 수 있습니다. 이 기술에는 두 가지 주요 장점이 있습니다.

첫 번째 장점은 고정화된 세포를 일정하거나 주기적으로 변화하는 정의된 화학적 환경에 노출시킬 수 있다는 점입니다. 두 번째로, 교차 오염이나 운송으로 인한 분석물의 손실 없이 샘플에 대한 매우 민감하고 특이적인 분석을 수행할 수 있습니다. 시작하려면 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세 가지 서로 다른 SU-8 마스터 웨이퍼를 제작하십시오.

하나는 유체층을 만드는 데, 하나는 제어층을 만드는 데, 그리고 세 번째는 마이크로 컨택 스탬프를 만드는 데 사용합니다. 그 다음, PDMS와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 준비하는 것으로 마이크로 유체 칩 제작을 시작합니다. 두 성분을 격렬하게 혼합하고, 용액 내의 기포가 모두 제거될 때까지 또는 30분 동안 탈기합니다.

다음으로, 페트리 접시 내부의 제어층(control layer) 안에 웨이퍼를 놓고 바닥에 테이프로 고정합니다. 그 위에 PDMS 약 50g을 부어 4~5mm 두께의 층을 형성하고, PDMS가 완전히 경화되도록 80°C 오븐에 최소 2시간 동안 둡니다. 마이크로 접촉 인쇄(micro contact printing) 웨이퍼에 대해서도 동일한 절차를 반복하되, 50g 대신 약 20g의 PDMS를 사용하여 4~5mm 두께의 PDMS 층을 형성합니다.

하단층을 준비하려면 미세유체층이 있는 웨이퍼 위에 40 micron 높이의 PDMS 층을 스핀 코팅하십시오. 이때 회전 속도는 2000 RPM으로 60초 동안 유지합니다. 모든 부분이 경화되면 PDMS 층을 오븐에서 80 °C로 1시간 동안 경화시킵니다.

웨이퍼에서 컨트롤 층을 제거하고 면도날 보조 도구를 사용하여 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1 mm 생검 펀치(biopsy puncture)를 사용하여 압력 연결 구멍을 뚫고, 보관을 위해 채널을 테이프로 덮습니다. 다음으로, 마이크로 접촉 인쇄 웨이퍼 위에서 PDMS를 제거하고 챔버 영역 크기의 스탬프를 준비합니다.

사용 전까지 서랍에 넣어 먼지가 묻지 않도록 보관하십시오. 그 다음, 스핀 코팅된 웨이퍼와 4~5mm 두께의 대조군 층을 플라스마 세척기에 넣습니다. 0.75 millibar의 산소 플라스마를 사용하여 18 watts에서 45초 동안 시편들을 처리하십시오.

플라즈마 처리 후, 작동 거리가 긴 현미경 아래에서 두 층을 빠르게 정렬합니다. 웨이퍼에서 PDMS를 쉽게 제거할 수 있도록 배치된 상단 부분 주변에 여분의 PDMS를 추가합니다. 그런 다음 웨이퍼를 80 °C의 오븐에 넣고 최소 1시간 동안 유지합니다.

경화가 완료되면, 메스를 사용하여 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 분리하고 마이크로칩을 잘라냅니다. 1.5 millimeter 생검 펀치를 사용하여 유체 연결을 위한 액세스 홀을 뚫습니다. 또한, 200 microliter 피펫 팁의 윗부분을 잘라내고 여분의 반경화 PDMS를 사용하여 마이크로칩에 리저버를 만듭니다. 이를 상단에 접착합니다.

그 후 칩을 80 °C 오븐에서 최소 1시간 동안 경화시킵니다. 먼저 유리 슬라이드와 PDMS 부품을 세척하십시오. 비누를 사용하여 유리 슬라이드를 세척합니다.

증류수로 헹군 다음, 다시 에탄올로 헹굽니다. 질소 스트림을 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 테이프를 사용하여 PDMS에서 이물질과 먼지 입자를 제거합니다.

그런 다음 PDMS 부품과 세척된 유리를 배치합니다. 강력한 결합을 보장하기 위해 18 watts에서 45초 동안 플라스마 세척기에 넣고, 플라스마 처리 후 칩을 핫플레이트 위에 5분 동안 둡니다. 결합 후, 200 µL 피펫 팁 몇 개의 하단을 절단합니다. 여기에 4% BSA가 포함된 여과된 PBS 10 to 15 µL를 채운 다음 장치의 입구에 배치합니다.

그런 다음 10~15 µL의 PBS를 추가한 컷 팁(cut tips)을 사용하여 이를 대조군 채널에 넣습니다. 다음으로 칩을 원심분리기에 넣고 800 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 채널을 액체로 채웁니다. 채널에 공기가 남아 있는 경우, 채널이 완전히 채워질 때까지 이 단계를 반복합니다.

블로킹 용액을 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 10 µL/min의 유량으로 PBS를 사용하여 유체층에서 용액을 씻어냅니다. 시린지 펌프를 사용하여 이제 장치를 세포 실험에 사용할 수 있도록 준비합니다. 면역 분석을 위해 유리 슬라이드를 프리프린트하려면, 깨끗한 페트리 접시에서 0.5% biotinylated BSA로 PDMS 마이크로 컨택 프린팅 스탬프를 배양합니다.

30분 후, 증류수로 스탬프를 빠르고 철저하게 세척하고 질소 기류 하에서 스탬프를 건조시킵니다. 건조가 완료되면, 패턴화된 biotinylated BSA를 증착시키기 위해 스탬프를 세척된 유리 슬라이드 위에 빠르게 배치합니다. 배치 후에는 스탬프를 움직이지 말고, 스탬프가 유리 슬라이드에 밀착되었는지 확인하십시오.

약간 밀착되지 않았다면 스탬프를 가볍게 두드리되, 세게 누르지 마십시오. 그 다음 스탬프와 미세유체 칩의 상단 부분을 플라즈마 챔버에 넣고 18 watts의 산소 플라즈마에 45 seconds 동안 노출시킵니다. 플라즈마 처리 후, 유리 슬라이드에서 스탬프를 제거합니다.

표면에 입김을 불면 패턴이 보입니다. 프린팅된 표면 위에 마이크로 챔버를 정렬하십시오. 정렬이 완료되면, 칩을 50 °C의 핫플레이트에서 30분 동안 가열하여 나머지 표면을 블로킹하고, 앞서 설명한 대로 원심분리기를 사용하여 칩 내에 PBS에 녹인 4% 멸균 여과 BSA 용액을 주입하십시오. 마이크로칩을 최소 30분 동안 인큐베이션한 후, 10 µL/min의 유속으로 PBS를 흘려 유체층의 용액을 세척하십시오.

시린지 펌프를 사용하여 칩을 즉시 사용하거나, 습윤 박스 내 4°C에서 최대 2주 동안 보관하여 사용하십시오. 다음으로, 리저버에 PBS에 희석한 avadon을 주입하여 완전히 기능하는 결합 표면을 생성합니다. 이후 용액을 흘려보내 유체 채널을 통해 avadon이 통과하도록 합니다.

저장조를 철저히 헹구고 채널을 PBS로 세척합니다. 그다음 저장조에 protein G를 첨가하고 채널을 통해 통과시킵니다. 저장조와 칩을 PBS로 헹구어 과량의 protein G를 씻어냅니다.

다음으로, 표적 항체를 저장조에 추가하고 채널을 통해 흐르게 합니다. 그런 다음 흐름을 멈춰 결합이 일어나도록 한 후, PBS로 채널을 세척합니다. 채널에 세포를 도입하기 전, 형광 표지 유사체를 사용하여 프린팅 과정의 품질을 확인할 수 있습니다. 여기에 표시된 HE 2 9 3 세포와 같이 부착된 세포를 효소 무첨가 해리 버퍼를 사용하여 수확한 다음, 필터링하여 세포 응집체의 수를 줄입니다. 필터링이 완료되면 세포를 시린지에 로드합니다.

mL당 300,000 cells의 농도로, 시린지 펌프의 정방향 흐름을 이용하여 분당 10 to 20 µL의 속도로 약 3분 동안 세포를 칩에 로딩합니다. 이와 같은 부착성 세포의 경우, 트랩이 채워질 때 세포의 비특이적 부착을 방지하기 위해 상단 층에 3 bars의 압력을 가해 챔버를 밀폐합니다. 그 다음 현미경으로 챔버를 관찰합니다. 챔버 내부 표면에 비특이적으로 부착된 세포가 많이 발견되면, 즉시 챔버를 열고 분당 10 to 30 µL의 유속으로 세포 해리 버퍼를 흘려주어 세포를 세척해 냅니다.

glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PDH) 분석을 위해, 2 mM glucose-6-phosphate, 0.5 U/mL NADP, 그리고 0.3 mM RIN을 용해 버퍼에 첨가하고 잘 혼합되었는지 확인합니다. 채널이 비워지면, G6PDH 용해 버퍼를 30 µL/min의 유량으로 칩에 통과시킵니다. 용해 버퍼가 흐르는 동안 챔버를 빠르게 열고 닫으며, 500 ms 동안 열어두어 용해액이 챔버로 진입하게 한 후 즉시 반응 속도를 모니터링합니다.

본 예제에서는 형광 생성물을 시간에 따라 모니터링할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 오렌지색 식용 색소를 채운 뒤 마이크로 챔버 상단의 제어층에 압력을 가해 밀폐시킨 챔버 어레이입니다. 챔버를 밀폐한 후, 챔버의 밀폐도를 확인하기 위해 녹색 식용 색소를 채널을 통해 세척하며 흘려보냈습니다.

각 챔버는 단 625 picoliters 부피의 액체를 포함하고 있어, lys 세포에서 방출된 분자의 농도를 분석에 충분할 만큼 높게 유지합니다. 또한, 밸브를 개폐하여 챔버 간의 교차 오염을 제거할 수 있습니다. 이러한 챔버 내에서는 PMA로 활성화된 단일 U 9 37 세포에서 방출된 리소좀의 양과 같은 분석물을 측정할 수 있는데, 이는 리소좀이 챔버 내에서 형광 분자의 생성을 효소적으로 촉매하기 때문입니다.

녹색 선은 단일 세포가 점유한 챔버의 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타냅니다. 또한 검은색 점선으로 세포가 없는 챔버의 형광 강도를 함께 표시하였습니다. 비교를 위해, 본 분석법은 세포 내 효소인 G6PDH를 측정함으로써 독성 분자가 세포막 무결성에 미치는 영향을 보여줍니다.

검은색 선은 독성 영향이 없는 대조군 샘플을 나타내며, 주황색 선은 표시된 독성의 영향을 받은 세포를 나타냅니다. 다음은 세포 내 단백질에 대한 면역 분석의 예시입니다. GFP anti GFP 항체를 표면에 고정시킨 후 세포를 용해시키고, GFP 단백질의 결합 역학을 TIRF 현미경을 사용하여 시각화하였습니다.

시간 0.1은 용해 버퍼를 투입한 시점입니다. 시간 0.2에서 GFP가 표면에 축적되기 시작하는데, 이는 세포 용해가 일어났으며 GFP가 표면으로 확산되었음을 의미합니다. 시간 0.3에서 GFP와 항체의 결합이 완료됩니다. 이 마지막 예시에서는 방출된 GA DH가 표면의 포획 항체에 결합한 후, HRP가 결합된 검출 항체를 추가하였습니다.

결합되지 않은 모든 검출 항체를 세척해 제거한 후, 검출 시약을 도입하고 일정 시간 동안 반응시켰습니다. 다음은 이 방법을 사용하여 U 9 37 세포와 HEC 2 93 세포 간의 이전 세포 내 GA DH 양을 동물 수치로 비교한 결과입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 마이크로플루이딕 칩을 준비하는 방법, 면역 분석이 가능하도록 표면을 수정하는 방법, 그리고 최종적으로 단일 세포 분석을 위해 장치를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

이 방법은 단일 세포 생물학 분야의 많은 핵심 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다.