에 최적화 된 프로토콜

본 연구의 목적은 생존력이 높은 마이코박테리움 지질 현탁액을 준비하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 누드 마우스에 투여하기 위함입니다. 감염 초기 단계에 있는 감염된 마우스로부터 기초 생명체를 회수하여 사용합니다.

높은 생존율의 정소 수율을 보장하기 위해, 생물안전작업대(BSC) 내에서 동물을 안락사시킵니다. 지혈 겸자로 후맥을 잡습니다. 가위로 절단한 후 2% Iodine 용액에 20분 동안 담급니다. 오염 제거를 위해 발 패드가 위를 향하도록 지점을 고정합니다.

연조직을 수집합니다. 메스 날을 사용하여 조직의 균질화를 용이하게 하기 위해 제1지골과 제5지골의 뼈를 제거합니다. 조직을 멸균된 페트리 접시에 넣습니다. 표피를 긁어냅니다.

가위로 육아종성 조직을 작은 조각으로 자르고, 이후 조직의 수율 프로그램을 계산할 때까지 대기합니다. 작은 조각들을 1 ml의 Hank's balanced salt solution이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. Hank's solution 1 ml를 추가로 넣고, 속도 4에서 조직을 15초씩 3회 균질화합니다.

50 ml 멸균 원추형 튜브에 셀 스트레이너를 배치합니다. 서스펜션을 스트레이너 위에 피펫팅하고 중력에 의해 용액이 통과하도록 둡니다. 잔해를 제거하기 위해 서스펜션에 hanks를 2 ml 더 추가하고 다시 균질화합니다.

동일한 사이클을 사용하여 현탁액을 이 체에 통과시킵니다. hanks를 추가하여 체를 헹굽니다. 현탁액의 총 부피를 9 mL로 맞추기 위해, 최종 농도가 약 0.05%가 되도록 0.5% trypsin 용액 1 mL를 현탁액에 추가합니다.

튜브를 부드럽게 반전시켜 섞은 후 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후, 멸균 식염수를 추가하여 현탁액의 부피를 4 mL로 맞추고 4 °C에서 1700 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 튜브를 톡톡 두드려 펠렛을 재현탁합니다. 멸균 식염수 1 mL를 넣고 섞습니다.

현탁액을 새 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 새 튜브로 옮기는 동안 26 gauge 바늘이 장착된 1 ml 인슐린 주사기를 사용하여 혈관 현탁액을 균질화합니다. 18 medium 두 방울과 7 H 9 brain heart infusion에 현탁액을 접종하여 미생물 제어 검사를 수행합니다.

11 Stein Genesen을 37 °C에서 배양합니다. 그 후 일반적인 미생물 제어 절차를 따릅니다. code Z 염색을 위해서입니다.

식염수 내 S 현탁액의 1/10 및 1/100 희석액을 준비합니다. 계수를 위한 슬라이드 준비 전 각 희석액을 균질화합니다. 유성 마커를 사용하여 각 슬라이드 표면에 내경 10 millimeter 원 3개를 그려 슬라이드 3개를 준비합니다.

이제 면역조직화학용 펜으로 원을 그립니다. 2번 연필을 사용하여 세 가지 희석 농도인 원액, 1:10, 1:100을 표시하여 슬라이드를 준비합니다.

페놀 혈청 용액 5 µL와 sary 현탁액 10 µL를 각 원 안에 피펫으로 분주하고, 균질화한 후 현탁액을 원 영역 전체에 고르게 펴 바릅니다. 일회용 루프의 손잡이를 사용하여 이 슬라이드를 평평한 테이블 위에 놓고 건조시킵니다. 건조 후, bachelor 현탁액 면이 위를 향하게 하여 슬라이드를 푸른 불꽃 위로 세 번 통과시켜 고정합니다.

Zuni 유지 코드를 수행합니다. 이 슬라이드들을 검사하십시오. 세 가지 희석액입니다.

균수 측정에 가장 적절한 희석 배수를 선택하십시오. 혈관 현탁액을 121 °C에서 30분 동안 오토클레이브하여 200 µL의 사멸된 균 현탁액을 준비하십시오. 미생물 지질의 형광 염색을 위해 L 7 0 0 7 live dead back light bacterial viability kit를 사용하십시오.

용액 A를 1:10으로 희석하고, 용액 B를 1:20으로 희석하여 준비합니다. 사용 직전에 준비하십시오. 희석하지 않은 원래의 혈관 현탁액과 사멸된 혈관 현탁액 각각 200 µL에 희석된 용액 A 3.6 µL와 희석된 용액 B 6 µL를 첨가합니다. 암소에서 15분간 배양한 후, 현탁액을 4 °C에서 10,600 ×g로 5분간 원심분리합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.

펠릿을 50 µL의 10% Glycerol에 현탁하고, 피펫팅으로 균질화합니다. 각 현탁액 8 µL를 슬라이드 글라스 위에 올리고 작은 커버 슬립으로 덮습니다. 빛이 차단되도록 보관하십시오.

형광 현미경으로 현탁액을 관찰하십시오. ml당 10⁷ BA lip 농도의 현탁액을 준비하고, 각 cryo vial에 1 ml의 동결 보존액을 넣으십시오. 그 다음, 1 ml의 동결 보존액에 S 현탁액 150 µL를 첨가하고 튜브를 반전시켜 균질화하십시오.

동결 보관용 튜브를 냉동 용기에 넣습니다. 해당 용기를 -80 °C에서 최소 24시간 동안 유지합니다. 튜브를 보관함으로 옮겨 해동 전까지 -80 °C에서 보관합니다.

37 °C로 설정된 항온수조에서 냉동 현탁액을 해동합니다. 현탁액을 20 mL의 멸균 생리식염수가 들어 있는 코니컬 튜브로 옮깁니다. 원심분리하여 농축합니다.

발린(baline)은 계수를 위한 Z 유지 프로토콜과 생존율 결정을 위한 형광 염색 프로토콜을 따랐습니다. 한 끼당 10~8 BA가 포함된 현탁액을 준비하고, 각 동물에 접종하기 전에 현탁액을 균질화하십시오. 인슐린 주사기로 100 µL를 뽑아 생존율 결정 대상인 각 동물의 뒷발 패드에 30 µL를 접종하십시오.

모든 BAI에서는 녹색 형광이 관찰되었으며, bai에서는 적색 형광만 관찰되었습니다. 해당 BAI가 stainless 대조군일 때, 녹색과 적색 BAI 광의 강도는 동일하게 관찰되었습니다. 서로 다른 기간 동안 냉동 보관된 M Lepar를 접종했을 때, 7개월 후 회수된 BAI의 수가 10배에서 1000배까지 증가하였습니다.

마지막으로, IL leid는 in vitro에서 증식하지 않으므로, 본 프로토콜을 통해 실험실에서 추후 사용 가능한 생존 가능한 yl Leid를 빠르고 쉽게 유지할 수 있음을 덧붙이고자 합니다.