Name: 그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 배우세요 그람 음성 박테리아에서 지질 A를 분리하고 탠덤 질량 분석법으로 구조를 특성화하는 방법을. 이 기술은 항생제 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 또한 JSB에 R01GM103655을 부여 웰치 재단의 F1155 및 NIH에 의해 지원되었다 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금 AI064184 및 AI76322에 의해 MST 연구에 육군 연구 사무실에서 그랜트 61789-MA-MUR에 의해 지원되었다

<ol><li>Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+endotoxin+and+its+impact+on+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+endotoxin+research%22%5BJournal%5D)">Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis.</a> Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).</li>
<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+Modification+Systems+in+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+TLR4-MD-2+complex+with+bound+endotoxin+antagonist+Eritoran%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran.</a> Cell. 130, 906-917 (2007).</li>
<li>Rietschel, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin%3A+molecular+relationships+of+structure+to+activity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Innate immunity.</a> The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+interleukin-1+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism.</a> Blood. 77, 1627-1652 (1991).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+acylation+and+bacterial+resistance+against+vertebrate+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.</a> Cell. 95, 189-198 (1998).</li>
<li>Yi, E. C., Hackett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+method+for+lipopolysaccharide+and+lipid+A+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria.</a> The Analyst. 125, 651-656 (2000).</li>
<li>Westphal, O. aJ., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Lipopolysaccharide.+Extraction+with+phenol-water+and+further+application+of+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohydr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure.</a> Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).</li>
<li>Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+extraction+of+R+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">A new method for the extraction of R lipopolysaccharides.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).</li>
<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
<li>Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+unmodified+endotoxin+preparations+by+252Cf+plasma+desorption+mass+spectrometry.+Determination+of+molecular+masses+of+the+constituent+native+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides.</a> The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+biochemistry+and+physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biosynthesis+of+free+lipid+A+molecules+that+replace+lipopolysaccharide+in+Francisella+tularensis+subsp.+novicida%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida.</a> Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).</li>
<li>Strain, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+polar+substituents+and+fatty+acyl+chains+on+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octulosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium.+Studies+by+1H%2C+13C%2C+and+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).</li>
<li>Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR+and+UV+Photodissociation+as+Analytical+Tools+for+Characterizing+Lipid+A+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry+%28Washington%2C+DC%2C+United+States%22%5BJournal%5D)">IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures.</a> Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).</li>
<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+acylation+of+Vibrio+cholerae+lipopolysaccharide+requires+phosphorylation+of+Kdo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).</li>
<li>Hankins, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+novel+Vibrio+cholerae+lipid+A+secondary+hydroxy-acyltransferase+and+its+role+in+innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition.</a> Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).</li>
<li>Chan, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+characterization+of+lipid+A%3A+electrospray+ionization+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).</li>
<li>Boue, S. M., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+structure+of+lipid+A+from+Enterobacter+agglomerans+by+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).</li>
<li>Kussak, A., Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole+ion-trap+mass+spectrometry+to+locate+fatty+acids+on+lipid+A+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria.</a> Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).</li>
<li>El-Aneed, A., Banoub, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+molecular+structure+of+lipid+A+isolated+from+both+a+rough+mutant+and+a+wild+strain+of+Aeromonas+salmonicida+lipopolysaccharides+using+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).</li>
<li>Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+advances+in+lipidomica%3A+collision-induced+decomposition+of+Kdo2-lipid+A%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).</li>
<li>Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lipid+A+from+Escherichia+coli+O157%3AH7%3AK-+using+thin-layer+chromatography+and+ion-trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Li, J., Altman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+lipid+A+region+of+Aeromonas+salmonicida+subsp.+salmonicida+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide.</a> Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).</li>
<li>Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+lipid+A+from+nontypeable+and+type+f+Haemophilus+influenzae%3A+variability+of+fatty+acid+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution.</a> Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).</li>
<li>Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacterial+lipid+A+analysis+by+negative+electrospray+ion+trap+mass+spectrometry%3A+Stepwise+dissociations+of+deprotonated+species+under+low+energy+CID+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions.</a> Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).</li>
<li>Silipo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterizations+of+lipids+A+by+MS%2FMS+of+doubly+charged+ions+on+a+hybrid+linear+ion+trap%2Forbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer.</a> J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrophosphorylated+forms+of+lipid+A+in+gram-negative+bacteria+using+a+multivaried+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structure+characterization+of+lipid+A+extracted+from+Yersinia+pestis+for+determination+of+its+phosphorylation+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 우리는 박테리아의 전체 세포에서 지질 종의 분리를 자세히 설명하고, 화학적으로이 절연 재료의 특성을 TLC 또는 MS 기반의 분석 방법을 설명했다. 텐덤 질량 분석법은 생물학적 화합물의 드 노보 구조적 특성에 대한 강력한 전략이며, 자연에서 볼 수있는 지질 분자의 갑옷의 한 벌의 화학적 특성 분석을위한 매우 중요한 이점입니다. CID 및 UVPD 지질 분자에 대한 키 지문을 제공하는 제품 이온의 종류를 만드는 두 가지 보완 정품 인증 방법입니다. CID 및 UVPD을 모두 사용하여 MS / MS 조각화 할 수 있습니다 화학 구조 할당에 대한 정밀한 세부 사항을 제공하는 지질 구조의 미묘한 차이의 해명. 이러한 유형의 데이터는 지질 분자 종의 생물학에 정확한 상관 관계 구조 / 기능 관계를 구축 할 필요가 있습니다. 또한 발에 32 P-방사성 표지 지질 종을위한 절차를 설명했다32 P-지질 종의 화학 패턴이 TLC 및 오토 라디오 그래피를 사용하여 시각화 할...

지질 다당류 (LPS)는 거의 모든 그람 음성균의 주요 외부 표면 분자이며 세 분자 도메인으로 구성 원위 O-항원 다당류, 코어 올리고당, 및 막 - 관련 지질의 외측 전단지에 증착 도메인 외막 이중층 1,2. 지질 도메인은 지질이 약한 산 가수 분해 1시 LPS의 클로로포름 가용 부분으로 정의 할 수 있습니다 3 - 데 옥시-D-Manno의 10 월 2 ulosonic (KDO) 잔류 물과 지질 분자 종으로 구성 2. 모델 생물 대장균 (E. 콜라이) 1,2 관찰 주요 지질 종과 일치; 표준 지질 분자는 화학적 헥사 아 실화 및 비스 - 인산화 diglucosamine 백본으로 정의 될 수있다. 그람 음성 박테리아에 걸쳐 보존 나인 구조적으로 표현 된 유전자는 지질의 생산 도메인 (그림 1) 1, 2에 대한 책임이 있습니다. 대부분의 박테리아는 지질 3의 추가 화학적 변형에 참여 계통 보호의 정도에 차이가 유전자의 추가 집합을 보유하고 있습니다. 탈 인산화, 아실 사슬의 제거와 같은 아미노 당 (예 aminoarabinose) 및 / 또는 phosphoethanolamine 화학적 잔기의 첨가는 일반적으로 관찰 활동 (도 1)이다. 지질 변형에 대해 책임 효소의 많은 직접적 가의 양이온 등의 환경 신호에 의해 활성화되고, 또는 그 발현이 성분 응답 레귤레이터 시스템 (3)에 의해 규제된다. 호스트 타고난 면역 시스템에 의해 지질 종의 인식은 수신자 같은 수용체 4/myeloid 분화 인자 2 (TLR4/MD2) 공동 수용체 (4)에 의해 매개된다. MD2와 지질 아실 체인뿐만 아니라 TLR4 및 지질의 1 및 4 &#39;인산기 립의 강한 연관을 촉진 간의 소수성 세력TLR4/MD2 4,5와 아이디. 실화 상태 또는 지질의 음전하 영향 TLR4/MD2 기반 지질을 변경 수정은 인식과 타고난 면역 반응의 하류 자극은 NF-κB와 같은 TNFα와 IL1-β 6,7와 같은 염증 매개 활성제. 지질의 음전하 마스크 수정은 세포 표면 3,8를 음성에게 그램 바인딩에서 살균 양이온 항균 펩타이드를 방지합니다. 많은 지질의 수정은 이러한 인간의 호스트 내부 또는 생태 학적 틈새 시장과 같은 특정 환경 조건에서 세균의 체력을 증가하는 가정합니다. 이러한 이유로 많은 수정 효소는 항균 화합물의 합리적인 개발에 매력적인 대상입니다. 지질 구조체의 화학적 다양성, 유기체 및 / 또는 환경, 이러한 다양한 구조의 생물학적 영향에 대하여 지질의 구조적 특성화 t에서 중요한 노력을하게그는 그람 음성 박테리아의 연구. 전체 박테리아 지질 분자의 분리는 최종 정제 절차 9-11이어서 세균 세포 표면으로부터 LPS의 추출, 지질을 해방하는 가수 분해 단계를 포함한다. 가장 자주 인용 LPS 추출 절차는 첫 번째 웨스트 팔과 쟌 (10)에 의해 도입, 핫 페놀 물 추출 절차입니다. 추출 전체 LPS는 화학적으로 지질의 말단 글루코사민 설탕 (그림 1)의 6&#39;-히드 록에서 KDO을 분리 약한 산 가수 분해를 받게되면. 수많은 함정 높은 위험 시약의 사용 등 핫 페놀 물 절차 존재 공동 추출한 핵산 및 단백질, 며칠을 분해 할 필요가 프로토콜 (10)을 완성해야한다. 첫 번째 Caroff 및 Raetz (12, 13)에 의해 개발 된 우리의 실험실은 또한 지질의 추출 및 분리를 개발했습니다. 핫 페놀 물 절차에 비해, 여기에서 제시된 방법은보다 신속하고 효율적이며 5 ㎖에서 체류 리터 배양 부피의 넓은 범위를 수용한다. 또한, 핫 페놀 물 추출과는 달리, 우리의 방법은 지질 종의 최적의 복구를 제공, LPS의 거친 또는 부드러운 유형을 선택하지 않습니다. 우리의 프로토콜에서, 전체 박테리아 세포의 화학적 용해는 LPS는 원심 분리에 의해 펠릿 화 될 수 클로로포름, 메탄올 및 물을 혼합하여 수행된다. 약한 산 가수 분해 및 용매 추출 (Bligh 고 - 다이어)의 조합은 공유 연결된 다당류에서 지질을 해방하는 데 사용됩니다. Bligh 고 및 다이어의 방법은 제 14의 조직은, 동물 및 식물의 다양한 지질 종의 추출에 적용이 최종 분리 단계 지질 A.에서 가수 분해 된 폴리 사카 라이드를 분리하는 여기 변성시키고, 클로로포름에 용해 지질 선택적 하부 유기적으로 분할 상. 또한, 지질를 정화하는 역상 또는음이온 교환 칼럼 크로마토 그래피 (12)를 사용할 수있다. 전체 세포에서 지질 종의 분리 후, 분석 방법의 수는 NMR, TLC 및 MS-기반 분석과 같은 절연 물질의 화학 구조를 특성화하기 위해 사용될 수있다. NMR은 비파괴 구조 규명이 가능하고, 글리코 시드 결합, 아실 체인 위치의 명백한 할당, aminoarabinose 또는 phosphoethanolamine 15-17와 같은 지질 수정에 대한 첨부 파일 사이트의 할당과 관련된 구조적인 세부 사항을 제공합니다. 지질의 NMR 분석은 우리의 프로토콜 내에서 설명되지 않지만, 그 밖에 15,16 충분히 설명되었다. 신속한 분석을 위해 TLC 방법이 자주 사용하는 기반으로하지만, 정밀 화학 구조에 대한 직접적인 정보를 제공하기 위해 실패합니다. MS 기반 프로토콜은 지질 구조 (18, 19)의 특징을 가장 자주 사용되는 방법이다. 매트릭스 연관된 레이저 탈착 이온화 (MALDI)-MS는 종종 처음 그대로 지질 종을 조사하는 데 사용됩니다. 단독으로 하전 된 이온을 분석 우리의 추출 절차에 따라 제조에서 생성됩니다. 더 미세 구조 분석이 요구되기 때문에, MS / MS 기반의 방법은 MALDI-MS보다 더 많은 정보를 증명한다. 구조적으로 정보를 제품의 이온 18,20,21를 생성하기 위해, (ESI) 전구체 이온이 충돌 유발 분해 (CID) 또는 자외선 광분해 (UVPD)에 의해 더 조각난 단일 또는 다중 충전 지질 이온화 전기 분무에 결합. 전구체 이온으로부터 중성 지질 감소 제품도 종종 구조 정보의 부가 층을 제공하는 ESI-MS 동안 생성된다. 탠덤 질량 분석 (MS / MS)의 지질 구조의 해명을위한 필수 불가결하고 다양한 방법으로 입증되었습니다. MS / MS 동안, 이온은 이온 전구체의 구조를 설명하기 위하여 사용될 수있는 진단 조각화 패턴을 수득하기 위해 활성화된다. 가장 널리 AVAilable MS / MS 방법은 CID입니다. 이 방법은 해리 리드 에너지 증착의 결과로, 불활성 가스를 타겟으로 선택된 전구체 이온의 충돌을 통해 단편 이온을 생성한다. CID는 세균 종 22-33 광범위한 지질 구조체의 할당에서 중요한 도구를 입증했다. CID가 가장 보편적으로 구현 MS / MS 방법이지만, 그것은 제품 이온의 한정된 어레이를 생성한다. 193 nm의 UVPD 대안 및 보완 MS / MS 방법입니다. 이 방법은 이온을 조사하는 레이저를 사용하고, 광자의 흡수 이온 및 후속 해리 통전 초래한다. 이 높은 에너지 MS / MS 기술은 CID보다 제품 이온의보다 다양한 배열을 생산하고, 따라서 더 많은 정보를 조각 패턴을 제공합니다. 특히, UVPD는 글리코 시드, 아민, 아와 CC 연계 채권 18,21,34에서 분열에 따라 지질 종의 미묘한 변화에 대한 정보를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>클로로포름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C607</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>테플론 FEP 원심분리기 병</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔 60 TLC 플레이트</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>등급 번호 3MM 크로마토그래피 종이</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질량분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoTip Nanospray ESI 이미터</td><td>새로운 Obectives</td><td></td><td>&#8805; 30 &mu; 막힘을 줄이기 위한 m</td></tr><tr><td>모델 505 펄스/지연 발생기</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트 Thermoylne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125mm GPI 15-415 나사산 일회용 붕규산 배양 튜브</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>재사용 가능한 나사산 PTFE 나사 캡 GPI 45-415</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>개인용 분자 이미저 시스템(인광)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography Cassette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorscreen SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide Mass Standards Kit</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier S250-A</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 12x32 mm 테이퍼 베이스 나사산 바이알</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

지질 다당류 (LPS)는 외막 이중층의 외부 전단지에 증착 그람 음성 박테리아의 주요 세포 표면 분자이다. LPS는 세 개의 도메인으로 분할 될 수있다 : 원심 O-다당류, 코어 올리고당 및 지질 지질로 이루어진 도메인 분자 종 및 3 - 데 옥시-D-Manno의-옥트 -2 - ulosonic 잔기 (KDO). 지질 도메인은 세균 세포의 생존에 필수적인 유일한 구성 요소입니다. 그 합성에 이어 지질 화학적 항생제 화합물에 대한 내성을 증진하기 위해, 그리고 호스트 선천성 면역 반응의 매개체하여 인식을 회피하기 위해, 그러한의 pH 나 온도 등의 환경 스트레스에 대응하여 수정된다. 다음 프로토콜은 그람 음성 세균으로부터의 지질의 소규모 및 대규모 분리 세부. 절연 물질은 화학적 후 박층 크로마토 그래피 (T​​LC) 또는 질량 분광법 (MS)에 의해 특징된다. 또한에 F의 레이저 탈착 / 이온화 타임 매트릭스 지원빛 (MALDI-TOF) MS는, 우리는 또한 충돌 유발 분해 (CID)에 연결된 전자 분무 이온화 (ESI) 및 새로 채용 자외선 광분해 (UVPD) 방법을 사용하여 지질에게 분자 종을 분석 탠덤 MS의 프로토콜을 설명합니다. 우리의 MS 프로토콜은 고유 또는 새로운 화학 수정을 포함하는 지질 분자의 특성에 가장 중요한, 화학 구조의 명백한 결정을 위해 수 있습니다. 우리는 또한 TLC로 분석 박테리아 세포에서 지질의 방사성 동위 원소 표지, 이후 격리를 설명합니다. MS-기반 프로토콜에 상대적 TLC는보다 경제적이고 신속한 특성화 방법을 제공하지만, 명백하게 알려진 화학 구조의 표준을 사용하지 않고 화학 구조 지질을 할당 할 수 없다. 지난 20 년간 지질의 분리 및 특성은 그람 음성 세균, 항생제 RESIS의 메커니즘의 생리에 대한 우리의 이해를 향상하는 많은 흥미로운 발견되었다tance, 인간의 타고난 면역 반응 및 항균 화합물의 개발에 많은 새로운 목표를 제공하고 있습니다.

E.의 정식 지질 4 &#39;- 위치 - 대장균 및 살모넬라 엔테의 혈청 형 티피 뮤 리움은 헥사 실화 1에 인산염 그룹과 글루코사민의 이당류이다. 리치 미디어 (예 : 루리아 국물)의 성장하는 동안 지질의 부분은 트리스 - 인산화 종 36 (그림 1)를 산출 한 위치에서 피로 인산 그룹이 포함되어 있습니다. KDO (3 - 데 옥시-D-Manno의 - octulosonic 산은)에 부착 된 6&#39;-히드 록시와 LPS의 나머지 탄수화물 도메인 (예 : 코어 올리고당 및 O-항원 도메인)에 지질을 연결하는 다리 역할을한다. 그람 음성균은 지질에 대해 보존 된 경로를 공유하지만 E. 유사한 생합성 콜라이 K-12 지질의 구조 다양성 다량있다. 이러한 다양성은 환경 적 자극에 응답하여 활성화되는 지질 구조를 수정할 잠재 효소의 작용으...

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

다음 실험의 전체적인 목표는 그람 음성균의 외막 표면에서 리포폴리사카라이드를 분리하고, 탠덤 MS 프로토콜을 사용하여 리피드 A 부분의 구조적 특성을 분석하는 것입니다. 이는 박테리아 세포 표면에서 리포폴리사카라이드를 화학적으로 추출한 후, 리포폴리사카라이드의 다당류 부분으로부터 리피드 A를 유리시키기 위해 완만한 산 가수분해를 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 리피드 A 용액을 전기분무 이온화 MSMS로 분석합니다.본 절차에서는 구조적 특성 분석을 위해 충돌 유도 해리 또는 자외선 광해리 기반의 MS/MS를 이용하여 lipid A를 분석합니다. 분석 결과, 충돌 유도 해리와 자외선 광해리 기반 MS/MS 프로토콜에서 생성된 질량 분석 스펙트럼의 단편화 패턴에 차이가 나타났으며, UVPD가 더 유용한 정보를 제공하는 단편화 패턴을 생성하는 것으로 확인되었습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 탠덤 질량 분석법을 통해 진단적 단편화 패턴의 해석을 기반으로 표적 분석물을 규명할 수 있다는 점입니다.자외선 광분해(Ultraviolet photodissociation, UVPD)는 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)와 같은 기존 기술보다 더 다양한 조각 이온을 생성하는 고에너지 MSMS 방법입니다. 사용된 UVPD 질량 분석법이 아직 상용화되지 않았기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 또한, 이 방법은 본 절차를 시작하기 전 맞춤형 개조를 통해 질량 분석기에 통합된 레이저를 사용합니다.250 mL의 박테리아 배양액에서 세포를 수확하여 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그 후 배지 상층액을 따라내고, 1× PBS 50 mL로 세포 펠렛을 세척합니다. 다시 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만든 후 상층액을 따라냅니다.다음으로 세포를 40 mL의 1X PBS로 재현탁한 후, 250 mL 테플론 원심분리관 2개에 나누어 담습니다. 각 튜브에 클로로포름 25 mL와 메탄올 50 mL를 첨가하여 단상(single phase)의 혼합물을 만듭니다. 도립 혼합하여 실온에서 최소 20분 동안 배양합니다.완전한 세포 용해를 위해 혼합물을 상온에서 2000 ×g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. LPS 펠렛을 약 100 µL의 단일 상 Bly dire 혼합물로 세척합니다. 2000 ×g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.LPS 펠릿에 약산 가수분해 완충액 27 µL를 첨가하고, 작은 입자만 남을 때까지 피펫팅으로 혼합합니다. 프로브 팁 초음파 분쇄기로 처리하여 균일하게 재현탁합니다. 50% 출력의 일정한 듀티 사이클로 20초 동안 LPS 펠릿을 용액에 현탁시킵니다. 샘플의 초음파 분쇄 과정을 1회 분사당 20초, 분사 간 간격 약 5초로 하여 총 2회 반복합니다.그다음 샘플을 항온수조에서 30분 동안 끓입니다. 튜브를 항온수조에서 꺼내 샘플이 실온까지 식도록 둡니다. 가수분해 후 lipid A를 추출하기 전에, 30 mL의 클로로포름과 30 mL의 메탄올을 추가하여 SDS 용액을 2상 BLY 직접 혼합물로 전환합니다. 이는 클로로포름 메탄올 및 약산 가수분해 버퍼 혼합물을 도치 혼합한 후 원심분리하여 수행합니다.S 샘플을 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 유리 피펫을 사용하여 하층을 깨끗한 테플론 원심분리 튜브로 추출합니다. 이어서, 미리 평형을 맞춘 2상 bly dire 혼합물의 하층 30 mL를 샘플 튜브의 상층에 추가하고, 전도 혼합 후 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 2차 추출을 수행합니다. 유리 피펫으로 하층을 추출하여 이전에 추출한 하층과 합칩니다.미리 평형화된 BlyDire 상층액 114 ml를 첨가하여 통합된 하층액을 세척하여 2상 BlyDire 혼합물을 만들고, 이를 반전 혼합한 후 원심분리합니다. 유리 전송 피펫을 사용하여 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 하층액을 깨끗한 유리 회전 증발기 플라스크로 옮기고 회전 증발을 이용하여 시료를 건조합니다.다음으로, 로터리 플라스크에 클로로포름-메탄올 혼합물 5 mL를 넣고 최소 30초 동안 배스 소니케이션(bath sonicate)을 수행합니다. 이는 플라스크 벽면에 붙은 lipid A의 현탁을 돕기 위함입니다. 유리 전송 피펫을 사용하여 지질을 PTFE 라이닝 처리된 페놀릭 스크류 캡이 달린 깨끗한 유리 튜브로 옮깁니다.질소 건조기를 사용하여 질소 기류 하에서 샘플을 건조합니다. 건조된 지질을 1 mL의 클로로포름-메탄올 혼합액에 재현탁합니다. 용매를 첨가한 후, 혼합물을 볼텍싱하여 완전히 재현탁되었는지 확인합니다.작은 유리 샘플 바이알로 옮긴 후 질소 건조기를 사용하여 건조합니다. 건조된 샘플은 이후 TLC 또는 MS 분석 전까지 -20 °C에서 보관하십시오. 샘플은 이후 분석 시까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.시료 준비가 완료되면, 빈 소형 유리 시료 바이알에 HPLC 등급 메탄올 200 µL와 HPLC 등급 클로로포름 200 µL를 혼합합니다. 클로로포름-메탄올 용매 혼합물 200 µL를 lipid A가 들어 있는 바이알로 옮긴 후, 모든 물질이 용해될 때까지 5분 동안 바이알의 내용물을 초음파 처리합니다. 그런 다음, 질량 분석기를 음이온 모드 전기분무 이온화(electrospray ionization) 방식으로 설정합니다. 250 µL 시린지에 lipid A 용액을 채웁니다.주사기를 주사기 펌프에 장착하고 희석된 지질을 직접 주입합니다. 유량은 분당 2.0에서 3.5 µL로 설정합니다. 이온 광학계를 조정하여 지질 이온 신호를 최적화하고 강화합니다.지질의 질량 스펙트럼을 수집합니다. 종을 분리하고 MSM 방법으로 CID를 선택하여 표적 지질 A를 활성화합니다. 다음으로, 전구체 지질이 분해될 때까지 CID 전압 또는 정규화된 충돌 에너지를 높입니다.한 종의 상대적 풍부도가 가장 높은 생성 이온과 비교하여 약 10%가 될 때까지 스펙트럼을 수집하고, 충분한 신호 대 잡음비가 확보될 때까지 이를 평균화합니다. 생성 이온의 경우, 이전 섹션에서 설명한 대로 시료와 질량 분석기를 준비하십시오. 질량 분석기에 연결된 레이저를 켭니다.MS 세부 설정은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이온이 HCD 셀에 진입할 때 엑시머 레이저가 트리거되도록 기기 소프트웨어를 설정한 후, 레이저가 2ms마다 펄스 형태로 조사되도록 펄스 제너레이터를 켭니다. MS/MS 방법으로 HCD를 선택하여 지질 전구체 이온을 분리하고, 충돌 에너지를 1% 정규화 충돌 에너지(normalized collision energy)로 조정합니다. 레이저 에너지를 높이고 레이저 펄스 횟수(통상 10회의 6mJ 펄스)를 조정하여 분리된 지질 이온을 활성화합니다. 마지막으로 신호 대 잡음비가 충분해질 때까지 스펙트럼을 획득하고 평균화합니다.UVPD 생성 이온의 경우, E Coli K 12 균주 W 3 110 유래 lipid A의 음이온 MALDI TOF 질량 분석 스펙트럼에서는 질량 대 전하비 1796.2의 단일 탈양성자화 종이 주요 관찰 종으로 나타납니다. MALDI TOF 분석의 상세 내용은 텍스트 프로토콜에서 설명합니다.또는 동일한 지질 시료를 음이온 모드 ESI로 분석하면 주 전하비 898.1에서 주로 이중 탈양성자화된 지질 이온이 생성됩니다. 주 전하비 1796.20에서 단일 탈양성자화된 지질 이온이 관찰되지만, 이중 탈양성자화 종에 비해 상대적 함량이 낮습니다. 단일 탈양성자화된 지질 이온에 대해 CID 또는 193 nanometers UVPD를 이용한 단편화를 수행하였습니다. 이러한 기술들은 특히 지질의 화학 구조를 더 정확하게 규명하는 데 활용될 수 있습니다.복잡한 조합의 수식 또는 이전에 규명되지 않은 화학적 수식을 포함하는 종입니다. 파편화 프로필은 절단 부위를 나타내는 점선으로 표시되며, 제공된 각 구조 아래의 마스터 전하비(master charge ratio) 값과 일치합니다. 빨간색 글꼴로 강조된 마스터 전하비 값과 절단 부위는 UVPD 32 P 표지 지질과 관련된 고유한 생성 이온을 나타냅니다.두 가지 서로 다른 e coli K 12 균주에서 분리한 Lipid A를 TLC로 분석하였습니다. 이 과정에 대한 프로토콜은 텍스트 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다. K 12 균주 W 3 110은 주로 BIS 및 tris-인산화된 lipid A를 함유하고 있으며, 32p lipid의 경우 더 복잡한 TLC 패턴이 관찰됩니다.E. coli 균주 WD 1 0 1로부터 분리된 A. WD 1 0 1은 지질을 생성합니다. 이는 ribino 및 phosphoethanolamine으로 심하게 수정되었습니다.1번 및 4'번 인산기 모두 수식 가능하므로, WD 1 0 1 유래의 lipid A는 인산기 중 하나에만 el amino arabinose 또는 phosphoethanolamine이 결합된 단일 수식 형태이거나, 두 인산기 모두 조합 방식으로 수식된 이중 수식 형태로 설명될 수 있습니다. 1번 및 4'번 인산기의 수식 외에도 Palmitate 첨가가 관찰되며, 이는 해당 용매 시스템에서 lipid A 종의 RF 값을 증가시킵니다. 본 프로토콜은 미생물학 분야의 연구자들이 lipid A 수식이 그람 음성균의 생물학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 구조-기능 관계를 더욱 심도 있게 탐구할 수 있는 독보적인 기반을 마련하였습니다.저희는 또한 UVPD 기반 MS를 사용하여 당쇄, 단백질, 핵산 및 기타 복잡한 지질과 같이 생물학적으로 중요한 분자의 구조를 규명하는 성능을 입증했으며 이에 매우 많은 관심을 가지고 있습니다. 유기 용매, 생물학적 위험 물질 및 레이저를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 용매는 반드시 환기 시설이 갖춰진 화학 흄 후드 내에서 취급해야 한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.장갑 및 고글과 같은 적절한 보호구를 항상 착용해야 하며, UVPD에 사용되는 레이저는 적절하게 차폐되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 그람 음성 세균의 lipopolysaccharide을 (LPS) 정화를위한 수정된 뜨거운 수성 - 페놀 추출 방법을 설명합니다. 일단 압축을 푼, LPS는 연속적으로 SDS-PAGE에 의해 분석 및 직접 염색법이나 서양 immunoblot에 의해 시각하실 수 있습니다.

핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

이 동영상은 박막 크로마토그래피를 기반으로 한 마이콜산의 분리를 보여줍니다. 이 기술은 극성에 따라 다양한 마이콜산(마이코박테리아의 세포벽에 존재하는 장쇄 지질)을 분리합니다.

Mycolic Acid Variants의 박막 크로마토그래피 기반 분리: 극성에 따라 Mycobacterial 세포벽 지질을 분리하는 방법

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

이 방법은 복잡한 숙주 공급원에서 세균막, 특히 황색포도상구균에외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이를 달성하기 위해, 닭 계란 노른자및 질량 분석법을 활용하는 세균성 인지질의 후속 지방산 프로파일링에서 지단백질 입자의 농축을위한 프로토콜이 설명된다.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.

아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

프로토콜은 광범위한 진균의 세포벽의 총 지질 함량을 추출하기 위해 제시된다. 더욱이, 진동산의 상이한 모형의 추출 및 분석 프로토콜이 도시된다. 이러한 진균 화합물을 모니터링하는 얇은 층 크로마토그래피 프로토콜도 제공됩니다.

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

급진적 기반 biomimetic 화학은 biomarker 개발에 필요한 건물 업 라이브러리에 적용되었습니다.

화학 생물학에서의 자유 부수 : 화학 행동의 Biomarker 개발에

DNA 종이접기는 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정밀한 나노 크기의 물체를 제작하는 강력한 방법입니다. 여기에서는 DNA 종이접기에서 생체 반응성 로봇을 접는 프로토콜, 투과 전자 현미경 이미징(TEM)을 위한 정제 및 음성 염색에 대해 설명합니다.

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

배우세요 그람 음성 박테리아에서 지질 A를 분리하고 탠덤 질량 분석법으로 구조를 특성화하는 방법을. 이 기술은 항생제 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

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