Name: 설립 체외 시스템의 세포 내 행동을 연구하는 칸디다 글라 브라 인간 THP-1 식세포에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 배우세요 Candida glabrata의 THP-1 대식세포 내 행동을 연구하는 체외 배양 모델을 수립하는 방법을. 이 프로토콜은 진균 병원성 메커니즘과 숙주-병원체 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은, 생명 공학, 인도, DNA 지문 및 진단을위한 센터의 핵심 자금의 정부 부서의 혁신적인 젊은 Biotechnologist 상 BT/BI/12/040/2005 및 BT/PR13289/BRB/10/745/2009 보조금에 의해 지원되었다 하이 데 라 바드. MNR 및 GB는 주니어와 마니 팔 대학의 박사 학위의 추구를 향한 과학 산업 연구위원회의 선임 연구 장학금의 수혜자입니다. SB는 마니 팔 대학의 박사 학위를 추구으로 주니어 공학학과의 수석 연구 활동의받는 사람입니다.

그것은 C.를 수행하는 것이 좋습니다 글라 브라 감염 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2와 실험실 실험 (BSL-2). <ol><li> THP-1 대식 세포 단일 층의 제조. </li><li> C. 준비 글라 브라 세포 현탁액. </li><li> C.와 THP-1 대식 세포의 감염 글라 브라 셀. </li><li> 콜로니 형성 단위의 분석을 통해 식균 작용의 속도와 세포 내 복제의 측정. </li><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 복제의 모니터링. </li></ol> 1. THP-1 대식 세포 단일 층의 제조 <ol><li> THP-1은 급성 단핵구 백혈병 14 고통받는 1 살짜리 남자 아이의 말초 혈액에서 파생 된 인간의 단핵 세포 라인입니다. THP-1, 현탁 세포주, 일상적으로 10 % FBS (소 태아 혈청)으로 보충 된 RPMI-1640 배지에서 가습 된 5 % CO 2에서 37 ° C로 유지된다. 포르 12 myrista 치료TE 13 - 아세테이트 (PMA, 포르 볼 에스테르) 대 식세포로 THP-1 단핵 세포의 말단 분화 초래한다. 중요한 사실은, PMA 처리는 세포 생존에 영향을주지 않으며 분화 된 세포는 분열하지 않는다. </li><li> 종자 약 1.5 × 10의 100mm 배양 접시에있는 6 THP-1 단핵구 RPMI-1640 완전 배지 (RPMI-1640 배지 10 % 혈청, 2 MM의 글루타민과 1X 항생제로 보충, 10 ㎖ / 요리)와 세포가 37로 증가하자 2 일 동안 5 % CO 2에서 C를 °. </li><li> THP-1 세포를 13 × 105 세포 / ml의 밀도에 도달 세포 배양 층류 후드에 배양 접시를 전송하고 부드럽게 침전 세포를 재현 탁하도록 소용돌이했으면. </li><li> 세포 현탁액을 피펫, 4 분 동안 1,000 rpm으로 (130 XG)에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기에 배치합니다. 뜨는을 취소하고 5 ㎖ 신선한, 예비 가온, RPMI-1640 완전한 매체에 THP-1 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 혈구와 세포를 열거하고 CEL 희석10 6 세포 / ㎖로 데워진 RPMI-1640 완전한 매체의 최종 밀도 L 서스펜션 </li><li> (포르 볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 용액은 디메틸 설폭 사이드에서 제조) 10 ㎖ THP-1 세포 현탁액 (최종 농도 16 NM)에 160 mM의 PMA 주식 1 μl를 추가하고 잘 섞는다. 24 잘 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1 ml의 세포 현탁액을 분배하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C로 유지 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 오래된 매체를 제거, 1 ml의 RPMI-1640 완전한 매체를 데워진 추가하고 세포가 5 % CO 2에서 37 ° C에서 12 시간 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 현탁액이 타원형 모양의 THP-1 단핵구 세포가 평평 모양의 스핀들 및 식세포로 분화 졌음을 보장하기 위하여 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 분화 된 세포는 지금 C.을 수행 할 준비가 된 것입니다 글라 브라 감염 연구. </li></ol> 2. C. 준비 글라 브라 &amp; #(160), 세포 현탁액 C. 글라 브라 야생형 균주 BG2는 THP-1 대식 세포를 감염시키기 위해 사용된다. C. 글라 브라 셀 액체 YPD (효모 추출물 (1 %), 펩톤 (2 %), 덱 스트로스 (2 %)) 배지에서 일상적으로 배양 하였다. 단단한 YPD 배지는 배지 고압 증기 멸균 전에 2 %의 한천을 첨가함으로써 제조된다. <ol><li> C.의 문화를 준비하려면 글라 브라가, 멸균, 일회용 루프 한천 플레이트에서 하나의 식민지을 주워와 10 ㎖ YPD 액체 배지에 접종하고 30 ℃에서 (200 rpm)으로 진탕 14 ~ 16 시간 동안 배양 </li><li> 테이블 위에 마이크로 원심에서 5 분 4,000 RPM (1,800 XG)에서 원심 분리기이 문화 (1 ㎖), 멸균 PBS (인산염 완충 식염수, 산도 7.4)와 세 번 세포를 세척하고 1 ㎖의 PBS에 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> C.의 OD 600을 측정 글라 브라 세포 현탁액 및 2 × 106 세포 / ml의 밀도를 얻기 위해 멸균 PBS의 적절한 부피로 희석 (OD 600= 0.1). 대안 적으로, 원하는 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 효모 세포를 카운트함으로써 달성 될 수있다. </li></ol> 3. C.와 THP-1 식세포의 감염 글라 브라 셀 <ol><li> 50 μL의 C. 추가 THP-1 식세포 (10 6 세포를 24 웰 배양 플레이트의 웰 당 시드) 0.1의 MOI (감염의 다중성)를 얻어 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 부화에 글라 브라 세포 현탁액. </li><li> 가능한 효모 수를 결정하기 위해 50 μL C를 희석 글라 브라 세포 현탁액 멸균 PBS의 100 배와 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시. 30 ° C에서 접시를 품어 수동 1-2일 후 나타나는 효모 콜로니의 수를 계산합니다. 이 숫자는, 이제부터는, 0 시간의 C.로 언급 될 것이다 글라 브라 CFUs (콜로니 형성 단위). </li><li> C.와 THP-1 세포의 2 시간의 공동 배양 한 후 24 - 웰 조직 배양 플레이트를 반전시킴으로써 글라 브라 셀 폐기 배지 INA 저수지 및 nonphagocytosed 세포 C.를 제거하는 예비 가온 멸균 PBS로 가볍게 세 번 씻어 글라 브라 셀. PBS와 부드러운 세척은 THP-1 대식 세포 단일 층에 손상을 초래하지 않고 모든 세포 효모의 완전한 제거를 달성하기 위해 절대적으로 필수적이다. </li></ol> 4. 식민지가 단위 분석을 형성을 통해 식균 작용 속도 및 세포 내 복제의 측정 <ol><li> 를 Lyse C. 글라 브라 2 O 2 분 동안 잘로부터 대식 파편을 제거하고 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 용 해물을 수집 가볍게 긁어 1 ㎖ 무균 H에서 THP-1 마크로파지를 감염. 전체 대식 세포 용해 현미경 검증은 모든 내면화 효모의 복구를 위해 필수적이다. </li><li> 멸균 PBS에 용해 액의 100 배 희석액을 준비 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시 30 ° C에서 접시를 품어 </li><li> 1~2일 후, C.의 수를 수동으로 계산 글라 브라는 AP를 식민지YPD 매체에 peared는 희석 계수 (2 시간의 CFUs)에 거는와 C의 비율을 의미한다 식균 작용의 속도를 계산 다음과 같은 공식을 사용하여 2 시간의 coincubation 후 THP-1 식세포에 의해 섭취되는 글라 브라 셀. % 식균 작용은 = [(2 시간에서 CFUs) / (0 H에서 CFUs)] X 100 </li><li> C.의 세포 복제 속도를 측정하려면 THP-1 식세포에서 글라 브라 세포는 점은 감염의 예를 게시 다른 시간에 세포 내 효모를 수집합니다. 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간, 3.3-4.3 단계를 반복함에 따라. </li><li> C.의 배 서바이벌 / 복제를 계산 2 시간 (포식 효모)에 그 어떤 주어진 시점에서 총 CFUs 나누어 THP-1 식세포에서 글라 브라 셀. </li></ol> 5. 공 초점 라스를 사용하여 세포 내 복제 모니터링어 스캐닝 현미경 <ol><li> 제 1 절에서 설명하는 단계에 따라 2 ~ 4 잘 챔버 슬라이드의 각 웰에있는 PMA 처리 된 5 × 5 THP-1 세포를 배정하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 데워진 RPMI-1640 완전 배지와 오래 된 매체를 교체하고 세포를 12 시간 동안 PMA 처리를 복구 할 수 있습니다. </li><li> GFP를 준비 (녹색 형광 단백질) C.에게 - 태그 글라 브라 세포 현탁액 2 항에서 기술과 1의 MOI에 THP-1 대식 세포에 감염으로. 만약 C. GFP를 표현하는 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)으로 표시 효모 세포는 초기 이벤트가 감염 즉 게시 모니터링하는 데 사용할 수있는 사용할 수없는 글라 브라는 변종. 식균 작용의 속도와 2 시간에 phagolysosomal 성숙. </li><li> , 5 % CO 2와 37 ° C에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 매체를 삭제하고 무균으로 배를 씻어 신중하게 반전, PBS는 데워진. </li><li> 500 μL는 RPMI-1640 완전한 메디 데워진 추가음 하나의 슬라이드의 각 실에 22 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 그것을 품어. </li><li> 2 시간의 C.를 해결하려면 글라 브라에 감염된 THP-1 식세포, 다른 슬라이드의 각 실에 (PBS에서 준비) 3.7 %의 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 실온에서 그것을 품어. </li><li> 워시, PBS로 세 번 슬라이드 500 μL 트리톤-X (0.7 %)를 추가하고, 어둠 속에서 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> PBS로 세척 슬라이드 배는, 문화의 슬라이드에서 챔버를 제거하고 공기 어둠 속에서 3 ~ 5 분 동안 건조. </li><li> 정중 기포 형성을 회피 슬라이드 DAPI를 포함 Vectashield 장착 매체 (4 &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌)를 사용하여 커버 슬립을 장착. 부드럽게 킴 와이프로 물기를 제거하고 손톱 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 4 ° C에서 사용할 때까지의 어둠에 보관 슬라이드. </li><li> 반복 THP-1 세포에게 24 시간 후 감염을 처리하기 위해 5.4 5.6-5.9 단계를 반복합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 confo를 이용한 이미지 셀칼 현미경 (60X 기름 침지 목표, DAPI 및 GFP의 얼룩에 대한 405 nm의 및 488 nm에서 여기, 각각). </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

선천성 면역계는 편의적 진균 감염의 조절에 중요​​한 역할을한다. 대 식세포는 섭취와 곰팡이 병원균의 파괴에 의해 방어 항진균제에 기여한다. 따라서, 생존 및 / 또는 대 식세포의 항균 기능을 반작용에 필요한 요인의 해명은 곰팡이 독성 전략에 대한 우리의 이해를 진행합니다. 이러한 상황에서, 우리는 인간 편의적 진균 병원체 C.의 상호 작용을 특성화하기 위해 인간 단구 세포주 THP-1 유래의 대 식세포를 사용하여 시험 관내 세포 배양 모델 시스템을 설립 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 이 THP-1 대식 모델 시스템이 성공적 C.를 식별하는 데 사용되었지만 칸디다 8의 쥐 모델에서 감쇠 독성을 표시 감소 생존 글라 브라 돌연변이,이 시스템의 그럴듯한 제한, 따라서, 얻어진 결과는 고립 된 상황이고하지 않을 수 있습니다항상 복잡한 포유 동물 숙주의 면역 시스템에 적용 가능. 또한,이 시스템은 살아있는 세포 이미징 방법과는 달리...

칸디다 종은 면역 저하 환자의 1에 생명을 위협하는 침습성 진균 감염의 주요 원인이다. 칸디다 글라 브라, 신흥 병원 내 병원체는 지리적 위치 1-3에 따라 중환자 실 환자에서 두 번째 또는 세 번째 가장 자주 고립 칸디다 종입니다. 계통 발생 학적으로, C. 글라 브라, 반수체 신진 효모, 더 밀접하게 비 병원성 모델 효모 사카로 병원성 칸디다 종보다 사카로 마이 세스 세레 비시에 관련되어 있습니다. C. 포함 알비 칸스 4. 이과 일치, C. 글라 브라는 짝짓기, 분비 단백질 분해 활성과 형태 학적 소성 4-5 등 일부 주요 곰팡이 독성 특성이 부족하다. 비록 C. 글라 브라는 균사를 형성하지 않는, 그것은 생존과 6-8는 고유 발병 메커니즘을 개발했다고 제안 쥐와 인간 대 식세포에 복제 할 수 있습니다. 제한된 정보는 전략에 대해 사용할 수 있는지 C. 글라 브라는 영양이 부족한 세포 대식 세포 환경을 생존과 산화 및 호스트 면역 세포 5 마운트 비산 화성 호스트의 응답을 방해하기 위하여 사용한다. 관련 식세포 모델 시스템은 C.의 상호 작용을 묘사하는 필수 조건이다 기능 유전체 및 단백체 접근 방식을 통해 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 및 인간 및 뮤린 기원의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)는 각각 이전 C.의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다 숙주 면역 세포 7,9와 글라 브라. 그러나, PBMC를하고 BMDMs를 얻기 어려움, 제한된 수명과 다른 포유 동물의 기증자들 본질적인 변화는 이러한 세포의 활용으로 다양한 모델의 시스템을 제한합니다. 여기에서, 우리는 intracellul을 연구하는 생체 시스템의 구축 방법을 설명합니다C. 아칸소 동작 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 파생 된 대 식세포에서 글라 브라 셀. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 쉽게 호스트 곰팡이 병원균 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위해 조작 할 수있는 간단하고 저렴한, 빠르고, 재생 가능한 세포 배양 모델 시스템을 제정했다. THP-1 세포는 이전에 박테리아, 바이러스, 진균 등 10-12 병원균의 광범위한 대 숙주 면역 반응을 해독하는데 사용되어왔다. 단핵구 THP-1 세포는 유지 관리가 용이하고 인간의 단핵구 유래 대 식세포를 모방하고 적절한 대식 세포 마커 (13)를 표현하는 대 식세포에, 포르 볼 에스테르 처리에 따라 차별화 할 수 있습니다. THP-1 대식 모델 시스템의 주요 이점은 사용의 용이성 및 정교한 장비의 요구 사항의 부족이다. 여기에 제시된 프로토콜은 HOS 다른 사람의 곰팡이 병원균의 상호 작용을 연구하기 쉽게 적응할 수있다면역 세포를 톤. 현재의 절차는 또한 고 스루풋 돌연변이 스크린을 사용하여 관심의 병원체에 대한 독성 요소를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 증명의 개념은 인간 대 식세포에서 8 C. 글라 브라의 생존에 필요한 유전자 (56)의 집합을 식별하는 THP-1 배양 모델 시스템의 성공적인 사용에 의해 예시되었다.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>인간 급성 단핵 백혈병 세포주</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>THP-1 세포 유지를 위해</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>주의: 위험한</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Candida glabrata 세포 성장용</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>C. glabrata-감염된 THP-1 대식세포의 고정을 위해</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td></td><td></td><td>완충액 (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&nbsp; pH 7.4) 세척용</td></tr><tr><td>식염수-시트르산나트륨 (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>세척용 완충액(3M NaCl, 20배 농도의 경우 0.3M 구연산나트륨)</td></tr><tr><td>사전 혼성화 완충액</td><td></td><td></td><td>완충액(50% 포름아미드, 5배 Denhardt' s solution, 5x SSC, 1% SDS) 혼성화를 위한</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 마운팅 매체</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>컨포칼 현미경 검사용</td></tr> <tr><td>32P 라벨링 &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>시그니처 태그의 방사선 라벨링용</td></tr><tr><td>100 mm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>THP-1 세포 배양</td></tr><tr><td>24-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>THP-1 대식 세포에서 C. glabrata 감염 연구를 수행하려면</td></tr><tr><td>4 챔버 조직 배양 처리 유리 슬라이드</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104 <</td><td>em>C. glabrata 감염된 THP-1 대식 세포를 이미지화하려면</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Rohem India</td><td></td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>용 탁상용 마이크로 원심 분리기 Beckman</td><td>Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>마이크로튜브의 세포 회전용</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>15ml 튜브의 세포 축소</td></tr>용 <tr><td>분광 광도계</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>효모 세포의 흡광도를 모니터링하기 위해</td></tr><tr><td>플레이트 인큐베이터</td><td>Labtech</td><td>냉장</td><td>C. glabrata 세포 성장</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>C. glabrata 세포 성장</td></tr><tr><td>워터 재킷 CO2&nbsp; 인큐베이터</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma series 2</td><td>THP-1 세포 배양</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>C. glabrata 감염된 THP-1 대식세포 관찰</td></tr><tr><td>복합 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>C. glabrata 및 THP-1 대식세포 PCR 기계를 관찰하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>DNA 엔진</td><td>입력 및 출력 게놈 DNA 교잡 오븐에서 고유한 태그를 증폭하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>혼성화를 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>하이브리드 멤브레인 스캔용</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>방사선 표지 서명 태그의 변성용</td></tr><tr><td>겔 문서화 유닛</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>아가로스 겔에서 브롬화 에티듐 염색 DNA를 시각화하기 위해</td></tr></tbody></table>

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 thp-1 식세포에

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

세포 배양 모델 계, 호스트 환경 조건 부근 미믹, 미생물 병원체 감염의 특정 단계의 연구를위한 동물 모델 시스템을 저렴하고 재현성 쉽게 처리 가능한 대안이 될 수있는 경우. , 포르 볼 에스테르 치료시, 대 식세포로 분화된다 THP-1 인간 단핵구 세포주는 이전에 결핵균을 포함한 많은 세포 내 병원체의 독성 전략을 연구하기 위해 사용되었다. 여기서, 우리는 시험 관내 세포 배양 모델을 규정하는 프로토콜 토론 호스트 식세포 세포와 기회 주의적 인간의 효모 병원체 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 묘사하는 THP-1 대식 세포를 사용하여 시스템. 이 모델 시스템은 간단하고, 빠르고, 높은 처리량 돌연변이 화면에 순종하고, 더 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 전형적인 THP-1 대식 세포 감염 실험 복구 세포를 허용하는 추가 ~ 48 시간으로 약 24 시간 소요식민지 단위 기반의 생존 분석을 형성하기 위해 다양한 매체에 성장 효모. 다른 시험 관내 모델 시스템과 같이,이 접근법의 가능한 제한은 인간 숙주에 존재하는 매우 복잡한 면역 세포 회로에 얻어진 결과를 외삽 곤란하다. 그러나 이것에도 불구하고, 현재의 프로토콜은 곰팡이 병원균 / 회피 항균 응답을 방해 생존, 적응 및 숙주 면역 세포의 영양이 부족한 환경에서 증식하는 데 사용할 수있다 전략을 명료하게하는 것은 매우 유용합니다.

감염 C.와 PMA 처리 THP-1 대식 세포의 분석 글라 브라 야생형 (중량) 세포는 중량 세포가 2 시간의 coincubation 후 55-65%의 속도로 대 식세포에 의해 포식 것으로 나타났다. 또한, C. 글라 브라 세포는 THP-1 식세포에 의해 살해를 저항 할 수 있었고, 적당한 5을 시행 - THP-1 식세포 8 공동 배양 24 시간 후 CFUs의 7 배 증가. THP-1 식세포에서 GFP-발현 플라스미드로 형질 전환 된 야생형 세포의 세포 복제는 THP-1 식세포 당 세포 효모 세포의 수가 걸쳐 7-12에 하나 또는 두 증가 상기 공 초점 형광 현미경으로 확인 하였다 24 시간의 (그림 1). <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:...

현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간의 기회감염성 진균 병원체의 세포 내 거동을 연구하기 위한 인 비트로(in vitro) 배양 모델 시스템을 구축하는 것입니다. 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 유래한 대식세포 내의 Candida labia ratta를 연구합니다. 이를 위해 THP-1 단핵구를 먼저 PMA로 처리하여 대식세포로 분화시킵니다.다음으로, 감염 2시간 후 THP-1 대식세포를 candida GTA 세포로 감염시킵니다. 식세포 작용이 일어나지 않은 candida GTA 세포는 PBS 세척으로 제거하며, 감염된 대식세포를 삼투압 용해하여 내부의 e 세포를 회수해 추가 연구에 사용합니다. 이 프로토콜은 대식세포 내의 바이러스 및 candida GTA 세포뿐만 아니라, candida GTA 감염 시 THP-1 대식세포의 faiz 성숙 과정과 사이토카인 반응을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.또한, 이 프로토콜은 semi high throughput 방식으로 TSP one 대식세포에서 생존 프로필의 변화를 확인하기 위해 candida collaborator 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하도록 확장 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 비용이 상대적으로 저렴하고 재현성이 높으며, 다양한 면역 세포뿐만 아니라 진균 병원체에도 쉽게 적용 가능하다는 점입니다. 절차를 시작하기 위해, 감염 2일 전에 THP 단핵구 세포를 80% 밀도로 배양하고, 1일 차에 배양 플라스크를 꺼내어 모든 부착 세포가 현탁액 상태가 되도록 천천히 부드럽게 처리합니다.DHP one 단핵구 세포 현탁액을 15 ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 실온에서 1000 RPM으로 4분 동안 원심분리합니다. 배지를 폐기물 용기에 따라내고, 5 ml의 pre API 배지를 튜브에 넣고 재현탁합니다. 배지를 3~4회 부드럽게 피펫팅하여 THV one 세포 펠릿을 현탁시킵니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 밀도를 측정하기 위해 세포 현탁액 10 µL를 취하고, 세포 밀도를 1 x 10⁶ cells/ml로 조정합니다. 최종 농도가 16 nM이 되도록 60 µM PMA 스톡 솔루션 1 µL를 세포 현탁액에 첨가하고 잘 혼합합니다. 1 x 10⁶ cells에 해당하는 세포 현탁액 1 ml를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고, 37 °C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다.12시간 동안 배양한 후, 기존 배지를 제거합니다. 각 웰에 pre RPI 배지 1 ml를 첨가하고 플레이트를 다시 12시간 동안 배양합니다. 이 세포들은 이후에 설명할 Candida story 감염 실험에 사용됩니다.적절한 미생물학적 실험 관행을 사용하여 단일 EA colony를 ML YPD 배지가 담긴 플라스크에 접종합니다. 30 Degrees Celsius로 설정된 배양기에서 플라스크를 14~16시간 동안 배양한 후, 원심분리기를 사용하여 ML 배양액을 4,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 멸균 PBS로 쉘을 3회 세척합니다. 세척 버퍼를 버린 후, 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠렛을 1 ml의 멸균 PBS에 현탁합니다. 다음으로, 분광광도계를 사용하여 600 nanometer에서 세포 현탁액의 흡광도를 측정하고, PBS를 이용해 세포 밀도를 2 million cells per ml로 조정합니다.세포 현탁액 50 µL를 취하여 PBS로 100배 희석한 후, YPD AGA 배지에 100 µL의 배양액을 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 배양하고 1~2일 후 YPD 플레이트에 나타난 콜로니 수를 측정합니다. 이 수치에 적절한 희석 배수를 곱하여 0시간의 콜로니 형성 단위(colony forming units)를 계산합니다. 이렇게 계산된 수의 Canada Reta 콜로니 형성 단위를 사용하여 대식세포의 DHE를 감염시킵니다.다음 단계에서는 24-well 배양 플레이트의 대식세포 단층에 Canada clater 세포 현탁액 50 µL를 첨가합니다. 각 세포가 균일하게 분포되도록 플레이트를 흔들어 준 후 37 °C에서 배양하고, 2시간의 배양 후 배지를 제거합니다. 배양 플레이트를 용기에 뒤집어 배지를 버리고, 배양 플레이트의 각 well 벽면을 따라 1 mL의 sterile PBS를 조심스럽게 가해 각 well을 충분히 세척한 뒤 버퍼를 제거합니다.이 단계를 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 첫 번째 웰을 제외한 나머지 모든 웰에 RPI 배지 1 mL를 첨가합니다. 이는 감염 후 4, 6, 12, 24시간째에 candida albicans 세포의 세포 내 복제를 모니터링하는 데 사용됩니다. 대식세포 감염 2시간 후 세포 내 e 세포를 회수하기 위해, 해당 웰에 sterile water 1 mL를 첨가합니다. 2분 후, 1 mL 피펫 팁을 사용하여 웰을 부드럽게 긁어내어 웰 내의 대식세포 잔해를 제거합니다.웰을 헹구고 용해물을 매크로 중심 원심분리 튜브에 수집합니다. PBS를 사용하여 microFIT 세포 용해물을 100배 희석하여 준비하고, YPD AGA 배지에 100 µL를 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 1~2일 동안 배양하고 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 측정합니다.이 수치에 적절한 희석 배수를 곱하여 2시간 감염 후 T2 세포와 대식세포에 의해 식균 작용이 일어난 *Candida albicans* 세포의 수를 산출합니다. 마찬가지로, 다양한 시간대에서 세포 내 *Candida albicans* 세포의 수를 결정할 수 있습니다. 감염 후 세포 내 증식은 여기에서 보여준 2시간 시점에 내재화된 CFU와 비교하여 24시간 시점의 CFU 증가로 나타낼 수 있습니다.전체 6 × 10⁴개의 canida gator 세포가 TV one 대식세포에 감염된 전형적인 실험의 다른 결과입니다. 24시간 후 회수된 세포 수는 3.76 × 10⁴개입니다. 이는 24시간의 공동 배양 기간 동안 세포가 62.66%의 비율로 식세포 작용되었음을 보여줍니다.세포 내 e 세포 수가 3.76 times 10.4에서 1.96 times 10.5로 증가함에 따라, al 세포는 5.2배의 복제를 보였습니다. 본 실험에서 canida TER 세포의 세포 내 복제는 GFP를 발현하는 E 세포와 공초점 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다. 24-well 배양 플레이트에 대해 앞서 설명한 프로토콜을 사용하여 4-chamber 슬라이드에 THV와 대식세포를 준비하고 감염시키십시오.감염 2시간 후. 슬라이드를 폐기물 용기에 뒤집어 배지를 제거한 뒤, 슬라이드의 각 챔버에 500 µL PBS를 넣습니다. 충분히 헹군 후 PBS를 제거합니다.세포를 고정하기 위해 3.7% formalde Hyde 500 µL를 사용하여 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 슬라이드를 상온에서 20분 동안 배양한 후 formalde Hyde를 제거합니다. 각 웰을 500 µL PBS로 세척하여 대식세포를 투과화합니다. 500 µL Triton X를 넣고 5분 동안 배양한 후, Triton X를 제거하고 웰을 PBS로 세척합니다.chamber removal 및 air rider slide를 사용하여 챔버 슬라이드를 조심스럽게 분해합니다. 슬라이드의 각 구역에 DPI가 포함된 vector Shield 마운팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후, 커버슬립을 덮고 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 공초점 현미경으로 세포를 관찰합니다. 여기에 제시된 이미지는 GFE를 발현하는 wild type canida laboratory 세포에 감염된 TP one 대식세포의 대표적인 공초점 이미지입니다. 2시간에서 24시간 사이에 세포 내 e 세포 수가 약 6배 증가한 것은 TP one 대식세포 내에서 canida laboratory가 복제되었음을 나타냅니다. 시그니처 태그 돌연변이 유발 접근법은 미생물 병원체의 병원성 인자를 식별하는 데 널리 사용되며, 고유한 올리고뉴클레오타이드 서열 태그를 통해 다수의 돌연변이체를 대상으로 성장 결함을 동시에 스크리닝합니다.본 여기에서는 캐나다 라이브러리(Canada Library) 및 돌연변이 라이브러리의 STM 스크리닝을 위한 프로토콜을 설명하며, 이는 다음 세 단계로 구성됩니다. 우선, 고유한 올리고뉴클레오타이드 서열 스택을 각각 포함하는 96개의 플라스미드를 나일론 막에 고정합니다.두 번째 단계에서는 96종의 CANIDA ator 돌연변이 풀을 대상으로 THV one 대식세포에서의 생존 프로파일 변화를 스크리닝하며, 이어서 YPD에서 배양되어 대식세포 내로 내재화된 돌연변이 e 세포를 회수하는데, 이를 각각 입력(input) 및 출력(output) 샘플이라 합니다. 마지막으로, 입력 및 출력 게놈 DNA 샘플로부터 DNA 시그니처 태그를 PCR로 증폭하고 방사성 표지를 합니다. PCR 생성물을 고유 태그에 하이브리드화하고, 멤브레인 상의 방사성 신호를 정량화하여 분석합니다.96 12 도트 보드 장치를 조립하려면, 젖은 나일론 막을 습윤한 swap wind tree 종이 위에 놓고 장치의 나사를 조입니다. 막을 멸균수로 세척한 후, 0.4 M 수산화나트륨으로 세척합니다. 0.4 M 수산화나트륨 세척 단계 이후, 96 12 블록에서 200 ng의 PLA BDNA 용액을 도트 보드 장치의 해당 웰로 옮깁니다.UV 가교 장치(UV crosslinker)에서 전이된 플라스마 BDNA를 막에 가교시킨 후, 도트 블러드 장치에서 막을 제거합니다. 막을 전-하이브리다이제이션 버퍼(pre hybridization buffer)에 넣고, input 및 UNE 병에 담아 42 °C에서 2시간 동안 배양합니다. input 및 output 세포 펠렛에서 추출한 게놈 DNA와 unique Tag의 invert flanking region에 대응하는 프라이머를 사용하여 PCR로 방사성 표지 프로브를 준비합니다.방사성 표지 프로브를 99 Degrees Celsius에서 5분 동안 변성시킨 후, 얼음 위에서 급냉합니다. 변성된 프로브를 입력 및 출력 병으로 옮기고 42 degrees Celsius에서 14~16시간 동안 배양합니다. 하이브리드화 후 단계입니다.프로토콜에 설명된 대로 입력 및 출력 막을 세척합니다. 병에서 막을 꺼내 공기 중에서 건조시킨 후 포스포이미징 스크린에 노출시킵니다. 2~3시간 후에 포스포러스 스크린을 스캔하여 이미지를 획득합니다.본 예시에서는 생존율 변화를 확인하기 위해 96개의 canida Gatory 돌연변이 풀 하나를 스크리닝한 두 개의 하이브리드화된 멤브레인 필터가 제시되어 있습니다. 대식세포 정량 분석 및 입력 멤브레인 대비 출력 멤브레인의 각 스팟 신호 강도 비율을 결정한 결과, 태그 번호 13, 26, 75 및 85가 출력에서 과소 표현된 것으로 나타났습니다. 이 스팟들은 빨간색 원으로 표시되어 있으며, 네 가지 서로 다른 돌연변이의 성장을 반영합니다.반대로, 녹색으로 표시된 고유 서열 11 및 81을 가진 돌연변이 적층체는 출력 샘플에서 과다하게 나타납니다. 즉, 이번 스크리닝의 96개 돌연변이 풀에서 두 개의 돌연변이는 생존율을 높이는 반면, 네 개의 돌연변이는 대식세포 내 성장을 보이는 것으로 나타났습니다. 이러한 풀 스크리닝에서 확인된 변화된 생존 표현형은 단일 감염 분석을 통해 검증되어야 합니다.이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 진균 병원체의 구강 내 성장 프로파일을 연구하기 위한 인비트로(in vitro) 구강 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 이제 이 시스템을 사용하여 대규모 돌연변이 풀 스크리닝을 수행할 수 있을 것입니다.

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

이 비디오에서는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 신경모세포종에 대한 미세아교세포 형성 분석을 수행합니다. 이 분석은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 기능의 손상을 평가하는 데 도움이 됩니다.

미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

이 비디오에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포사멸 세포의 청소를 연구하기 위한 efferocytosis assay를 시연합니다. efferocytosis는 apoptotic cell이 phagocyte에 의해 삼켜지고 efferosomes라고 하는 소포 내에서 분해되는 다단계 과정입니다. 이 프로토콜은 개별 세포사멸 세포의 내부화된 부분과 내부화되지 않은 부분을 시각화하고 efferocytosis를 정량화하는 방법을 제공합니다.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을...

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 본 논문의 목적은 Trichoderma stromaticum conidia로 자극된 인간 말초혈액 단핵 유래 대식세포의 식균작용 및 제거 능력을 평가하는 방법을 제시하는 것이다.

Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages의 생존력 분석

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

인간 CART와 골수 세포 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 제한된 이종이식 모델을 감안할 때, 우리는 CART 세포에 대한 인간 대식세포의 영향을 이해하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 확립했습니다. 연구 결과는 종양 미세 환경에서 대식세포 역할을 평가하고 대식세포 표적 면역 요법을 테스트하기 위해 잠재적으로 일반화될 수 있습니다.

시험관 내 및 생체 내 골수 세포와 CAR T 세포 간의 상호 작용 연구

배우세요 Candida glabrata의 THP-1 대식세포 내 행동을 연구하는 체외 배양 모델을 수립하는 방법을. 이 프로토콜은 진균 병원성 메커니즘과 숙주-병원체 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

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