의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 초파리에서 양성 및 침습성 종양을 유도한 다음 유충 두부 복합체를 해부하여 시각화하는 것입니다. 이것은 원하는 균주 사이를 가로질러 설정하고 침습성 또는 양성 종양을 지닌 유충 자손을 분리하는 것으로 시작됩니다. 다음 단계는 선택한 유충을 해부하는 것입니다.

먼저 두부 복합체를 노출시키기 위해 2/3를 잘라 고정한 다음 뒤집어 놓습니다. 다음으로 지방체와 장 조직을 청소한 다음 복부 신경삭과 유충 표피에 아직 붙어 있는 모든 신경도 절단합니다. 마지막 단계는 두부 복합체를 이미지화하거나 다운스트림 응용 분야를 위해 고정하는 것입니다.

궁극적으로, 결과는 형광 현미경 검사법을 사용하여 GFP 태그가 지정된 침습성 또는 양성 종양을 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 암 생물학의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 어떤 유전자가 온전한 유기체에서 종양의 진행을 억제할 수 있는지 이해하고 싶을 수 있습니다.

필요한 유전자 스톡을 얻었으면 테스터 균주의 스타터 배양을 준비합니다. 또한 테스트된 재고에 대한 스타터 배양을 준비합니다. 테스터 스톡에서 10 명의 암컷 처녀를 테스트 스톡에서 10 명의 수컷과 교차시킵니다.

파리가 섭씨 25도에서 24-48시간 동안 짝짓기를 하고 알을 낳도록 한 다음 더 많은 자손을 생산하기 위해 새 유리병으로 옮깁니다. 십자가 바이알에 알과 첫 번째 instar 유충이 있는지 모니터링합니다. 새 십자가를 설정합니다.

수집된 바이알에서 난자 침착이 불량한 것으로 나타나는 경우. 수집된 바이알이 마르기 시작하면 배양물을 촉촉하게 유지하기 위해 오토클레이브 증류수 3-4방울만 추가하면 됩니다. 돌아다닐 때까지 바이알을 계속 모니터링하십시오.

세 번째 instar 유충이 있습니다. 그런 다음 형광 실체 현미경으로 모니터링을 진행합니다. 동일한 절차를 사용하여 배양 5일 또는 6일째까지 나열된 주식을 사용하여 침습성 종양을 보유한 파리를 수집하고, 양성 종양 배양에서 방황하는 세 번째 instar 유충을 사용할 수 있습니다.

그러나 침습성 종양 배양으로부터 10일째까지는 사용할 수 없습니다. 세 번째 instar 유충을 모으려면 고운 붓에 증류수를 적셔 유리병 벽에서 긁어냅니다. 유충을 차가운 XPBS가 있는 함몰 슬라이드에 넣은 다음 젖은 페인트 브러시를 사용합니다.

표피에서 음식 재료를 긁어냅니다. 몇 분 동안 움직이지 않으면 유충을 섭씨 영하 20도의 접시에 30분 동안 놓습니다. 더 긴 고정 시간을 위해 유충을 지팡이에 낮잠만 들고 배양 약병에 넣습니다.

배양 바이알을 막고 40분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 움직이지 않는 유충을 유리 슬라이드로 옮깁니다. 가벼운 후광 탄수화물 오일 한 방울을 넣고 커버 유리로 유충을 덮습니다.

이제 형광 실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오. GFP 발현의 경우 녹색 형광 유충을 선택하고 해부를 진행합니다. 양성 종양을 가진 유충은 두부 복합체가 있는 전방 부위에서 녹색으로 형광을 발합니다.

침습성 종양은 또한 두부 복합체에서 유충의 앞쪽 영역에서 녹색으로 형광을 발합니다. 가능하다면 형광이 발하는 종양을 사진으로 기록해야 합니다. 따라서 유충의 반투명한 표피는 종양의 이동 정도를 관찰하기 어렵게 만들기 때문에 종양을 해부해야 합니다.

집게를 사용하여 종양이 있는 새로운 유충을 옮기는 것으로 시작합니다. 1 밀리리터의 차가운 XPBS가 들어있는 해부 접시의 우물에 입력하십시오. 앞쪽 끝에서 약 2/3 거리에서 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 아래로 잡습니다.

다른 집게를 사용하여 유충의 뒤쪽 3분의 1을 현명하게 분리하여 버립니다. 그런 다음 앞쪽의 2/3를 놓아주었습니다. 유충 내부의 압력이 해제되면 그 내용물이 체강 밖으로 흘러나옵니다.

겸자를 사용하여 체강 밖으로 흘러나온 조직을 제거합니다. 다음으로 유충의 입 고리를 잡고 유충 표피에 밀어 넣습니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 완전히 뒤집습니다.

이제 집게를 사용하여 부드럽고 조심스럽게 지방체, 타액선, 내장, 날개 디스크 복합체 및 기관 튜브를 제거합니다. 이제 입 고리에 부착된 두부 복합체를 볼 수 있습니다. 뇌 반구와 VNC는 여전히 VNC에서 나오는 신경을 통해 유충 표피에 연결되어 있습니다.

집게를 사용하여 이러한 연결을 부드럽게 끊습니다. 그런 다음 과도한 지방이나 신체 또는 기타 조직을 제거하여 두부 복합체가 명확하게 보이도록 합니다. 입 고리의 유충 표피에 부착되어 있습니다.

시각화 전에 추가 처리를 위해 두부 복합체를 그대로 둡니다. 그렇지 않으면 두부 복합체를 직접 시각화하려면 표피에서 분리하고 벡터 실드와 같은 글리세롤 기반 장착 매체 한 방울에 놓습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 눈에 종양을 유도했습니다.

Anin disc, 양성 종양은 그들이 유도되는 눈 anin disc에 국한되어 있었다. GFP에 의하여 표지된 조직은 하루 10 종양 조직의 유충 과다 증식이 관찰된 침습성 종양을 품고 있는 두부 복합체에 있는 복부 신경삭스와 같은 인접한 기관으로 이동하지 않았다는 것을 주목하십시오. 또한 빨간 화살표가 지적한 것처럼 종양은 VNC 및 입 고리와 같은 인접 기관을 침범했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 양성 및 침습성 종양을 유전적으로 유도하는 방법을 잘 이해한 다음 위장 내 두부 복합체를 해부하여 시각화해야 합니다.