모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유생에서 말초 신경 손상 후 글리아 세포(glial cell)의 행동을 타임랩스 이미지로 촬영하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 제브라피시 유생을 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로 고정하고, 해부용 바늘을 사용하여 위치를 잡습니다. 다음으로, 고정된 유생을 공초점 현미경 위에 놓습니다.

절단할 신경을 선택하고, 손상되지 않은 신경의 축삭과 글리아 세포 이미지를 획득합니다. 그런 다음 신경을 따라 ROI를 설정하고 레이저를 조사하여 선택된 부위를 절단함으로써 신경 단열을 유도합니다. 마지막으로, 신경 단열 이후 축삭과 글리아 세포의 타임랩스 이미지를 촬영합니다.

최종적으로, 타임랩스 공초점 현미경 관찰을 통해 신경 퇴행 및 재생 과정 중의 역동적인 글리아 세포 행동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 글리아 세포가 신경 손상에 어떻게 반응하는지, 그리고 서로 다른 글리아 하위 유형들이 퇴행 및 재생 과정에서 어떻게 행동을 조율하는지와 같은 재생 및 글리아 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

관심 있는 운동 신경세포와 글리아 세포 유형을 형광으로 표시하는 트랜스젠을 가진 성체 제브라피쉬를 교배하고, 배아를 수정 후 24시간(HPF)까지 배양한 후, 난수(egg water)를 제거하고 1 pH tooth threa 또는 PTU가 포함된 난수로 교체한 뒤 배아를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 이 시점부터 약 96 HPF까지 형광 해부 현미경을 사용하여 원하는 형광 유전자의 발현 여부를 스크리닝합니다. 양성 배아를 신선한 PTU 난수로 옮겨 인큐베이터로 되돌립니다.

수정 후 6일(DPF)이 되었을 때, 마운팅을 위한 배아 몇 개를 선택하여 더 작은 접시로 옮깁니다. 접시의 물을 제거하고 즉시 0.02% tricaine PTU egg water로 교체한 후, 약 5분 동안 마취제에서 치어를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미리 준비한 0.8% low melt agarose 한 방울을 수돗물이 담긴 비커에 넣고 전자레인지에 넣습니다.

비커를 식혀 agros 튜브가 만졌을 때 미지근해질 때까지 30초 동안 또는 agros가 다 녹을 때까지 기다립니다. 그다음, 마취된 유충을 35 millimeter 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 접시 내의 물을 제거합니다.

그런 다음 즉시 유충이 담긴 접시의 유리 바닥 부분에 찰 때까지 충분한 양의 따뜻한 agar를 덮어줍니다. agar가 굳어짐에 따라 해부용 바늘을 사용하여 유충을 옆으로 눕힙니다. 그 후 유충을 살짝 등 쪽으로 기울여, 유충의 몸이 접시 바닥의 유리에 닿게 합니다. 이는 손상 유도 및 이미징을 위해 필수적입니다.

아가로스(agarose)가 응고되어 치어가 고정될 때까지 바늘을 사용하여 치어의 위치를 유지하십시오. 그런 다음 디쉬에 아가로스와 치어가 완전히 잠길 정도로 충분한 양의 trica water를 천천히 피펫팅하여 넣으십시오. 모든 공초점 현미경 장비와 제브라피쉬 트랜스젠(transgene)을 여기시키는 데 적합한 다이오드 레이저, 그리고 질소 펌프 염료 레이저의 전원을 켜십시오.

공백 빔 스플리터와 435 nanometer coer 및 염료 셀이 제대로 장착되었는지 확인하십시오. 레이저 감쇠기를 완전히 열고, 63 x 1.2 na 수침 렌즈와 한 면이 거울로 된 유리 슬라이드를 사용하여 이미징 소프트웨어를 실행하십시오. 명시야 조명을 사용하여 거울의 긁힘이나 식각 부위를 찾아 초점을 맞추십시오.

이미징 소프트웨어를 사용하여 레이저 보정 및 출력 설정을 제어하는 창의 컴퓨터 화면에서 식각된 부분을 확인하고 초점을 맞춥니다. 메인 툴바에서 펄스 수를 1회로, 감쇠율을 3% transmission으로 설정합니다. 타원 도구를 선택하고 컴퓨터 화면의 이미지를 클릭합니다.

단일 원형 ROI를 생성하려면 이 과정을 세 번 더 반복하여 이미지 전체에 네 개의 원형 ROI가 무작위로 배치되도록 합니다. 그다음 레이저를 조사합니다. 레이저가 제대로 작동하고 보정되었다면, 각 원형 ROI 내에 네 개의 작은 점 식각(spot etching)이 생성됩니다. 그런 다음 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 대물렌즈를 세척합니다.

레이저 절제술을 이용해 운동 신경을 절단하기 위해 빈 빔 분할기를 100%ILL 빔 분할기로 교체합니다. 대물렌즈에 수침 매질을 한 방울 떨어뜨리고, 접안렌즈와 광시야 조명을 사용하여 고정된 유충이 담긴 디시를 적절한 스테이지 위에 놓고 클립으로 고정합니다. 유충에 초점을 맞추고 운동 뉴런의 위치를 찾습니다.

hemi 세그먼트 10에서 20 사이의 신경을 스캔하고 절단할 운동 신경을 선택합니다. 다음으로, 컴퓨터 화면에 해당 신경의 실시간 뷰를 띄웁니다. Z 평면을 선택하고 손상되지 않은 신경의 축삭과 글리아 세포 영상을 획득합니다.

그 다음, 5분에서 30분 간격으로 모든 세포 유형의 Z-projection을 캡처할 수 있도록 타임랩스 이미징 설정을 준비합니다. 실험 조건에 따라 100%ILL 빔 스플리터를 제거하고 빈 슬롯으로 교체합니다. 신경의 라이브 뷰로 돌아가 적절한 형광 채널을 사용하여 절단될 축삭을 확인합니다.

타원 도구를 사용하여 절제할 영역에 얇은 타원형 ROI를 생성합니다. 그런 다음 레이저 설정을 제어하는 창에서 선택한 영역 내에 더 작은 ROI들을 생성합니다. 펄스 수를 2회로 설정하고 감쇠판(attenuation plate)을 18% 투과율로 설정합니다.

그런 다음 선택한 ROI 내에서 레이저를 조사합니다. 10초 이상 기다린 후 절제된 부위의 형광을 다시 확인합니다. ROI가 실제로는 광퇴색된 것임에도 초기에는 절제된 것처럼 보일 수 있으며, 완전한 절단을 달성하기 위해 절제 과정 중에 ROI를 약간 수정해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오.

형광이 다시 나타나면 레이저 출력을 높여 레이저를 조사하십시오. R OIS 내에서 형광이 사라지고 10초 이내에 다시 나타나지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오. 어블레이션이 완료되면 타임랩스 이미징을 시작하고, 타임랩스가 완료될 때까지 기다리십시오.

이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 각 시점별로 컬러 합성 Z-projection 이미지를 생성합니다. 퀵타임(QuickTime) 무비를 제작하여 축삭과 글리아 세포의 행동을 동시에 분석합니다. 여기서 설명한 분석법은 생체 내(in vivo) 축삭 손상에 대한 글리아 세포 및 기타 신경 관련 세포군들의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법을 통해 유도된 신경 손상의 예와 주변 글리아 세포의 반응이 여기에 제시되어 있습니다. 이 실험은 신경 주변 글리아(perineural ggl)에서 막 표적 EGFP를 발현하고, 운동 신경세포에서 세포질 DS red를 발현하는 6 DPF 형질전환 제브라피쉬에서 수행되었습니다. 몸통 운동 신경의 주둥이 쪽 돌기(rostral projection)를 따라 손상을 입힌 후, EGFP와 DS red 채널 모두에서 타임랩스 이미징을 진행하였습니다.

이를 통해 손상 직후 축삭과 글리아 세포의 행동을 동시에 시각화할 수 있었습니다. 이 이미지들은 타임랩스 영상에서 추출한 정지 시점의 장면들입니다. 점선 타원은 1분 시점에 레이저로 제거한 ROI를 나타냅니다.

절단 또는 MPT 이후, 절제된 부위에는 형광이 나타나지 않았으며 손상 구역은 근위부에서 원위부 단단까지 약 3.5 micrometers로 측정되었습니다. 절단 성공 여부는 원위부 신경 단단을 이미지화하여 원위부 축삭의 파편화 및 급격한 제거를 포함한 월러 변성(wallerian degeneration)의 징후를 확인함으로써 판별할 수 있습니다. MPT 120분 후 원위부 단단을 따라 축삭 형광이 관찰되지 않는 것은 해당 축삭들이 실제로 월러 변성을 겪었으며 절단이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다.

레이저 어블레이션 실험을 수행할 때 레이저 출력을 최적의 설정으로 조정하는 것이 매우 중요합니다. 최적의 레이저 출력 설정은 선택한 ROI 내의 신경만을 깨끗하게 어블레이션하며, 레이저 출력이 너무 낮거나 너무 높으면 최적이지 않은 결과가 나타납니다. 여기 보이는 사례는 레이저 출력이 너무 낮은 상태에서 수행된 손상 결과입니다. 레이저를 조사한 후에도 ROI 내에 형광이 남아 있어 불완전한 절단이 이루어졌습니다.

반면, 이 그림에서 입증된 바와 같이 레이저 출력이 너무 높으면 매우 큰 절제 부위가 생성되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 레이저 절단 실험을 위해 제브라피시를 고정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 질소 펌프 다이 레이저를 사용하여 절단을 수행하고, 타임랩스 공초점 이미징을 통해 주변 세포의 반응을 평가하십시오.