Name: Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 Danio rerio 유충을 이용한 고처리량 자동 행동 분석 방법으로 독성 물질에 의한 행동 결함을 탐지합니다. 이 기술은 신경행동학 연구에서 뇌 발달과 행동 변화를 효율적으로 분석할 수 있게 합니다.

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우리는 행동 분석의 최적화에 도움 숀 Pelkowski 감사합니다. 이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소, R01 HD060647 ​​및 환경 건강 과학의 국립 연구소, F32 ES021342 및 R03 ES017755에 의해 지원되었다.

1. 제브라 피쉬 배아의 수집 및 유충을 기르고, <ol><li> &quot;가짜&quot;잔디 (녹색 원사에서 만든) (그림 1) 유리 파이렉스 요리 zebrafish의 배아를 수집하기 위해 새벽에 탱크에 삽입하고 두 시간 동안 남아있을 것이다. 배아를 포함하는 유리 접시는 소형 여과기에 부어 및 탈 이온수로 세척해야한다. 배아는 다음 달걀 물에서 재배되어야한다. 계란 물은 증류수 0.25 ㎎ / 곰팡이 억제제로 사용되는 메틸렌 블루의 L있는 인스턴트 오션 60 ㎎ / L를 포함합니다. </li><li> 각 실험의 가설에 따라, 배아는 즉시 또는 독성 물질이나 약품을 사용하여 개발의 특정 단계에서 처리 할 수​​ 있습니다. 독성 물질 및 의약품은 일반적으로 DMSO에 용해 (1,000 X의 농도)와 더 계란 물을 매체에 직접 희석해야한다. </li><li> 제약 또는 독성 물질과 배아와 애벌레 치료 중들, 유충 및 배아는 7 DPF (계란 물 솔루션이 매일 적어도 세균 / 곰팡이의 성장을 방지하기 위해 변경해야의 행동 분석까지 50 ML 당 50-60 유충의 밀도에 깊은 페트리 접시에 수납 할 수 있습니다 죽은 태아부터). </li></ol> 2. 행동 분석을위한 틀을 준비 <ol><li> 특히 X 7.6 cm X 5mm은 사내에서 - 사용자 지정 내장 된 11.7 cm를 측정 플라스틱 금형을 개발했다. 금형 온도 과학에서 하나의 잘 플라스틱 접시에 부어 아가을 사용하여 차선을 만드는 데 필요합니다. 하나의 웰 플레이트 측정 12.4 cm X 8.1 cm X 1.2 cm. </li><li> 금형면을 60 °로 각도되는 다섯 개의 차선을 포함합니다. 금형의 차선 밑바닥 폭이 14mm 인 반면 넓은입니다 상단에 18mm의 기본 높은 3.5 mm이다. 금형 레인 (그림 2) 사이의 4 개 mm 간격이 있습니다. </li><li> 차선이 녹은 아가로 오스의 50 ML (탈 이온화에서 0.8 % 아가로 오스를 부어 준비하려면하나의 웰 플레이트에 60 ㎎ / L 즉시 바다)와 D 물. 형은 그 어떤 거품 형성을 제거하는 액체 아가의 상단에 아주 천천히 배치해야하고 (약 45 분 소요)를 아가로 오스가 냉각 될 때 제거 할 수 있습니다. </li><li> 행동 실험 (건조 아가을 피하기 위해) 차선은 약 36 시간에 대한 접시에 뚜껑 실온에서 최대 저장할 수 있습니다 실행될 전에 아가 레인은 그 이전보다 하루하여야한다. 아가로 오스 차선은 하나의 실험에 사용되어야하고 폐기해야합니다. </li></ol> 3. 이미지 캡처 <ol><li> 최대 20 유충은 플레이트의 각 레인에 배치 할 수 있습니다. 레인 당 일반적으로 5 유충은 수영 속도의 가장 정확한 추적을 용이하게하고 실험마다 필요한 유충의 수를 줄이기 위해 사용됩니다. 레인은 계란 물이나 실험에 따라 의약품 또는 독성 물질없이 채울 수 있습니다. 그러나 차선 F 안된다그들은 이미징 캐비닛에 배치 될 때까지 모든 방법을 illed, 이것은 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 그들은 아가로 오스 금형에 배치 노트북 화면의 상단에 배치 된 후 일관성을 위해 유충 10 분의 적응 기간을 가져야한다. 효율적으로 페트리 접시에서 아가로 오스 차선 애벌레를 이동하는 애벌레 스트레스를 줄이는 데 도움이됩니다. 애벌레가 얕은 탱크 또는 페트리 접시에 보관하는 경우 이것은 가장 쉬운 방법입니다. </li><li> 영상 캐비닛은 시간 경과 사진과 노트북에 사용되는 캐논 디지털 카메라 (가) 있습니다. 카메라가 캐비닛의 상단에 배치 15.6 인치 스크린 노트북은 화면 (그림 3)를 향하도록 배치되어야 캐비닛의 바닥을 향해 목표로해야한다. 4 판은 직접 노트북 화면의 상단에 손으로 위치해야합니다. 그것은 (L의 가장자리에 그림자를 제거하기 위해 차선의 상단 수준이되도록이 시간에 차선 계란 물 또는 화학 처리를 돌파 할 수있다이미지에 마취). </li><li> PowerPoint 프레 젠 테이션은 유충에 대한 혐오 자극으로 사용됩니다. 과거 이동 빨간 공 6 또는 12 멀티 웰 플레이트 15,17,18에서 애벌레 zebrafish의을 보여 하였다. 현재 파워 포인트 판의 위쪽 (그림 4)에 이동 빨간색 막대의 15 분 뒤에 15 분에 대 한 빈 흰색 배경으로 시작됩니다. 애벌레 과열 제거하기 위해서는 28 이상 이동하지 않는 화면 ℃의 온도로 노트북을 구입하는 것이 가장 좋습니다 아가로 오스 차선 내에서 액체의 증발을 방지하기 위해 최대 영상 시간을 한 시간 이하로 유지되어야한다. </li><li> 디지털 카메라는 실험 당 300 이미지의 총 사진마다 6 초 복용 시간 경과 촬영에 프로그래밍해야합니다. 그러나 주파수와 길이는 실험과 행동 정량화에 따라 조정할 수 있습니다. 과거의 확장 된 영상 시대에 각 이미지 사이에 더 이상 간격을 사용하여 채택되었다. camer를이 동영상 속도 (초당 30 프레임)에서 이미징을위한 낮은 해상도로 설정할 수 있습니다. 낮은 해상도는 하나의 다중 웰 플레이트에 녹음을 제한하는 동안, 비디오 녹화 이미징 빠른 수영 이벤트 15에 적합합니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 <ol><li> 이미지는 ImageJ에 함께 열리고 특히 사내에서 작성되었습니다 매크로와 함께 사용되어야한다. 매크로가 자동으로 붉은 색을 제거 할 수 있도록 색상 채널을 분할 배경을 빼고 임계 값을 적용하고, 입자 분석하여 애벌레를 식별합니다. 다섯 차선 애벌레 분석을위한 가장 최신의 매크로 Zebrafish_macro25k입니다. 이미지의 개수, 차감 할 컬러, 이미지 임계 값 등을 설정하는 매크로 프롬프트를 사용하여 </li><li> 모든 이미지는 ImageJ에 매크로를 실행 한 후 결과 파일이 표시되며 X가 포함됩니다, y는 이미지 번호와 레인 번호와 함께 각 이미지에 대한 개별 애벌레의 좌표. </리&gt; <li> 결과 파일은 엑셀 형식으로 저장 한 후 빈 배경 대 움직이는 바 배경도 수에 따라 정렬되어야합니다. Excel 서식 파일은 자동으로 우물 애벌레의 배치를 결정 내장 방정식, 유충 사이의 거리, 이동 속도, 나머지 금액을 가지고 사용되어야한다. 가장 최근의 엑셀 템플릿은 25ib 요청시 사용할 수있는, Creton 실험실에서 만들어집니다. 다양한 치료 그룹을 보여주는 그래프 치료 그룹과 통제의 비교를위한 t-테스트와 함께 엑셀 시트에 내장되어야한다. 또한 통계 분석은 SPSS를 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 지속적으로 새로운 행동 분석을 개선하는 동안, 그것은 항상 회피 zebrafish의 유충 15 thigmotaxis 동작의 검출에 유용하고있다. 많은 시련이 같은 사용 자극의 색으로, 분석의 결과를 최적화하기 위해 수행되었다, 레인 당 유충, 행동 분석의 길이 이상적인 숫자입니다. 이전에, 우리는 멀티 웰 플레이트 (6 또는 12 우물) 15,17,18를 사용했습니다. 그러나 최근에 우리는 우리가 하나의 분석 16 (그림 5)의 행동 조치의 큰 숫자를 수집 할 수 있도록 유충 큰 수영 공간을 만들 수있는 새로운 차선 형을 만들었습니다. 다른 수정은 파워 포인트 예의 B의 변형 (분석의 변경 이동이나 길이) 및 (우리는 또한 더 좁은 골목길 금형을)를 사용 레인의 크기를 이용하실 수 있습니다. 현재이 높은 처리량 자동화 시스템은 zebr의 행동의 넓은 범위를 측정 할 수있는 고유 한 기능입니다같은 속도, 회피, 다른 애벌레에 근접, 멀티 레인 접시에 thigmotaxis과 동시에 afish의 애벌레. 결과를 신속하게 얻을 수 있으며 유충의 큰 숫자는 영상의 시간에 분석 할 수 있습니다. 시스템이 설정 구축 저렴하고 빠르고 쉽게 둘 수 있습니다. 이 시스템의 한계는 3-D 움직임 zebrafish의 유충에서 평가 할 수없는 것입니다. 성인 zebrafish의 추적 자동화 시스템은 3-D 기능을 가지고 있으며 이러한 이동 또는 아래로 물 열 10,19에서와 같은 행동의 넓은 범위를 식별 할 수 있습니다. 또 다른 한계는 우리의 이미징 시스템은 현재 비디오 속도에서 높은 처리량 분석을 위해 최적화되지 않는 것입니다. 낮은 해상도 15 카메라를 설정할 때 동영상 속도 이미징이 가능하지만,이 하나의 플레이트에 분석을 제한합니다. 새로 만든 &quot;레인&quot;방법을 사용하여, 분석의 여러 부분은 정확한 방법으로 실행해야 할 필요가 있었다. T의 유충을 배치 할 때그는 차선, 그것은 플레이트는 노트북 화면의 상단에 위치 할 때까지 액체의 수준이 매우 얕은 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 차선 액체의 너무 많이 있다면, 유충 판의 주변으로 탈출합니다. 또한, 아가로 오스에 금형을 삽입 할 때,주의가 매우 느리게 형을 낮추기 위해주의해야합니다. 형이 너무 빨리 넣으면 거품 아가 형성되고 추가 유충으로 이미지 J 매크로에 의해 식별됩니다. 그것은 아가로 오스 레인도 약간 거품이 있다면, 그것은 새로운 것들을 만들기 위해 최선 것이 좋습니다. 미래에, 우리는 zebrafish의 애벌레 학습 등의 복잡한 행동을 분석하고 학습이 초기 개발에 독성 물질 및 의약품에 노출에 의해 영향을받을 수있는 방법을 조사하기 위해 행동 분석을 최적화하고 싶습니다. 우리는 현재 행동 결과 뇌 영역을 결정할 촉진 할 수있는 학습 행동을 분석하는 데 유용 할 수 있습니다 분석에 노력하고 있습니다개발하는 동안 특정 독성 물질이나 약품에 의해 영향을 미쳤다. 자동화 된 분석은 zebrafish의 유충 (20)이 분석의 동작을 배우는 것이 다 차선 접시에 강력한 회피 반응을 사용하여 높은 처리량 검사를 위해 수정할 수있는 수 있습니다 측정하기 위해 개발되었습니다. 우리는이 행동 분석은 의약품 및 독성 물질의 다수의 발달 효과를 테스트하기 위해 미래 연구에 사용될 수 있다고 제안한다. 이러한 연구는 특정 위험 요소에 대한 풍부한 정보를 제공하고 임산부와 어린이를위한 더 나은 건강 및 안전 지침을 설정에 기여하는 것이다.

제브라 피쉬는 유전 적, 발달 및 행동 과학 1-4 인기 모델이되고있다. 그들은 2-3 일 포스트 수정 (DPF)하여 chorions에서 부화 4-5 DPF에 의해 완벽하게 작동하는 기관을 개발하고, 7 DPF 5,6에 의한 행동의 큰 숫자를 나타냅니다. Zebrafish의 유충은 이상적 때문에 그들의 작은 크기 7,8의 높은 처리량 분석에 적합합니다. 소프트웨어 애벌레와 성인 zebrafish의 9-14의 행동의 자동 분석을위한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나,이 소프트웨어는 비싼 멀티 잘 접시에 zebrafish의 애벌레의 복잡한 행동을 측정하기위한 제한된 옵션이 있습니다. 우리가 설정하고 7 DPF의 zebrafish의 애벌레 15,16 다른 행동의 수를 정할 수있는 저렴 소설 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 시스템의 수에 배아 노출 후에 저희가 신속하고 효율적으로 미묘한 행동 이상을 테스트 할 수 있습니다제약 및 환경 독성 물질 16-18. 시스템 캐비닛의 상단에 집이 디지털 카메라 나무 캐비닛을 사용하여 만들어졌습니다. 카메라는 노트북이 15 위로 향하도록 화면 배치 캐비닛의 바닥에 아래로 직면 해있다. 시간 경과 영상은 차선 애벌레의 위치를​​ 캡처하는 데 사용됩니다. 애벌레는 노트북 화면의 상단에 위치하는 네 개의 멀티 잘 또는 다중 차선 번호판에 수납 할 수 있습니다. 우리는 애벌레의 가장자리 (thigmotaxis) 15,17쪽으로 멀리 이동 (회피)와 수영 응답 혐오 자극으로 파워 포인트 프레 젠 테이션을 사용합니다. 이미지는 자동 매크로, 색상 채널을 분할 배경 빼기 및 개별 유충을 식별 할 수있는 임계 값을 적용하는 데 사용되는 ImageJ에로 가져올 수 있습니다. 좌표는 각 이미지의 각 유충에 대해 나열하고 우리가 회피 thigmota을 계량하는 데 사용 엑셀 파일에 삽입 할 수 있습니다XIS 행동, 물고기 거리는 물고기, 속도, 나머지 16 량을 수영.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>That Pet Place</td><td>198262</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>그 Pet Place</td><td>214325</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>One well plates</td><td>Fisher</td><td>12-565-493</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Canon</td><td>EOS Rebel T1i</td><td></td></tr><tr><td>이미징 캐비닛</td><td>WoodCraft Towers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>노트북</td><td>Acer Aspire</td><td>Any는 15.6인치만 있으면 좋습니다. 1366 x 768 픽셀 해상도 및 220cd/m2의 밝기를 지원하는 LCD 화면.</td><td></td></tr><tr><td>카메라 렌즈</td><td>Canon</td><td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS 줌 렌즈</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 디퓨저</td><td>Pendaflex</td><td>52345</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>PowerPoint 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http:// rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>엑셀 2010</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>통계 소프트웨어</td><td>SPSS 20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

우리는 다 차선 접시에 7 일짜리 zebrafish의 유충의 행동 분석을위한 새로운 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 이 시스템은 파워 포인트 프레 젠 테이션을 통해 유충에 표시됩니다 자발적 행동과 혐오 자극에 대한 반응을 측정합니다. 촬영 된 이미지는 자동으로 색상 채널을 분할 ImageJ에 매크로로 분석되는 배경을 뺀 차선의 개별 애벌레 위치를 식별하는 임계 값을 적용합니다. 우리는 그 수영 속도, 차선의 가장자리 또는 측면에 대한 선호, 휴식 행동, thigmotaxis, 유충 사이의 거리 및 회피 행동을 정량화하기 위해 엑셀 시트에 좌표를 가져올 수 있습니다. 행동의 미묘한 변화는 쉽게 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동 분석을위한 유용하고, 우리의 시스템을 사용하여 감지됩니다.

우리의 이전 분석에서, 야생형 유충은 잘 (회피 동작) 아래로 수영하고 잘 (thigmotaxis 동작) (15)의 가장자리쪽으로 이동하는 공에 응답 튀는 공 혐오 자극 치료되는 사용. 우리는 나중에이 분석에 thigmotaxis 문제가 zebrafish의 유충 17 불안 관련 행동의 측정을 확인 하였다. 빈 흰색 배경에 비해 애벌레의 움직임에 큰 차이 멀리 공을 가장자리 환경에서이 있었다. 이러한 동작은 움직이는 빨간색 막대를 사용하여 우리의 새로운 분석에서 확인 된 더욱 강력한 16아르있다. 또한, 우리는 지금 수영 속도, 휴식, 우물의 끝이나 측면에 대한 선호와 물고기 사이의 거리 (그림 5)를 포함하는 하나의 분석에서 행동의 큰 숫자를 맛보실 수 있습니다. 계란 물에 성장 제어 유충 증가 선호 요리와 차선의 가장자리에 다운하는 방법을 보여줍니다따고는 그들이 혐오 자극 (빨간색 막대를 이동)에 관한 정보들로 안내되게됩니다. 유충은 1 ㎍ / ㎖ DMSO, 일반적으로 1,000 X 주식 솔루션 등 다양한 의약품 및 독성 물질을 분해하는 데 사용되는 용매를 포함하는 계란 물에서 재배하는 경우 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 대표 결과는 계란 물과 DMSO (컨트롤)와 일반적으로 비 유기농 식품에서 발견 된 유기 인계 농약의 다양한 농도로 처리 유충의 그림 5에 표시됩니다. 같은 결과는 하나의 실험에서 샘플링입니다. 그러나 반복 할 때, 결과는 수영 속도와 thigmotaxis 동작이 인간의 음식 소비를 18 레벨을 모방 유기 인계 살충제의 낮은 농도로 변경되었음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> 그림 1. 컬렉션 트레이. 유리 파이렉스 접시는 전자를 수집하는 데 사용됩니다성인 물고기 탱크에서 mbryos. 파이렉스 접시의 뚜껑을 잘라 플라스틱 그리드, 녹색 실이 플라스틱 격자에 놓은 된이 삽입되었다. 이 자연 환경을 모방하여 성인 zebrafish에 대한 번식 분위기를 연출합니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> 그림 2. 플라스틱 금형 및 아가 레인. A) 형은 왼쪽에 표시됩니다. 0.8 % 아가로 오스는 한 - 웰 플레이트에 붓고, 곰팡이가 천천히 삽입 아가로 오스가 냉각되면 다음 제거 B) 오른쪽의 플레이트 플라스틱 금형에 의해 아가 만든 차선을 보여줍니다.. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> 그림 3. 영상 캐비닛. 이미징 캐비닛의 speciall했다y를 우리의 실험실에서 구축하고 높은 처리량 행동 분석에 사용됩니다. 15 메가 픽셀 디지털 카메라는 노트북의 화면 상단에 배치 다 차선 접시에 애벌레의 시간 경과 이미지를 수집하기 위해 아래를 향 캐비닛의 상단에 부착되었다. 접시와 화면 사이에 수집 된 이미지에 물결 무늬 패턴을 방지하기 위해 사용되는 플라스틱 디퓨저가있다. <img alt="그림 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> 그림 4. 빈 배경 및 PowerPoint 혐오 자극.이 zebrafish의 애벌레의 행동 변화를 연상하는 데 사용되는 현재의 파워이다. 그것은 A) 빈 배경 및 B) 이동 빨간색 막대 사이의 강력한 행동의 차이를 제공합니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> 그림 5. 높은 처리량 분석에서 정량화 된 행동. 우리는 X, 유충의 Y 좌표에 사용하는 엑셀 시트에서 우리의 행동 분석에서 정량화 행동의 예. 흰색 막대가 빈 배경에 노출 빨간색 막대는 PowerPoint에서 빨간색 이동 막대에 노출 된 유충에서 데이터를 표시 애벌레에서 데이터를 표시합니다. 그래프는) B, 차선의 끝에 유생의 백분율 C) 차선의 가장자리에 애벌레의 백분율 D) 거리 사이에 차선 유충) 비율 다운 행동 분석에서 얻을 수있는 측정을 나타냅니다 물고기 (mm), E)의 유충 (mm / 분), F) 유충의 백분율 나머지 속도를 수영. 그림 그래프, 데이터 트리트에서이다DMSO 제어 및 0.001에서 0.1 μM (일반적으로 인간의 식단에서 발견 된 수준)에 이르기까지 농약의 여러 농도의 유충 후 ENT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

본 실험 절차의 전체적인 목적은 독성 물질이나 의약품 처리 후 제브라피쉬 치어에서 나타나는 행동 결함을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 배아 또는 치어를 수집하여 발달 초기 7일까지 화학 물질로 처리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 특수 설계된 몰드를 사용하여 어그로(agro) 수영 레인을 만드는 것입니다.다음으로, 처리된 유충을 agros 레인에 넣고 타임랩스 촬영을 통해 행동 분석을 수행합니다. 마지막 단계는 이미지를 Image J로 가져와 자체 제작한 특정 매크로를 사용하여 레인 내 유충의 XY 좌표 데이터를 수집하는 것입니다. 최종적으로, 이 고처리량 행동 분석법을 통해 처리군 간의 회피 및 figma 축 행동뿐만 아니라 수영 속도와 휴식 시간의 차이를 확인합니다.시중에서 판매되는 제품과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 가진 주요 장점은 더 복잡한 행동을 관찰할 수 있다는 점입니다. 또한 제작 비용이 저렴하고 설치가 간편합니다. 이 방법은 초기 배아 노출 기간 동안 독성 물질이 뇌 발달과 행동에 어떤 영향을 미치는지와 같이, 행동 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.또한 이는 현재의 다른 독성 스크리닝으로는 발견할 수 없는 인간의 미세한 뇌 결함에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 유충을 포집하는 것이 어려워 고전할 수 있습니다. 프로토콜에 맞춤 제작된 시스템이 포함되어 있어 단계별 학습 과정이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.이 절차를 시작하려면, 녹색 실로 만든 인조 잔디가 들어 있는 Pyrex 유리 접시를 수조에 넣으십시오. 새벽에 접시를 수조에 2시간 동안 두어 제브라피쉬 배아를 수집합니다. 배아가 담긴 유리 접시의 내용물을 탈이온수로 헹군 핸드 스트레이너에 붓습니다.다음으로, 탈이온수에 instant ocean 60 mg/L와 곰팡이 억제제로 사용되는 methylene blue 0.25 mg/L가 포함된 난수(egg water)에서 배아를 배양합니다. 배아는 독성 물질을 처리할 준비가 될 때까지 50 mL당 50~60마리의 유생 밀도로 수용하거나 더 큰 사육 탱크에서 배양할 수 있습니다. 개별 실험의 가설에 따라, 독성 물질이나 의약품을 사용하여 즉시 또는 발달의 특정 단계에서 배아를 처리할 수 있으며, 이러한 물질들은 일반적으로 DMSO에 용해한 후 난수 배지에서 추가로 희석하여 사용합니다.배아 및 유충 처리 과정에서 비디오 시연을 위해 파란색 색소가 사용되었습니다. 유충과 배아는 수정 후 7일째에 행동 분석을 수행할 때까지 50 mL당 약 50~60마리의 밀도로 깊은 페트리 접시에 보관할 수 있으며, 죽은 배아로 인한 곰팡이나 박테리아의 증식을 방지하기 위해 최소 이틀에 한 번씩 난수 용액을 교체해 줍니다. Thermo Scientific사의 싱글 웰 플라스틱 플레이트에 아가로스를 부어 레인을 만들기 위해 플라스틱 몰드를 제작하였습니다.몰드는 측면이 60도 각도로 기울어진 5개의 레인으로 구성되어 있습니다. 몰드와 플레이트의 크기는 이 비디오에 첨부된 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 먼저, 탈이온수에 60 milligrams per liter의 instant ocean을 혼합한 후 0.8% aros를 녹여 aros를 준비합니다.다음으로, 녹인 agarose 50 milliliters를 단일 웰 플레이트에 부어 레인을 생성합니다. 그 다음, 기포 형성을 방지하기 위해 액체 상태의 agarose 위에 몰드를 매우 천천히 올립니다. agarose가 식으면 몰드를 제거합니다.aros 레인은 디쉬 뚜껑을 닫은 상태로 상온에서 최대 36시간 동안 보관할 수 있습니다. 고처리량 행동 분석을 위해, 이미징 캐비닛 상단에는 15메가픽셀 디지털 카메라를 부착하여 캐비닛 바닥면을 향하도록 준비합니다. 15.6인치 화면의 노트북을 화면이 위를 향하도록 배치합니다.유충의 과열을 방지하기 위해, 화면 온도가 28 °C를 넘지 않는 노트북을 사용하는 것이 가장 좋습니다. agros 플레이트를 배치할 노트북 화면 위에 플라스틱 디퓨저를 놓으십시오. 디퓨저는 수집된 이미지에 더 많은 패턴이 나타나는 것을 방지해 줍니다.이미지 캡처를 시작하려면, 유충의 스트레스를 줄이기 위해 페트리 접시에서 agros 레인으로 유충을 조심스럽게 옮깁니다. 각 레인에 최대 20마리의 유충을 배치할 수 있으나, 일반적으로는 유영 속도를 가장 정확하게 추적하고 실험당 필요한 유충 수를 줄이기 위해 레인당 5마리를 사용합니다. 실험 조건에 따라 약물이나 독성 물질 포함 여부를 결정하여 레인을 난배양액으로 채웁니다. 넘침을 방지하기 위해 이미징 캐비닛에 배치하기 전까지는 레인을 끝까지 채우지 마십시오.순화 기간 이후 유충이 적응할 수 있도록 10분 동안 둡니다. 플레이트 4개를 노트북 화면 바로 위에 손으로 배치합니다. 이때, 레인의 가장자리에 생기는 그림자를 제거하기 위해 레인 상단과 수평이 되도록 알, 물 또는 화학 처리제를 채워 넣을 수 있습니다.이미지 프로그램에서 타임랩스 촬영을 위해 컴퓨터를 설정하여, 실험당 총 300장의 이미지를 얻을 수 있도록 6초마다 사진을 촬영하십시오. 비디오 속도로 촬영하기 위해 카메라를 낮은 해상도로 설정하십시오. 낮은 해상도를 사용하면 기록 범위가 단일 멀티웰 플레이트로 제한됩니다.비디오 녹화는 빠른 수영 이벤트를 촬영하는 데 적합합니다. 본 시연에서는 유충에게 혐오 자극을 주기 위해 PowerPoint 프레젠테이션을 사용합니다. PowerPoint는 15분 동안 빈 흰색 배경으로 시작하며, 이어서 15분 동안 플레이트의 상단 절반에 움직이는 빨간색 막대가 표시됩니다.aros 레인 내부 액체의 증발을 방지하려면, 최대 이미징 시간을 1시간 미만으로 유지하십시오. 본 시연에서는 Image J로 이미지를 엽니다. 5개 레인 유충 분석을 위한 자체 제작 매크로가 사용되었으며, 요청하는 모든 사용자에게 제공 가능합니다.매크로의 프롬프트를 사용하여 이미지 수 및 제거할 색상과 같은 파라미터를 설정하십시오. 그러면 매크로가 자동으로 색상 채널을 분리하여 빨간색을 제거할 수 있게 합니다. 배경을 제거한 후 임계값을 적용하고 파티클 분석을 통해 유충을 식별합니다.모든 이미지를 Image J 매크로로 처리하면 결과 파일이 표시되며, 여기에는 이미지 번호 및 레인 번호와 함께 각 이미지 내 개별 유충의 XY 좌표가 포함됩니다. 결과 파일을 Excel 형식으로 저장하고, 빈 배경과 이동 바 배경을 기준으로 정렬한 후 웰 번호순으로 정렬하십시오. 수식이 내장된 Excel 템플릿을 사용하여 웰 내 유충의 배치, 유충 간 거리, 이동 속도 및 휴식 시간을 자동으로 산출하십시오.Cretin 연구실에서 작성한 최신 Excel 템플릿은 요청 시 제공되며, 이 시트에는 다양한 처리군을 보여주는 그래프 생성 기능과 처리군 및 대조군 간의 비교를 위한 T-test 기능이 포함되어 있습니다. 추가적인 통계 분석은 SPSS 통계 프로그램을 사용하여 수행할 수 있습니다. 결과는 대조군으로 egg water와 DMSO를 처리한 유충과, 비유기농 식품에서 흔히 발견되는 유기인계 살충제의 다양한 농도를 처리한 유충에 대해 나타내었습니다.여기서 흰색 막대는 빈 배경에 노출된 유충의 데이터를 나타내며, 빨간색 막대는 빨간색 이동 막대에 노출된 유충의 데이터를 나타냅니다. 대조군. 난수(egg water)에서 성장한 유충은 이동하는 빨간색 막대가 제시된 후 배양 접시 바닥에 머무르려는 선호도가 증가하는 것을 보여줍니다. 다양한 의약품 및 독성 물질을 1000배 농도의 스톡 용액으로 녹이는 데 흔히 사용되는 용매인 DMSO 1 µg/mL가 포함된 난수에서 유충을 성장시켰을 때도 유사한 결과가 얻어졌습니다.그래프는 레인 하단에 위치한 유충의 백분율, 레인 끝에 위치한 유충의 백분율, 레인 가장자리에 위치한 유충의 백분율, 유충의 유영 속도 간 거리, 유충이 휴식 상태에 있는 시간의 백분율을 포함하여 행동 분석을 통해 얻을 수 있는 측정값들을 나타냅니다. 표시된 결과는 한 번의 실험에서 샘플링한 것입니다. 그러나 반복 실험 시, 결과는 인체 식품 내 수준과 유사한 저농도의 유기인계 살충제에 의해 유영 속도와 figma 행동이 변화함을 보여줍니다. 숙달되면, 적절하게 수행할 경우 이미징 및 이미징 분석은 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에서 가장 중요한 점은 매일 새로운 배지로 교체하여 배양 배지를 깨끗하게 유지하는 것을 기억하는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

이 비디오는 제브라피시 유충의 회피 및 도둑 모타시스 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 혐오 자극에 반응하는 제브라피시 유충의 행동을 조사합니다.

제브라피시 회피 및 티그모타시스 분석: 혐오스러운 시각적 자극에 대한 반응으로 유충의 행동을 조사하는 고처리량 방법

이 기사는 유충의 이동을 모니터링하여 독성 화합물에 대한 제브라피쉬의 행동 반응을 설명합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질에 대한 제브라피시 유충의 반응 예를 더 자세히 살펴봅니다.

Larval Locomotion Assay: 제브라피시 유충에서 화합물의 신경행동 독성을 연구하기 위한 고처리량 방법

제브라피쉬의 개별 및 그룹을 추적할 수 있는 3D 자동 비디오 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 응용 사례로, NMDA 수용체 길항제 MK-801이 제브라피시 떼에 미치는 영향을 조사합니다.

기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

여기서, 우리는 DEPDC5 유전자의 일시적인 억제로 인한 간질의 제브라피시 모델의 개발 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시한다.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

이 원고는 성인 제 브라 피시에서 행동 하는 스트레스를 측정 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 이 접근법은 zebrafish가 스트레스가 많은 상태일 때 탱크의 아래쪽 절반을 선호 하는 타고 난 경향을 활용 합니다. 우리는 또한 약리학으로 분석을 결합 하는 방법을 설명 합니다.

제 브라 피시에서 선천적인 스트레스를 연구 하는 행동 접근법

이 프로토콜은 MPTP 처리된 제브라피시 유충에서 파킨슨병 유사 운동 및 비운동 결손을 평가하기 위한 행동 표현형 패러다임을 확립합니다.

행동 실험을 기반으로 한 제브라피시 유충에서 MPTP 유도 파킨슨 유사 행동 표현형의 표현형 프로파일링

학습하세요 Danio rerio 유충을 이용한 고처리량 자동 행동 분석 방법으로 독성 물질에 의한 행동 결함을 탐지합니다. 이 기술은 신경행동학 연구에서 뇌 발달과 행동 변화를 효율적으로 분석할 수 있게 합니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

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