미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석

이 절차의 전반적인 목적은 미세조류의 총 지방산 함량과 조성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 알려진 양의 동결건조된 조류 바이오매스를 포함하는 샘플을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미세조류 바이오매스를 파쇄하는 것입니다.

다음으로, 친지성 성분을 추출하고 분리합니다. 마지막 단계는 ACell 지질을 지방산 메틸 에스테르로 전에스테르화하는 것입니다. 최종적으로, 가스 크로마토그래피를 사용하여 지방산을 정량합니다.

트라이클로로메탄(tric) 측정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 매우 정확하며 모든 지방산과 기타 모든 친지질 성분을 특이적으로 측정한다는 점입니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 NDI Afer가 맡아 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 나열된 참고 문헌에 상세히 설명된 대로 배양액 내 조류 건조 중량 농도를 g/L 단위로 측정하십시오. 조류 건조 중량이 5~10 mg 포함된 부피의 배양액을 유리 원심분리관으로 옮기십시오.

이전에 결정된 바이오매스 농도를 사용하여 전이된 바이오매스의 정확한 양을 계산하고, 시료를 1200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액의 일부를 제거하여 튜브에 약 0.25 milliliters가 남도록 합니다. 그다음, 펠릿을 피펫으로 부드럽게 위아래로 섞어 남은 상층액에 조류를 재현탁하고, 세포 혼합물을 비드 비터(bead beater) 튜브로 옮깁니다.

200 µL 피펫을 사용하여 원심분리 튜브와 피펫 팁을 ±0.15 mL의 milli cube water로 헹구고, 해당 액체를 비드 비터 튜브로 옮깁니다. 비드 비터 튜브를 최대 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다. 완료되면, 다음과 같이 튜브 안의 물질을 동결 건조합니다.

클로로포름과 메탄올의 강화된 부피 비율로 50 mg/L 농도의 trip Penta Deano 용액을 준비합니다. 양압 변위 피펫을 사용하여 비드 튜브에 tripod, no 용액 1 mL를 첨가합니다. 비드 비터 튜브의 캡 내부에 비드가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 비드가 남아 있을 경우 튜브의 비드가 누출될 수 있습니다.

비드 비터 튜브를 2,500 RPM에서 각 60초씩 8회 작동시키며, 각 비딩 사이에 12초의 간격을 둡니다. 다음으로, 비드 비터 튜브 내의 비드 혼합액을 테플론 삽입 나사 캡이 있는 깨끗한 내열성 15 milliliter 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 비드 비터 튜브를 1 milliliter의 tripod, no 용액으로 세척하고, 세척액을 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이 과정을 두 번 더 반복합니다. 샘플을 5초간 볼텍싱한 후 10분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 50 mM Tris와 1 M NaCl이 포함된 pH 7의 Milli-Q water 용액 2.5 mL를 원심분리 튜브에 첨가합니다.

샘플을 다시 한번 볼텍싱하고 초음파 처리한 후, 1200에서 5분 동안 원심분리합니다. 완료되면 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 하단의 클로로포름 층을 깨끗한 유리 시험관으로 조심스럽게 옮기고, 1 mL의 클로로포름으로 추출 과정을 반복합니다. 완료되면 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 클로로포름 층을 수집하고 이를 첫 번째 클로로포름 분획과 합칩니다.

질소 가스 흐름을 이용하여 클로로포름을 증발시켜 추출된 지질을 건조시킵니다. 다음으로, 건조된 추출 지질이 들어 있는 튜브에 5% 황산을 함유한 메탄올 3 mL를 첨가하고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 샘플을 5초 동안 볼텍싱합니다.

블록 히터에서 70 °C로 3시간 동안 샘플을 배양합니다. 샘플이 끓지 않는지 주기적으로 확인하고, 확인 때마다 튜브를 볼텍싱합니다. 샘플이 실온으로 식으면 3 mL의 milli-Q water와 3 mL의 n-hexane을 튜브에 넣고 볼텍싱하여 혼합합니다.

시험관 회전 혼합기를 사용하여 샘플을 15분 동안 교반합니다. 시험관 회전 혼합기에서 샘플을 꺼낸 후, 1200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층의 헥산 층 2 mL를 수집하여 새 유리 튜브로 옮깁니다. 수집된 헥산 층을 세척하기 위해 유리 튜브에 milli Q water 2 mL를 첨가합니다.

그 다음 샘플을 5초 동안 볼텍싱하고 5분 동안 원심분리합니다. 1200 Gs에서 유리관의 헥산 층을 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 GC 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 GC 바이알의 캡을 닫고 용매 증발을 막기 위해 단단히 조입니다.

시료 바이알을 GC fit 장비의 오토 샘플러에 배치합니다. 마지막으로, 20 milliliters per minute의 총 유량과 1 µL의 주입량을 사용하여 새 분석 컬럼으로 장비에서 시료를 분석합니다. 컬럼 사양 및 크로마토그래피 조건은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

이 과정을 통해 얻은 전형적인 크로마토그램이 여기에 제시되어 있습니다. 지방산 메틸 에스테르는 GC 컬럼에 의해 크기와 포화도에 따라 분리되며, 사용된 프로토콜에서는 사슬 길이가 짧은 지방산과 더 포화된 지방산의 머무름 시간이 더 짧게 나타납니다. 사용된 GC 컬럼과 프로토콜은 지방산 이성질체를 분리하도록 설계되지 않았으나, 이는 다른 GC 컬럼과 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있습니다.

질소 충분 조건과 결핍 조건 모두에서 C Desus UEX 3 93의 지방산 함량 및 조성이 여기에 표시되어 있습니다. 총 지방산 함량은 질소 충족 배양 조건에서 8.6 ± 0.5%, 질소 결핍 배양 조건에서 44.7 ± 1.7%였습니다. 이러한 값은 지방산 조성과 함량이 질소 기아 상태에 의해 크게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다.

ESBL에서 palmitic acid와 oleic acid는 가장 풍부한 두 가지 지방산입니다. 지방산 함량 및 조성 계산에 관한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 질소 충분 조건과 결핍 조건 모두에서 Odum Trico UEX 6 4 0의 지방산 함량 및 조성이 여기에 나타나 있습니다.

사선형 UU와 마찬가지로, 지방산 함량과 조성은 질소 결핍의 영향을 크게 받습니다. 질소 충분 조건과 결핍 조건에서 총 지방산 함량은 각각 11.7 ± 0.9% 및 30.5 ± 1.1%였습니다. P trium은 또한 I csap, Penta IC acid와 같이 고도로 불포화된 지방산을 상당량 생성합니다.

또한, ligner acid와 같은 초장쇄 지방산도 이 방법으로 검출할 수 있습니다. 프로토콜 본문의 참고 문헌에 설명된 바와 같이, 지질 추출 단계와 전에스테르화 단계 사이에 지질 응고물 분리 단계를 추가하여 이 절차를 확장하면 micro LG의 지질 클래스 조성에 대한 추가적인 통찰을 얻을 수 있습니다.