미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 미세조류의 총 지방산 함량과 조성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 알려진 양의 동결건조된 조류 바이오매스를 포함하는 샘플을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미세조류 바이오매스를 파괴하는 것입니다.

다음으로, 친유성 성분을 추출하고 분리합니다. 마지막 단계는 ACell 지질을 지방산 메틸 에스테르로 에스테르 교환하는 것입니다. 궁극적으로 가스 크로마토그래피는 지방산을 정량화하는 데 사용됩니다.

tric determinations와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 매우 정확하고 모든 지방산 및 기타 모든 친유성 성분을 구체적으로 측정한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 NDI Afer가 될 것입니다.이 절차를 시작하기 전에 나열된 참고 문헌에 자세히 설명된 대로 배양 배지의 조류 건조 중량 농도(리터당 그램)를 결정하십시오. 5-10 밀리그램의 조류 건조 중량 나뭇가지 유리 원심 분리 튜브가 들어있는 배양 육수를 옮깁니다.

이전에 결정된 바이오매스 농도를 사용하여 옮겨진 바이오매스의 정확한 양을 계산하십시오: 관에 있는 대략 0.25 milliliter를 남겨두고, 상등액의 부분을 1200 Gs.Discard에 5 분 동안 표본을 원심 분리하십시오. 다음 소생술. 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 남아 있는 상층액에 조류를 현탁시키고 세포 혼합물을 비드 비터 튜브로 옮깁니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 원심분리기 튜브와 피펫 팁을 ±0.15ml의 밀리 큐브 물로 헹구고 액체를 비드 비터 튜브로 옮깁니다. 비드 비터 튜브를 최대 RPM으로 1분 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다. 완료되면 튜브의 재료를 동결 건조합니다.

리터당 50mg의 트립 펜타 디노(trip Penta Deano) 용액을 클로로포름과 메탄올의 강화된 부피 비율로 준비합니다. 용적식 피펫을 사용하여 삼각대 1 밀리리터를 넣고 구슬 튜브에 용액을 넣지 마십시오. 비드 비터 튜브의 캡 내부에 비드가 남아 있지 않은지 확인하면 튜브 비드가 누출될 수 있습니다.

비터 튜브를 2, 500RPM으로 60초 동안 8번 치며 각 구슬 사이에 122번째 간격을 둡니다. 다음으로, 비드 비터 튜브에서 테프론 인서트 나사 캡이 있는 깨끗한 내열 15ml 유리 원심분리기 튜브로 비드 용액을 옮깁니다. 용액 없이 삼각대 1ml로 비드 비터 튜브를 세척하고 세척액을 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

두 번 더 반복합니다. 샘플을 5초 동안 볼텍스한 다음 10분 동안 초음파 처리합니다. 2.5 밀리리터의 pH 7 밀리 큐브 물 용액에서 50 밀리 몰 트리스를 함유하고 1 몰 염화나트륨을 원심 분리 튜브로 초음파 처리 한 후.

샘플이 볼텍싱되고 두 번째 초음파 처리되면 1200에서 5분 동안 원심분리합니다. 완료되면 유리 파스티 피펫을 사용하여 바닥 클로로포름 상을 깨끗한 유리관으로 조심스럽게 옮기고 1ml의 클로로포름으로 추출을 반복합니다. 완료되면 유리 후방 피펫을 사용하여 클로로포름 상을 수집하고 첫 번째 클로로포름 분획으로 풀링합니다.

질소 가스 흐름을 사용하여 클로로포름을 증발시켜 건조된 추출된 지질을 제공합니다. 다음으로, 건조된 추출된 지질이 들어 있는 튜브에 5% 황산을 함유한 메탄올 3ml를 넣고 단단히 닫습니다. 5초 동안 샘플을 소용돌이치게 합니다.

블록 히터에서 섭씨 70도에서 3시간 동안 샘플을 배양합니다. 주기적으로 샘플이 끓지 않는지 확인하고 샘플을 확인할 때마다 튜브를 와류로 가열하십시오. 샘플이 3 밀리리터의 입방체의 실온으로 냉각되면 물과 3 밀리리터의 n 헤더가 와류 혼합 후 튜브에 공급됩니다.

시험관 회전기로 샘플을 15분 동안 교반합니다. 시험관 회전 장치에서 샘플을 제거한 후 1200 Gs.Using 유리 과거 피펫에서 5 분 동안 원심 분리, 상단 헥산 상 2 밀리리터를 수집하고 새로운 유리관으로 옮깁니다. 포집된 헥산상을 세척하려면 유리관에 2ml의 milli Q 물을 첨가합니다.

그런 다음 샘플을 5초 동안 와류로 만들고 5분 동안 원심분리합니다. 1200Gs에서 유리 페이스트리 피펫을 사용하여 유리관에서 GC 바이알로 헥산상을 옮깁니다. 그런 다음 GC 바이알에 캡을 씌우고 조여 용매 증발을 방지합니다.

GC fit 기기의 자동 샘플러에 샘플 바이알을 놓습니다. 마지막으로, 분당 20ml의 총 유속과 1마이크로리터의 주입량을 사용하여 새 호출 컬럼으로 기기에서 샘플을 실행합니다. 컬럼 사양과 크로마토그래피 조건에 대한 텍스트 프로토콜을 확인하시겠습니까?

이 프로세스를 통해 얻을 수 있는 일반적인 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다. 지방산 메틸 에스테르는 GC 컬럼에 의해 크기와 포화 정도에 따라 분리되며, 쇄 길이가 짧은 지방산과 포화 지방산이 더 많은 프로토콜을 사용하면 머무름 시간이 더 짧습니다. 사용된 GC 컬럼 및 프로토콜은 지방산 이성질체를 분리하기 위한 것이 아니지만, 이는 다른 GC 컬럼 및 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있습니다.

질소 충분 및 결핍 조건에서 C Desus UEX 3 93의 지방산 함량 및 조성이 여기에 표시됩니다. 총 지방산 함량은 질소 함유 및 질소 결핍 재배 조건에서 각각 8.6 플러스 또는 마이너스 0.5 % 및 44.7 플러스 또는 마이너스 1.7 %였습니다. 이러한 값은 지방산 조성 및 함량이 질소 결핍의 영향을 많이 받는다는 것을 보여줍니다.

ESBL에서 팔미트산과 올레산은 가장 풍부한 두 가지 지방산입니다. 지방산 함량 및 조성 계산에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 질소 충분 및 결핍 조건에서 Odum Trico UEX 6 4 0의 지방산 함량 및 조성이 여기에 나와 있습니다.

비스듬한 UU와 유사하게, 지방산 함량과 조성은 질소 결핍의 영향을 많이 받습니다. 질소가 충분하고 결핍된 조건에서 총 지방산 함량은 각각 11.7 플러스 또는 마이너스 0.9%와 30.5 플러스 마이너스 1.1%였습니다. P trium은 또한 I csap, Penta IC acid와 같은 상당한 양의 불포화 지방산을 생성합니다.

또한 리그너산과 같은 매우 긴 사슬 지방산도 이 방법으로 검출할 수 있습니다. 이 절차는 프로토콜 텍스트의 참고 문헌에 설명된 바와 같이 마이크로 LG의 지질 등급 조성에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 지질 추출과 에스테르 교환 단계 사이에 지질 응고 분리 단계를 포함함으로써 확장할 수 있습니다.