모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유충의 말초 신경 손상 후 신경교세포 행동을 타임 랩스로 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 마취된 제브라피시 유충을 유리 바닥의 페트리 접시에 낮은 융점 아로에 장착하고 해부 바늘로 배치함으로써 수행됩니다. 다음으로, 장착된 유충을 컨포칼 현미경에 놓습니다.

절제를 위해 신경을 선택하고 손상되지 않은 신경의 축삭돌기와 신경교세포를 획득한 이미지를 선택합니다. 그런 다음 신경을 따라 ROI를 선택하고 레이저를 발사하여 선택한 영역을 제거하여 신경 절편을 만듭니다. 마지막으로, 축삭돌기와 신경교세포는 신경 절개 후 타임 랩스 영상화됩니다.

궁극적으로 타임 랩스 컨포칼 현미경을 통해 신경 퇴행 및 재생 중 동적 신경교세포 거동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신경 교세포가 신경 손상에 어떻게 반응하는지와 같은 재생 및 신경교세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 별개의 신경교세포형(glial subtypes)은 퇴행과 재생(degeneration) 동안 그들의 행동을 어떻게 조정하는가?

관심 있는 운동 뉴런과 신경교세포 유형을 형광으로 표시하는 형질전환 유전자를 포함하는 성체 제브라피시를 교배하고 수정 후 24시간 또는 HPF까지 배아를 배양한 후, 배아를 인큐베이터로 되돌리기 전에 난자를 제거하고 난수에 있는 하나의 pH, 치아, threa 또는 PTU로 교체합니다. 이 시점부터 약 96 HPF까지 형광 해부 내시경을 사용하여 원하는 형광 유전자의 존재 여부를 배아에 스크리닝합니다. 양성 배아를 신선한 PTU 난수에 이식하고 인큐베이터로 되돌려 보냅니다.

유충이 수정 또는 DPF 후 6일이 되면 장착할 배아 몇 개를 선택하고 더 작은 접시에 옮깁니다. 접시에서 물을 제거하고 즉시 0.02%trica로 교체하십시오.PTU 달걀 물에 약 5분 동안 마취제로 유충을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미리 준비된 0.8% 저용융 아그로스의 Eloqua를 수돗물과 전자레인지가 있는 비커에 넣습니다.

30초 동안 또는 아그로스가 녹을 때까지 아그로스 튜브가 만졌을 때 미지근하게 느껴질 때까지 비커를 식히십시오. 다음으로, 마취 된 유충을 35mm 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 접시에 있는 물을 모두 제거하십시오.

그런 다음 즉시 접시의 유리 바닥 부분을 채울 수 있을 만큼 충분히 따뜻한 아로로 유충을 덮으십시오. 아그로스가 굳어지면 해부 바늘을 사용하여 유충을 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 등을 약간 기울여 장착된 유충이 부상 및 이미징에 필요한 접시 바닥의 유리에 닿는지 확인합니다.

바늘을 사용하여 농작물이 응고되고 유충이 고정될 때까지 유충을 제자리에 유지합니다. 그런 다음 아그로스와 유충을 완전히 덮을 수 있도록 접시에 충분한 트리카 물을 천천히 피펫으로 넣습니다. 모든 컨포칼 현미경 기기, 흥미로운 제브라피시 형질전환 유전자를 위한 적절한 다이오드 레이저 및 질소 펌핑 염료 레이저를 켭니다.

블랭크 빔 스플리터가 제자리에 있고 435나노미터 코어 및 염료 셀이 제자리에 있는지 확인합니다. 레이저 감쇠기를 완전히 연 다음 63 x 1.2 na 침수 렌즈와 한쪽 거울면이 있는 유리 슬라이드가 있는 이미징 소프트웨어를 엽니다. 명시야 조명을 사용하여 거울의 긁힌 자국이나 에칭 부분을 찾아 초점을 맞춥니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 레이저 보정 및 전력 설정을 제어하는 창에서 컴퓨터 화면의 에칭을 보고 초점을 맞춥니다. 메인 도구 모음에서 펄스 수를 1로 설정하고 감쇠를 3% 전송으로 설정합니다. 타원 도구를 선택하고 컴퓨터 화면에서 이미지를 클릭합니다.

단일 원형 ROI를 생성하려면 이미지 위에 4개의 원형 RI가 무작위로 배치될 때까지 이 과정을 3번 더 반복합니다. 다음으로 레이저를 발사합니다. 레이저가 제대로 작동하고 보정되면 각 원형 ROI 내에 하나씩 4개의 작은 스폿 에칭이 생성됩니다.그런 다음 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 대물렌즈를 청소합니다.

블랭크 빔 스플리터를 100% ILL 빔 스플리터로 교체하고 레이저 절제를 사용하여 운동 신경을 절제합니다. 대물렌즈에 작은 물침수 매체 한 방울을 바르고 유충이 장착된 접시를 적절한 스테이지에 놓습니다.tage 클립을 사용하여 접안렌즈와 광시야 조명을 사용하여 안정화합니다. 유충에 초점을 맞추고 운동 뉴런을 찾습니다.

10에서 20까지의 반쪽 분절의 신경을 스캔하고 절편을 위한 운동 신경을 선택합니다. 다음으로, 컴퓨터 화면에서 신경의 실시간 보기를 불러옵니다. Z 평면을 선택하고 손상되지 않은 신경의 축삭 및 신경교 세포의 이미지를 획득합니다.

그런 다음 5분에서 30분 간격으로 모든 세포 유형의 Z 투영을 캡처할 수 있는 타임 랩스 이미징 설정을 준비합니다. 실험에 따라 100%ILL 빔 스플리터를 제거하고 블랭크로 교체합니다. 신경의 실시간 보기로 돌아가서 적절한 형광 채널을 사용하여 절단될 축삭을 봅니다.

타원 도구를 사용하여 절제할 영역에 얇은 타원형 ROI를 만듭니다. 그런 다음 레이저 설정을 제어하는 창에서 선택한 영역 내에서 더 작은 ROI를 생성합니다. 펄스 수를 2로 설정하고 감쇠 플레이트를 18% 전송으로 설정합니다.

그런 다음 선택한 ROI 내에서 레이저를 발사합니다. 10초 이상 기다렸다가 절제 부위에 형광이 있는지 다시 확인합니다. ROI는 실제로 광표백될 때 처음에는 절제된 것처럼 보일 수 있으며 완전한 절제를 달성하기 위해 절제 과정에서 ROI를 약간 수정해야 할 수도 있습니다.

형광이 돌아오면 레이저 출력을 높이고 레이저를 발사합니다. 다시 말하지만, R OIS 내에서 형광이 사라지고 10초 이내에 돌아오지 않을 때까지 이것을 반복합니다. 절제가 완료되면 타임랩스가 완료되면 타임랩스 이미징을 시작합니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 컴파일하고 각 시점에 대한 색상 복합 Z 투영을 생성할 수 있습니다. 축삭돌기 신경교세포의 거동을 동시에 분석하기 위해 퀵 타임 동영상을 만듭니다. 여기에 설명된 분석은 생체 내에서 축삭 손상에 대한 신경교세포 및 기타 신경 관련 세포 집단의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

다음은 이 방법을 사용하여 생성된 신경 손상과 주변 신경교세포의 반응의 예입니다. 이 실험은 신경주위 ggl에서 EGFP를 표적으로 하는 막을 발현하고 운동 뉴런에서 세포질 DS 빨간색을 발현하는 6개의 DPF 형질전환 제브라 피쉬에서 수행되었습니다. 손상은 몸통 운동 신경의 배부 돌기를 따라 이루어졌으며 EGFP 및 DS 적색 채널 모두에서 타임 랩스 이미지화되었습니다.

이를 통해 부상 직후의 축삭돌기와 신경교세포 행동을 동시에 시각화할 수 있었습니다. 이 이미지는 타임랩스 동영상에서 가져온 정적 시점입니다. 점선 타원은 1분에 레이저를 사용하여 절제된 ROI를 보여줍니다.

절제 또는 MPT 후, 절제 부위에는 형광이 없었고 부상 부위는 근위부에서 원위 그루터기까지 약 3.5마이크로미터로 측정되었습니다. 절편의 성공 여부는 원위 신경 그루터기를 영상화하고 원위 축삭 단편화 및 빠른 청소를 포함한 월러관 퇴행의 징후를 찾아 확인할 수 있습니다. 120 MPT에서 원위 그루터기를 따라 축삭 형광이 없다는 것은 이러한 축삭이 실제로 월러식 변성을 겪었고 거래가 성공적이었음을 나타냅니다.

레이저 출력을 이상적인 설정으로 조정하는 것은 레이저 절제 실험을 수행할 때 매우 중요합니다. 이상적인 레이저 출력 설정은 선택한 ROI 내에서만 신경을 깨끗하게 제거하며, 너무 낮거나 너무 높은 레이저 출력 설정은 너무 낮은 레이저 출력으로 수행된 부상에서 볼 수 있듯이 차선의 결과를 생성합니다. 형광은 레이저를 발사한 후 ROI 내에 남아 불완전한 절단을 초래했습니다.

반면에, 이 그림에서 알 수 있듯이 너무 높은 레이저 출력은 매우 큰 절제를 생성했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 레이저 횡단 실험을 위해 제브라피시를 장착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 질소 펌프 염료 레이저를 사용하여 단면을 생성하고 타임 랩스 컨포칼 이미징을 사용하여 주변 세포의 반응을 평가합니다.