Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

이 절차의 전반적인 목표는 독성 물질 또는 의약품으로 처리한 후 제브라피시 유충의 행동 결함을 식별하는 것입니다. 이것은 먼저 배아 또는 유충을 수집하고 발달 첫 7일까지 화학 물질로 처리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 특별히 설계된 주형을 사용하여 농업 수영 레인을 만드는 것입니다.

다음으로, 처리된 유충은 타임랩스 사진을 사용하여 행동 분석을 위해 아그로스 레인에 배치됩니다. 마지막 단계는 이미지를 이미지 J로 가져오고 레인에 있는 유충의 XY 좌표 데이터를 수집하기 위해 사내에서 작성된 특정 매크로를 사용하는 것입니다. 궁극적으로, 고처리량 행동 분석법은 회피 및 피그마 축 행동뿐만 아니라 치료 그룹 간의 수영 속도 및 휴식의 차이를 찾는 데 사용됩니다.

상업적으로 이용 가능한 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 우리의 방법을 사용하여 더 복잡한 동작을 관찰할 수 있다는 것입니다. 또한 구축 비용이 저렴하고 설정이 쉽습니다. 이 방법은 독성 물질이 초기 배아 노출 시 뇌 발달 및 행동에 어떤 영향을 미치는지와 같은 행동 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 현재의 다른 독성 검사로는 찾을 수 없는 인간의 미묘한 뇌 결함에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 유충을 잡는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 프로토콜에 사용자 지정 구축 시스템이 포함되기 때문에 단계에 학습 곡선이 있기 때문에 매우 중요합니다.

이 절차를 시작하려면 녹색 실로 만든 인조 풀이 있는 유리 파이렉스 접시를 탱크에 삽입하십시오. 새벽녘에는 제브라피시 배아를 채취하기 위해 접시를 수조에 2시간 동안 그대로 두십시오. 배아가 들어 있는 유리 접시를 휴대용 여과기 위에 탈이온수를 붓습니다.

다음으로, 탈이온수 중 순간 바다 리터당 60mg과 곰팡이 억제제로 사용되는 메틸렌 블루 리터당 0.25mg을 함유한 난수에서 배아를 성장시킵니다. 배아는 50밀리리터당 50-60마리의 유충 또는 배아가 독성 물질로 처리할 준비가 될 때까지 더 큰 번식 탱크에 보관할 수 있습니다. 개별 실험의 가설에 따라 배아는 일반적으로 DMSO에 용해된 다음 난자 수분 배지에서 직접 더 희석되는 독성 물질 또는 의약품을 사용하여 즉시 또는 특정 발달 단계에서 처리할 수 있습니다.

파란색은 배아 및 유충 처리 중 비디오 시연 목적으로 사용됩니다. 유충과 배아는 50 밀리리터당 약 50-60마리의 유충 밀도로 깊은 페트리 접시에 보관할 수 있으며, 수정 후 7일째에 행동 분석을 통해 죽은 배아에서 곰팡이 또는 박테리아가 자라는 것을 방지하기 위해 적어도 이틀에 한 번씩 난자 수용액을 교체합니다. 플라스틱 몰드는 Thermos Scientific의 단일 웰 플라스틱 플레이트에 붓는 aros를 사용하여 레인을 만들기 위해 제작되었습니다.

금형에는 측면이 60도로 기울어진 5개의 레인이 있습니다. 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에서 금형과 플레이트의 치수를 확인하시겠습니까? 먼저 인스턴트 바다 리터당 60mg으로 탈이온수에 0.8%aros를 녹여 aros를 준비합니다.

다음으로, 용융된 aros 50ml를 단일 웰 플레이트에 부어 레인을 생성합니다. 그런 다음 거품 형성을 제거하는 액체 aros 위에 금형을 아주 천천히 놓습니다. aros가 냉각되면 곰팡이를 제거하십시오.

aros lanes는 접시 뚜껑을 닫고 최대 36시간 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 고처리량 동작 분석을 위해 이미징 캐비닛은 15메가픽셀 디지털 카메라를 캐비닛 상단에 부착하고 캐비닛 하단에서 아래쪽을 향하도록 준비합니다. 15.6인치 화면 노트북은 화면이 위를 향하도록 배치됩니다.

유충의 과열을 방지하기 위해서는 화면 온도가 섭씨 28도를 넘지 않는 노트북을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 아그로스 플레이트가 놓일 노트북 화면 위에 플라스틱 디퓨저를 놓습니다. 디퓨저는 수집된 이미지에서 더 많은 패턴을 방지합니다.

이미지 캡처를 시작하려면 유충 스트레스를 줄이는 데 도움이 되도록 유충을 페트리 접시에서 아그로스 레인으로 조심스럽게 이동합니다. 각 레인에는 최대 20마리의 유충을 배치할 수 있지만, 일반적으로 레인당 5마리의 유충을 사용하여 수영 속도를 가장 정확하게 추적하고 실험당 필요한 유충 수를 줄이고 실험에 따라 의약품이나 독성 물질의 유무에 관계없이 계란 물로 레인을 채웁니다. 넘침을 방지하기 위해 이미징 캐비닛에 넣을 때까지 레인을 끝까지 채우지 마십시오.

유충이 순응 기간 후에 적응할 때까지 10분을 기다립니다. 4개의 플레이트를 노트북 화면 바로 위에 직접 손으로 놓습니다. 이때 레인은 계란, 물 또는 화학 처리로 채워져 레인 상단과 수평이 되도록 하여 레인 가장자리의 그림자를 제거할 수 있습니다.

이미지에서 타임랩스 촬영을 위해 컴퓨터를 프로그래밍하고 실험당 총 300개의 이미지를 위해 6초마다 사진을 찍습니다. 비디오 속도로 이미징하기 위해 카메라를 더 낮은 해상도로 설정하십시오. 해상도가 낮을수록 기록이 단일 다중 웰 플레이트로 제한됩니다.

비디오 녹화는 빠른 수영 경기를 촬영하는 데 적합합니다. 이 데모에서는 PowerPoint 프레젠테이션을 유충에 대한 혐오적 자극으로 사용합니다. PowerPoint는 15분 동안 빈 흰색 배경으로 시작한 다음 접시의 위쪽 절반에 움직이는 빨간색 막대 15개가 이어집니다.

aros 레인 내에서 액체가 증발하는 것을 방지하려면 최대 이미징 시간을 1시간 미만으로 유지하십시오. 이 데모에서 이미지 J가 있는 이미지를 엽니다. 5레인 유충 분석을 위한 사내 매크로가 사용되며 모든 사용자가 사용할 수 있습니다.

매크로의 프롬프트를 사용하여 뺄 이미지 수 및 색상과 같은 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 매크로는 빨간색을 제거할 수 있도록 색상 채널을 자동으로 분할합니다. 배경을 빼고, 임계값을 적용하고, 입자 분석을 통해 유충을 식별합니다.

모든 이미지가 이미지 J 매크로를 통해 실행된 후 결과 파일이 표시되고 이미지 번호 및 차선 번호와 함께 각 이미지에 대한 개별 유충의 XY 좌표가 포함됩니다. 결과 파일을 Excel 형식으로 저장하고 빈 배경과 이동 막대 배경, 그리고 웰 번호를 기준으로 정렬합니다. 방정식이 내장된 Excel 템플릿을 사용하여 우물 내 유충의 위치, 유충 사이의 거리, 이동 속도 및 휴식량을 자동으로 결정합니다.

Cretin 실험실에서 만든 최신 Excel 템플릿은 요청 시 다양한 치료 그룹을 Excel 시트에 보여주는 빌드 그래프와 함께 치료 그룹과 대조군 간의 비교를 위한 T 테스트와 함께 사용할 수 있습니다. SPSS 통계 프로그램을 사용하여 추가 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 결과는 달걀 물과 DMSO로 처리된 유충과 대조군으로 비유기농 식품에서 흔히 발견되는 유기인산염 살충제의 다양한 농도에 대한 것으로 나타났습니다.

여기서 흰색 막대는 빈 배경에 노출된 유충의 데이터를 나타내고 빨간색 막대는 빨간색 이동 막대에 노출된 유충의 데이터를 나타냅니다. 제어. 달걀 물에서 자란 유충은 움직이는 빨간 막대가 제시된 후 접시에 내려있는 것을 선호합니다. 다양한 의약품 및 독성 물질을 1000 x 원액으로 용해하는 데 일반적으로 사용되는 용매인 DMSO가 1밀리리터당 1마이크로그램인 계란 물에서 유충을 성장시킬 때도 유사한 결과를 얻을

그래프는 차선에 있는 유충의 비율, 차선 끝에 있는 유충의 비율, 차선 가장자리에 있는 유충의 비율, 물고기 사이의 거리, 유충의 수영 속도, 유충이 쉬고 있는 시간의 백분율을 포함하여 행동 분석에서 얻을 수 있는 측정값을 나타냅니다. 표시된 결과는 한 실험의 표본입니다. 그러나 반복할 때 결과는 인간 음식의 수준을 모방하는 저농도의 유기인산염 살충제에 의해 수영 속도와 무화과 행동이 변경된다는 것을 나타냅니다. 일단 마스터하면 이미징 및 이미징 분석이 제대로 수행되면 한 시간 반 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차의 가장 중요한 측면은 매일 새로운 매체로 교체하여 문화 매체를 깨끗하게 유지하는 것을 기억하는 것입니다.