설립 체외 시스템의 세포 내 행동을 연구하는 칸디다 글라 브라 인간 THP-1 식세포에

이 절차의 전반적인 목표는 인간 기회 진균 병원체의 세포 내 거동을 연구하기 위한 체외 배양 모델 시스템을 구축하는 것입니다. Canida lab ratta 인간 monocytic cell line TP one에서 유래 한 대식 세포. 이 THP를 달성하기 위하여 1개의 monocytes는 첫째로 4개의 에스테르로 대우되어 그(것)들을 대식 세포로 분화하기 위하여 대우된다.

다음으로, THP 1 대식세포는 감염 2시간 후에 canida GTA 세포에 감염됩니다. 비식세포작용(non phagocytose canida) GTA 세포는 PBS 세척기에 의해 제거되고 세포 내 e 세포는 감염된 대식세포의 osmos에 의한 추가 연구를 위해 회수됩니다. 이 프로토콜은 대식세포에서 바이러스에서 canida GTA 세포에 대한 바이러스뿐만 아니라 candida GTA 감염 시 거대 FIDS에서 THP의 faiz maturation Ross 및 cytokine 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

또한, 이 프로토콜은 반 고처리량 방식으로 TSP one 대식세포에서 변경된 생존 프로파일에 대해 칸디다 협력자 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하도록 확장할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 상대적으로 저렴하고 재현성이 높으며 다양한 면역 세포와 곰팡이 병원체에 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다. 감염 이틀 전에 절차를 시작하려면 첫날에 THP와 단핵구 세포를 80%CO로 만들고 배양 위험을 제거하고 천천히 부드럽게 모든 미묘한 세포를 현탁액으로 가져옵니다.

DHP one monocyte cell suspension을 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심 분리기 : 실온에서 4 분 동안 1000 RPM에서 배지를 폐기물 용기에 넣고 5ml의 프리 API 배지를 튜브에 넣고 다시 사용합니다. 배지를 3 4 회 부드럽게 피펫팅하여 THV one cell pellet을 현탁시킵니다.

10 Microlit의 세포 현탁액을 취하여 혈류 분석기를 사용하여 세포 밀도를 측정하고 세포 밀도를 ml당 100만 개의 세포로 조정합니다.1개의 60 micromolar PMA 스톡 용액 1 microl를 세포 현탁액에 추가하여 최종 농도가 16 ano molar가 되도록 하고 잘 혼합합니다. 100만 개의 세포에 해당하는 1ml 세포 현탁액을 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고 섭씨 37도 및 5%CO2로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다.

12시간 배양 후 오래된 배지를 버리십시오. 각 웰에 1ml pre RPI 배지를 추가하고 플레이트를 12시간 더 배양합니다. 이 세포는 캐나다 음성 감염에 사용되며 나중에 보여줄 것입니다.

적절한 미생물 방법을 사용하여 ML YPD 배지가 포함된 플라스에 단일 EA 콜로니를 접종합니다. 배양 원심분리기 후 섭씨 30도로 설정된 인큐베이터에서 14-16시간 동안 플라스를 배양합니다. 4, 000RPM에서 5분 동안 ML 배양 1회.

수프 나틴을 버리고 멸균 PBS로 껍질을 세 번 씻으십시오. 세척 버퍼를 버린 후 부드러운 피펫팅으로 1ml 멸균 PBS에 셀 팔레트를 현탁시킵니다. 다음으로, 600나노미터의 분광 광도계에서 세포 현탁액의 흡광도를 측정하고 PBS를 사용하여 세포 밀도를 ml당 200만 개의 세포로 조정합니다.

세포 현탁액 50 마이크로 리터를 취하고 PBS 스프레드 플레이트에서 YPD AGA 배지에서 100 마이크로 리터 배양을 100 배 희석합니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 배양하고 하루나 이틀 후에 YPD 플레이트에 나타난 콜로니의 수를 세고, 이 숫자에 적절한 희석 계수를 곱하여 0시간 콜로니 형성 단위를 계산합니다. 캐나다 레타(Canada Reta)의 이 많은 군체 형성 단위는 대식세포의 DHE를 감염시키는 데 사용될 것입니다.

다음 단계에서는 50 macro Liter of Canada clater cell suspension을 24 whale culture plate의 macrophage mono layer에 추가합니다. 플레이트를 더럽혀 각 세포를 고르게 분포시키고 2시간 배양 후 섭씨 37도에서 배양합니다. ml 직렬 PBS에서 배양 플레이트의 각 웰에 대한 용기에 배양 플레이트를 뒤집어 배지를 폐기하고 웰 웰의 측면을 따라 조심스럽게 철저히 폐기하고 완충액을 폐기합니다.

이 단계를 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 첫 번째 웰을 제외하고 감염 후 4, 6, 12 및 24시간에 칸디다 세포의 세포 내 복제를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 다른 모든 웰에 하나의 ML RPI 배지를 추가하고, 대식세포 감염 2시간 후 세포 내 e 세포를 회복하기 위해 1ML 시리얼 물을 phos에 추가합니다. 2분 후, 1ML 파이퍼 팁으로 웰을 부드럽게 긁어내어 웰의 대식 세포 파편을 제거합니다.

우물을 헹구고 매크로 센트리 물고기 튜브에 모으십시오. PBS에서 microFIT 세포 용해물을 100배 희석하고 YPD AGA 배지에 100마이크로리터를 플레이트화합니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 하루에서 이틀 동안 배양하고 집락 형성 단위의 수를 세십시오.

이 숫자에 적절한 희석 인자를 곱하여 T 2로 식세포가 되고 2시간 감염 후 대식세포가 되는 개과세포의 수를 열거합니다. 유사하게, 세포 내 canida ator 세포의 수는 다른 시점에서 결정될 수 있습니다. 감염 후 및 세포 내 복제는 여기에 표시된 2시간에 내재화된 CFU와 비교하여 24시간 동안의 증가로 나타낼 수 있습니다.

TV 1 대식 세포에 감염된 canida 악어 세포의 총 수는 6 곱하기 10, 2 / 4 인 전형적인 실험의 다른 결과. 2시간에 회수된 세포의 수는 3.7개로, 10.4의 6배입니다. 따라서 e 세포가 24 시간 co incubation 기간 동안 62.66 %의 비율로 phagocytosed된다는 것을 보여줍니다.

세포 내 e 세포의 수가 3.76배 10.4배에서 1.96배 10.5배로 증가함에 따라 5.2배 복제 이외의 al 세포를 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는 컨포칼 현미경을 사용하는 동안 GFP를 발현하는 E 세포를 사용하여 canida TER 세포의 세포 내 복제를 평가할 수도 있습니다. 24웰 배양 플레이트에 대해 앞서 설명한 프로토콜을 사용하여 4개의 챔버 슬라이드에서 THV 및 대식세포를 준비하고 감염시킵니다.

감염 후 2시간 후. 슬라이드의 각 챔버에 500 마이크로 리터 PBS의 폐기물 용기로 슬라이드를 뒤집어 매체를 폐기합니다. 잘 헹구고 PBS는 버리십시오.

3.7% 공식 높이의 500마이크로리터에서 이 단계를 두 번 더 반복하여 세포를 고정합니다. 슬라이드를 실온에서 20분 동안 배양하고 공식적인 것을 버리십시오. 500 마이크로 리터 PBS로 각 우물 가격을 세척하여 5 분 배양 후 500 마이크로 리터 트리톤 X에서 대식 세포를 동원하고 트리톤 X를 제거하고 PBS로 우물 타격을 제거합니다.

챔버 제거 및 에어 라이더 슬라이드를 사용하여 챔버 슬라이드를 조심스럽게 분해합니다. DPI가 포함된 vector Shield 장착 매체 한 방울을 슬라이드 마운트의 각 섹터에 놓고 커버 슬립을 놓고 컨포칼 현미경 아래에서 시각화된 셀에 못 페인트로 가장자리를 밀봉합니다. 여기에 보여진 것은 GFE에 감염된 TP one 대식세포의 대표적인 컨포칼 이미지이며, 야생형 canida 실험실 세포를 발현하는 것은 세포 내 e 세포의 수가 2시간에서 24시간으로 약 6배 증가한 것은 TP one 대식세포 시그니처 태그 돌연변이 유발 접근법에서 canida 실험실 복제를 나타내는 것으로, 많은 수의 돌연변이가 고유한 올리고뉴클레오티드를 통해 성장 결함에 대해 동시에 스크리닝되는 미생물 병원체의 ulence factor를 확인하는 데 널리 사용됩니다 sequence 태그를 사용합니다.

여기에서는 캐나다 도서관 및 돌연변이 도서관의 STM 화면에 대한 프로토콜에 대해 설명하며 다음 세 단계로 구성됩니다. 처음 96 플라스미드. 고유한 올리고뉴클레오티드 염기서열 스택을 가진 각각은 나일론 멤브레인에 고정되어 있습니다.

두 번째 단계에서는 96개의 CANIDA ator 돌연변이 풀을 대상으로 THV one 대식세포의 변경된 생존 프로파일을 스크리닝한 다음, YPD, 성장 및 대식세포 내재화 돌연변이 e 세포를 회수하며, 이는 각각 입력 및 출력 샘플이라고 합니다. 마지막으로, DNA 서명 태그는 PCI 증폭 및 입력 및 출력 게놈 DNA 샘플의 무선 라벨입니다. PCR 산물은 고유한 태그와 하이브리드화되고 멤브레인의 방사성 신호가 정량화 및 분석됩니다.

96 12 도트 보드 장치를 조립하려면 촉촉한 스왑 윈드 트리 종이 위에 젖은 나일론 멤브레인을 놓고 장치의 나사를 조입니다. 멸균 물로 멤브레인을 세척 한 다음 0.4 mu 수산화 나트륨으로 세척합니다. 200 나노그램의 PLA BDNA 용액을 96 12 블록에서 0.4 몰 수산화나트륨 세척 후 점 혈액 apptus의 해당 웰로 옮깁니다.

UV 교차결합제(UV crosslinker)에서 전달된 혈장 BDNA를 멤브레인으로 교차하는 두 번의 XXSC에서 ference를 거친 후 점 혈액 장치에서 멤브레인을 제거합니다. 배양 멤브레인은 섭씨 42도에서 2 시간 동안 안테나 사전 교잡, 버퍼 및 입력 및 UNE 병에 있습니다. 입력 및 출력 세포 팔레트 및 프라이머에서 추출한 게놈 DNA를 사용하여 고유한 태그의 반전 측면 영역에 대해 PCR로 무선 레벨 프로브를 준비합니다.

섭씨 99도에서 5분 동안 무선 라벨 프로브를 변성시키고 얼음 위에 젤을 찰칵 붙입니다. 프로브를 입력 및 출력 병으로 옮기고 섭씨 42도에서 14-16시간 동안 배양합니다. 포스트 하이브리드화.

프로토콜에 설명된 대로 입력 및 출력 멤브레인을 세척합니다. 병에서 멤브레인을 꺼내 자연 건조시키고 phospho 이미지 화면에 노출시킵니다. 2-3시간 후 인 화면을 스캔하고 이미지를 획득합니다.

이 예에서는 두 개의 혼성화된 멤브레인 필터가 표시되며, 이는 96개의 canida Gatory 돌연변이 중 하나의 풀을 통해 변경된 생존을 스크리닝하는 것을 나타냅니다. thv에서 하나의 대식세포, 입력 멤브레인에 대한 출력의 각 스폿의 신호 강도 비율을 정량화하고 결정한 결과, 태그 번호 13, 26, 75 및 85가 출력에서 과소 대표되는 것으로 나타났습니다. 이 스택은 빨간색으로 둘러싸여 있으며 4개의 서로 다른 돌연변이의 성장을 반영합니다.

대조적으로, 녹색으로 강조 표시된 고유한 시퀀스 11 및 81이 있는 돌연변이 스택은 출력 샘플에서 과대 표시됩니다. 즉, 이 화면에서 96개의 돌연변이 풀에서 2개의 돌연변이가 생존을 증가시키고 4개의 돌연변이가 대식세포에서 성장할 때 표시되어야 합니다. 이러한 풀 스크리닝에서 확인된 변형된 생존 표현형은 단일 감염 분석에서 검증되어야 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 진균 병원체의 내부 성장 프로파일을 연구하기 위해 체외 구강 시스템을 제정하고 시험관 내 구강 시스템을 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 또한 지금 이 시스템을 사용하여 대규모 돌연변이 풀 스크리닝을 수행할 수 있어야 합니다.