설립

이 절차의 전반적인 목표는 인간의 기회감염성 진균 병원체의 세포 내 거동을 연구하기 위한 인 비트로(in vitro) 배양 모델 시스템을 구축하는 것입니다. 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 유래한 대식세포 내의 Candida labia ratta를 연구합니다. 이를 위해 THP-1 단핵구를 먼저 PMA로 처리하여 대식세포로 분화시킵니다.

다음으로, 감염 2시간 후 THP-1 대식세포를 candida GTA 세포로 감염시킵니다. 식세포 작용이 일어나지 않은 candida GTA 세포는 PBS 세척으로 제거하며, 감염된 대식세포를 삼투압 용해하여 내부의 e 세포를 회수해 추가 연구에 사용합니다. 이 프로토콜은 대식세포 내의 바이러스 및 candida GTA 세포뿐만 아니라, candida GTA 감염 시 THP-1 대식세포의 faiz 성숙 과정과 사이토카인 반응을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

또한, 이 프로토콜은 semi high throughput 방식으로 TSP one 대식세포에서 생존 프로필의 변화를 확인하기 위해 candida collaborator 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하도록 확장 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 비용이 상대적으로 저렴하고 재현성이 높으며, 다양한 면역 세포뿐만 아니라 진균 병원체에도 쉽게 적용 가능하다는 점입니다. 절차를 시작하기 위해, 감염 2일 전에 THP 단핵구 세포를 80% 밀도로 배양하고, 1일 차에 배양 플라스크를 꺼내어 모든 부착 세포가 현탁액 상태가 되도록 천천히 부드럽게 처리합니다.

DHP one 단핵구 세포 현탁액을 15 ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 실온에서 1000 RPM으로 4분 동안 원심분리합니다. 배지를 폐기물 용기에 따라내고, 5 ml의 pre API 배지를 튜브에 넣고 재현탁합니다. 배지를 3~4회 부드럽게 피펫팅하여 THV one 세포 펠릿을 현탁시킵니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 밀도를 측정하기 위해 세포 현탁액 10 µL를 취하고, 세포 밀도를 1 x 10⁶ cells/ml로 조정합니다. 최종 농도가 16 nM이 되도록 60 µM PMA 스톡 솔루션 1 µL를 세포 현탁액에 첨가하고 잘 혼합합니다. 1 x 10⁶ cells에 해당하는 세포 현탁액 1 ml를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고, 37 °C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다.

12시간 동안 배양한 후, 기존 배지를 제거합니다. 각 웰에 pre RPI 배지 1 ml를 첨가하고 플레이트를 다시 12시간 동안 배양합니다. 이 세포들은 이후에 설명할 Candida story 감염 실험에 사용됩니다.

적절한 미생물학적 실험 관행을 사용하여 단일 EA colony를 ML YPD 배지가 담긴 플라스크에 접종합니다. 30 Degrees Celsius로 설정된 배양기에서 플라스크를 14~16시간 동안 배양한 후, 원심분리기를 사용하여 ML 배양액을 4,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 멸균 PBS로 쉘을 3회 세척합니다. 세척 버퍼를 버린 후, 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠렛을 1 ml의 멸균 PBS에 현탁합니다. 다음으로, 분광광도계를 사용하여 600 nanometer에서 세포 현탁액의 흡광도를 측정하고, PBS를 이용해 세포 밀도를 2 million cells per ml로 조정합니다.

세포 현탁액 50 µL를 취하여 PBS로 100배 희석한 후, YPD AGA 배지에 100 µL의 배양액을 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 배양하고 1~2일 후 YPD 플레이트에 나타난 콜로니 수를 측정합니다. 이 수치에 적절한 희석 배수를 곱하여 0시간의 콜로니 형성 단위(colony forming units)를 계산합니다. 이렇게 계산된 수의 Canada Reta 콜로니 형성 단위를 사용하여 대식세포의 DHE를 감염시킵니다.

다음 단계에서는 24-well 배양 플레이트의 대식세포 단층에 Canada clater 세포 현탁액 50 µL를 첨가합니다. 각 세포가 균일하게 분포되도록 플레이트를 흔들어 준 후 37 °C에서 배양하고, 2시간의 배양 후 배지를 제거합니다. 배양 플레이트를 용기에 뒤집어 배지를 버리고, 배양 플레이트의 각 well 벽면을 따라 1 mL의 sterile PBS를 조심스럽게 가해 각 well을 충분히 세척한 뒤 버퍼를 제거합니다.

이 단계를 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 첫 번째 웰을 제외한 나머지 모든 웰에 RPI 배지 1 mL를 첨가합니다. 이는 감염 후 4, 6, 12, 24시간째에 candida albicans 세포의 세포 내 복제를 모니터링하는 데 사용됩니다. 대식세포 감염 2시간 후 세포 내 e 세포를 회수하기 위해, 해당 웰에 sterile water 1 mL를 첨가합니다. 2분 후, 1 mL 피펫 팁을 사용하여 웰을 부드럽게 긁어내어 웰 내의 대식세포 잔해를 제거합니다.

웰을 헹구고 용해물을 매크로 중심 원심분리 튜브에 수집합니다. PBS를 사용하여 microFIT 세포 용해물을 100배 희석하여 준비하고, YPD AGA 배지에 100 µL를 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 1~2일 동안 배양하고 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 측정합니다.

이 수치에 적절한 희석 배수를 곱하여 2시간 감염 후 T2 세포와 대식세포에 의해 식균 작용이 일어난 *Candida albicans* 세포의 수를 산출합니다. 마찬가지로, 다양한 시간대에서 세포 내 *Candida albicans* 세포의 수를 결정할 수 있습니다. 감염 후 세포 내 증식은 여기에서 보여준 2시간 시점에 내재화된 CFU와 비교하여 24시간 시점의 CFU 증가로 나타낼 수 있습니다.

전체 6 × 10⁴개의 canida gator 세포가 TV one 대식세포에 감염된 전형적인 실험의 다른 결과입니다. 24시간 후 회수된 세포 수는 3.76 × 10⁴개입니다. 이는 24시간의 공동 배양 기간 동안 세포가 62.66%의 비율로 식세포 작용되었음을 보여줍니다.

세포 내 e 세포 수가 3.76 times 10.4에서 1.96 times 10.5로 증가함에 따라, al 세포는 5.2배의 복제를 보였습니다. 본 실험에서 canida TER 세포의 세포 내 복제는 GFP를 발현하는 E 세포와 공초점 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다. 24-well 배양 플레이트에 대해 앞서 설명한 프로토콜을 사용하여 4-chamber 슬라이드에 THV와 대식세포를 준비하고 감염시키십시오.

감염 2시간 후. 슬라이드를 폐기물 용기에 뒤집어 배지를 제거한 뒤, 슬라이드의 각 챔버에 500 µL PBS를 넣습니다. 충분히 헹군 후 PBS를 제거합니다.

세포를 고정하기 위해 3.7% formalde Hyde 500 µL를 사용하여 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 슬라이드를 상온에서 20분 동안 배양한 후 formalde Hyde를 제거합니다. 각 웰을 500 µL PBS로 세척하여 대식세포를 투과화합니다. 500 µL Triton X를 넣고 5분 동안 배양한 후, Triton X를 제거하고 웰을 PBS로 세척합니다.

chamber removal 및 air rider slide를 사용하여 챔버 슬라이드를 조심스럽게 분해합니다. 슬라이드의 각 구역에 DPI가 포함된 vector Shield 마운팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후, 커버슬립을 덮고 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 공초점 현미경으로 세포를 관찰합니다. 여기에 제시된 이미지는 GFE를 발현하는 wild type canida laboratory 세포에 감염된 TP one 대식세포의 대표적인 공초점 이미지입니다. 2시간에서 24시간 사이에 세포 내 e 세포 수가 약 6배 증가한 것은 TP one 대식세포 내에서 canida laboratory가 복제되었음을 나타냅니다. 시그니처 태그 돌연변이 유발 접근법은 미생물 병원체의 병원성 인자를 식별하는 데 널리 사용되며, 고유한 올리고뉴클레오타이드 서열 태그를 통해 다수의 돌연변이체를 대상으로 성장 결함을 동시에 스크리닝합니다.

본 여기에서는 캐나다 라이브러리(Canada Library) 및 돌연변이 라이브러리의 STM 스크리닝을 위한 프로토콜을 설명하며, 이는 다음 세 단계로 구성됩니다. 우선, 고유한 올리고뉴클레오타이드 서열 스택을 각각 포함하는 96개의 플라스미드를 나일론 막에 고정합니다.

두 번째 단계에서는 96종의 CANIDA ator 돌연변이 풀을 대상으로 THV one 대식세포에서의 생존 프로파일 변화를 스크리닝하며, 이어서 YPD에서 배양되어 대식세포 내로 내재화된 돌연변이 e 세포를 회수하는데, 이를 각각 입력(input) 및 출력(output) 샘플이라 합니다. 마지막으로, 입력 및 출력 게놈 DNA 샘플로부터 DNA 시그니처 태그를 PCR로 증폭하고 방사성 표지를 합니다. PCR 생성물을 고유 태그에 하이브리드화하고, 멤브레인 상의 방사성 신호를 정량화하여 분석합니다.

96 12 도트 보드 장치를 조립하려면, 젖은 나일론 막을 습윤한 swap wind tree 종이 위에 놓고 장치의 나사를 조입니다. 막을 멸균수로 세척한 후, 0.4 M 수산화나트륨으로 세척합니다. 0.4 M 수산화나트륨 세척 단계 이후, 96 12 블록에서 200 ng의 PLA BDNA 용액을 도트 보드 장치의 해당 웰로 옮깁니다.

UV 가교 장치(UV crosslinker)에서 전이된 플라스마 BDNA를 막에 가교시킨 후, 도트 블러드 장치에서 막을 제거합니다. 막을 전-하이브리다이제이션 버퍼(pre hybridization buffer)에 넣고, input 및 UNE 병에 담아 42 °C에서 2시간 동안 배양합니다. input 및 output 세포 펠렛에서 추출한 게놈 DNA와 unique Tag의 invert flanking region에 대응하는 프라이머를 사용하여 PCR로 방사성 표지 프로브를 준비합니다.

방사성 표지 프로브를 99 Degrees Celsius에서 5분 동안 변성시킨 후, 얼음 위에서 급냉합니다. 변성된 프로브를 입력 및 출력 병으로 옮기고 42 degrees Celsius에서 14~16시간 동안 배양합니다. 하이브리드화 후 단계입니다.

프로토콜에 설명된 대로 입력 및 출력 막을 세척합니다. 병에서 막을 꺼내 공기 중에서 건조시킨 후 포스포이미징 스크린에 노출시킵니다. 2~3시간 후에 포스포러스 스크린을 스캔하여 이미지를 획득합니다.

본 예시에서는 생존율 변화를 확인하기 위해 96개의 canida Gatory 돌연변이 풀 하나를 스크리닝한 두 개의 하이브리드화된 멤브레인 필터가 제시되어 있습니다. 대식세포 정량 분석 및 입력 멤브레인 대비 출력 멤브레인의 각 스팟 신호 강도 비율을 결정한 결과, 태그 번호 13, 26, 75 및 85가 출력에서 과소 표현된 것으로 나타났습니다. 이 스팟들은 빨간색 원으로 표시되어 있으며, 네 가지 서로 다른 돌연변이의 성장을 반영합니다.

반대로, 녹색으로 표시된 고유 서열 11 및 81을 가진 돌연변이 적층체는 출력 샘플에서 과다하게 나타납니다. 즉, 이번 스크리닝의 96개 돌연변이 풀에서 두 개의 돌연변이는 생존율을 높이는 반면, 네 개의 돌연변이는 대식세포 내 성장을 보이는 것으로 나타났습니다. 이러한 풀 스크리닝에서 확인된 변화된 생존 표현형은 단일 감염 분석을 통해 검증되어야 합니다.

이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 진균 병원체의 구강 내 성장 프로파일을 연구하기 위한 인비트로(in vitro) 구강 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 이제 이 시스템을 사용하여 대규모 돌연변이 풀 스크리닝을 수행할 수 있을 것입니다.