그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

다음 실험의 전체적인 목표는 그람 음성균의 외막 표면에서 리포폴리사카라이드를 분리하고, 탠덤 MS 프로토콜을 사용하여 리피드 A 부분의 구조적 특성을 분석하는 것입니다. 이는 박테리아 세포 표면에서 리포폴리사카라이드를 화학적으로 추출한 후, 리포폴리사카라이드의 다당류 부분으로부터 리피드 A를 유리시키기 위해 완만한 산 가수분해를 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 리피드 A 용액을 전기분무 이온화 MSMS로 분석합니다.

본 절차에서는 구조적 특성 분석을 위해 충돌 유도 해리 또는 자외선 광해리 기반의 MS/MS를 이용하여 lipid A를 분석합니다. 분석 결과, 충돌 유도 해리와 자외선 광해리 기반 MS/MS 프로토콜에서 생성된 질량 분석 스펙트럼의 단편화 패턴에 차이가 나타났으며, UVPD가 더 유용한 정보를 제공하는 단편화 패턴을 생성하는 것으로 확인되었습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 탠덤 질량 분석법을 통해 진단적 단편화 패턴의 해석을 기반으로 표적 분석물을 규명할 수 있다는 점입니다.

자외선 광분해(Ultraviolet photodissociation, UVPD)는 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)와 같은 기존 기술보다 더 다양한 조각 이온을 생성하는 고에너지 MSMS 방법입니다. 사용된 UVPD 질량 분석법이 아직 상용화되지 않았기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 또한, 이 방법은 본 절차를 시작하기 전 맞춤형 개조를 통해 질량 분석기에 통합된 레이저를 사용합니다.

250 mL의 박테리아 배양액에서 세포를 수확하여 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그 후 배지 상층액을 따라내고, 1× PBS 50 mL로 세포 펠렛을 세척합니다. 다시 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만든 후 상층액을 따라냅니다.

다음으로 세포를 40 mL의 1X PBS로 재현탁한 후, 250 mL 테플론 원심분리관 2개에 나누어 담습니다. 각 튜브에 클로로포름 25 mL와 메탄올 50 mL를 첨가하여 단상(single phase)의 혼합물을 만듭니다. 도립 혼합하여 실온에서 최소 20분 동안 배양합니다.

완전한 세포 용해를 위해 혼합물을 상온에서 2000 ×g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. LPS 펠렛을 약 100 µL의 단일 상 Bly dire 혼합물로 세척합니다. 2000 ×g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

LPS 펠릿에 약산 가수분해 완충액 27 µL를 첨가하고, 작은 입자만 남을 때까지 피펫팅으로 혼합합니다. 프로브 팁 초음파 분쇄기로 처리하여 균일하게 재현탁합니다. 50% 출력의 일정한 듀티 사이클로 20초 동안 LPS 펠릿을 용액에 현탁시킵니다. 샘플의 초음파 분쇄 과정을 1회 분사당 20초, 분사 간 간격 약 5초로 하여 총 2회 반복합니다.

그다음 샘플을 항온수조에서 30분 동안 끓입니다. 튜브를 항온수조에서 꺼내 샘플이 실온까지 식도록 둡니다. 가수분해 후 lipid A를 추출하기 전에, 30 mL의 클로로포름과 30 mL의 메탄올을 추가하여 SDS 용액을 2상 BLY 직접 혼합물로 전환합니다. 이는 클로로포름 메탄올 및 약산 가수분해 버퍼 혼합물을 도치 혼합한 후 원심분리하여 수행합니다.

S 샘플을 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 유리 피펫을 사용하여 하층을 깨끗한 테플론 원심분리 튜브로 추출합니다. 이어서, 미리 평형을 맞춘 2상 bly dire 혼합물의 하층 30 mL를 샘플 튜브의 상층에 추가하고, 전도 혼합 후 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 2차 추출을 수행합니다. 유리 피펫으로 하층을 추출하여 이전에 추출한 하층과 합칩니다.

미리 평형화된 BlyDire 상층액 114 ml를 첨가하여 통합된 하층액을 세척하여 2상 BlyDire 혼합물을 만들고, 이를 반전 혼합한 후 원심분리합니다. 유리 전송 피펫을 사용하여 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 하층액을 깨끗한 유리 회전 증발기 플라스크로 옮기고 회전 증발을 이용하여 시료를 건조합니다.

다음으로, 로터리 플라스크에 클로로포름-메탄올 혼합물 5 mL를 넣고 최소 30초 동안 배스 소니케이션(bath sonicate)을 수행합니다. 이는 플라스크 벽면에 붙은 lipid A의 현탁을 돕기 위함입니다. 유리 전송 피펫을 사용하여 지질을 PTFE 라이닝 처리된 페놀릭 스크류 캡이 달린 깨끗한 유리 튜브로 옮깁니다.

질소 건조기를 사용하여 질소 기류 하에서 샘플을 건조합니다. 건조된 지질을 1 mL의 클로로포름-메탄올 혼합액에 재현탁합니다. 용매를 첨가한 후, 혼합물을 볼텍싱하여 완전히 재현탁되었는지 확인합니다.

작은 유리 샘플 바이알로 옮긴 후 질소 건조기를 사용하여 건조합니다. 건조된 샘플은 이후 TLC 또는 MS 분석 전까지 -20 °C에서 보관하십시오. 샘플은 이후 분석 시까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

시료 준비가 완료되면, 빈 소형 유리 시료 바이알에 HPLC 등급 메탄올 200 µL와 HPLC 등급 클로로포름 200 µL를 혼합합니다. 클로로포름-메탄올 용매 혼합물 200 µL를 lipid A가 들어 있는 바이알로 옮긴 후, 모든 물질이 용해될 때까지 5분 동안 바이알의 내용물을 초음파 처리합니다. 그런 다음, 질량 분석기를 음이온 모드 전기분무 이온화(electrospray ionization) 방식으로 설정합니다. 250 µL 시린지에 lipid A 용액을 채웁니다.

주사기를 주사기 펌프에 장착하고 희석된 지질을 직접 주입합니다. 유량은 분당 2.0에서 3.5 µL로 설정합니다. 이온 광학계를 조정하여 지질 이온 신호를 최적화하고 강화합니다.

지질의 질량 스펙트럼을 수집합니다. 종을 분리하고 MSM 방법으로 CID를 선택하여 표적 지질 A를 활성화합니다. 다음으로, 전구체 지질이 분해될 때까지 CID 전압 또는 정규화된 충돌 에너지를 높입니다.

한 종의 상대적 풍부도가 가장 높은 생성 이온과 비교하여 약 10%가 될 때까지 스펙트럼을 수집하고, 충분한 신호 대 잡음비가 확보될 때까지 이를 평균화합니다. 생성 이온의 경우, 이전 섹션에서 설명한 대로 시료와 질량 분석기를 준비하십시오. 질량 분석기에 연결된 레이저를 켭니다.

MS 세부 설정은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이온이 HCD 셀에 진입할 때 엑시머 레이저가 트리거되도록 기기 소프트웨어를 설정한 후, 레이저가 2ms마다 펄스 형태로 조사되도록 펄스 제너레이터를 켭니다. MS/MS 방법으로 HCD를 선택하여 지질 전구체 이온을 분리하고, 충돌 에너지를 1% 정규화 충돌 에너지(normalized collision energy)로 조정합니다. 레이저 에너지를 높이고 레이저 펄스 횟수(통상 10회의 6mJ 펄스)를 조정하여 분리된 지질 이온을 활성화합니다. 마지막으로 신호 대 잡음비가 충분해질 때까지 스펙트럼을 획득하고 평균화합니다.

UVPD 생성 이온의 경우, E Coli K 12 균주 W 3 110 유래 lipid A의 음이온 MALDI TOF 질량 분석 스펙트럼에서는 질량 대 전하비 1796.2의 단일 탈양성자화 종이 주요 관찰 종으로 나타납니다. MALDI TOF 분석의 상세 내용은 텍스트 프로토콜에서 설명합니다.

또는 동일한 지질 시료를 음이온 모드 ESI로 분석하면 주 전하비 898.1에서 주로 이중 탈양성자화된 지질 이온이 생성됩니다. 주 전하비 1796.20에서 단일 탈양성자화된 지질 이온이 관찰되지만, 이중 탈양성자화 종에 비해 상대적 함량이 낮습니다. 단일 탈양성자화된 지질 이온에 대해 CID 또는 193 nanometers UVPD를 이용한 단편화를 수행하였습니다. 이러한 기술들은 특히 지질의 화학 구조를 더 정확하게 규명하는 데 활용될 수 있습니다.

복잡한 조합의 수식 또는 이전에 규명되지 않은 화학적 수식을 포함하는 종입니다. 파편화 프로필은 절단 부위를 나타내는 점선으로 표시되며, 제공된 각 구조 아래의 마스터 전하비(master charge ratio) 값과 일치합니다. 빨간색 글꼴로 강조된 마스터 전하비 값과 절단 부위는 UVPD 32 P 표지 지질과 관련된 고유한 생성 이온을 나타냅니다.

두 가지 서로 다른 e coli K 12 균주에서 분리한 Lipid A를 TLC로 분석하였습니다. 이 과정에 대한 프로토콜은 텍스트 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다. K 12 균주 W 3 110은 주로 BIS 및 tris-인산화된 lipid A를 함유하고 있으며, 32p lipid의 경우 더 복잡한 TLC 패턴이 관찰됩니다.

E. coli 균주 WD 1 0 1로부터 분리된 A. WD 1 0 1은 지질을 생성합니다. 이는 ribino 및 phosphoethanolamine으로 심하게 수정되었습니다.

1번 및 4'번 인산기 모두 수식 가능하므로, WD 1 0 1 유래의 lipid A는 인산기 중 하나에만 el amino arabinose 또는 phosphoethanolamine이 결합된 단일 수식 형태이거나, 두 인산기 모두 조합 방식으로 수식된 이중 수식 형태로 설명될 수 있습니다. 1번 및 4'번 인산기의 수식 외에도 Palmitate 첨가가 관찰되며, 이는 해당 용매 시스템에서 lipid A 종의 RF 값을 증가시킵니다. 본 프로토콜은 미생물학 분야의 연구자들이 lipid A 수식이 그람 음성균의 생물학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 구조-기능 관계를 더욱 심도 있게 탐구할 수 있는 독보적인 기반을 마련하였습니다.

저희는 또한 UVPD 기반 MS를 사용하여 당쇄, 단백질, 핵산 및 기타 복잡한 지질과 같이 생물학적으로 중요한 분자의 구조를 규명하는 성능을 입증했으며 이에 매우 많은 관심을 가지고 있습니다. 유기 용매, 생물학적 위험 물질 및 레이저를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 용매는 반드시 환기 시설이 갖춰진 화학 흄 후드 내에서 취급해야 한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.

장갑 및 고글과 같은 적절한 보호구를 항상 착용해야 하며, UVPD에 사용되는 레이저는 적절하게 차폐되어야 합니다.