앞으로 유전 접근

본 절차의 전반적인 목표는 화학적 돌연변이 유발을 수행하고 유전자형-표형 연관성을 결정함으로써 chlamydia tritus에 대한 유전적 분석을 실시하는 것입니다. 이는 먼저 화학적 돌연변이 유발을 통해 chlamydia tracom 돌연변이 균주를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 전장 유전체 시퀀싱과 이어서 레퍼런스 기반 유전체 조립을 통해 화학적으로 생성된 모든 돌연변이를 식별합니다.

그런 다음 돌연변이 균주에서 표현형-유전자형 연관성을 확인합니다. 마지막으로, 재조합 균주를 생성하고 분석하여 표현형-유전자형 연관성을 검증합니다. 궁극적으로 고전적인 화학적 돌연변이 유발법과 차세대 염기서열 분석법(NGS)의 조합을 통해 특정 클라미디아 유전자의 돌연변이가 관심 표현형을 유발한다는 결과를 얻을 수 있습니다.

현재 클라미디아(chlamydia)의 유전자 교체를 위한 방법은 없으며, 이를 연구하기 위한 분자 유전학적 도구들은 아직 초기 단계에 머물러 있습니다. 본 방법은 재조합 DNA를 이용한 형질전환이나 분자 유전학적 도구의 개발을 필요로 하지 않으면서도, 개별 유전자 산물에 기능을 부여한다는 동일한 목적을 달성할 수 있습니다.

배양 세포를 준비하려면, 10% FBS가 보충된 3 mL의 DMEM에서 25 cm²당 약 1 × 10⁶ 개의 vir 세포를 분주하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 약 24시간 후 세포가 완전히 밀집(confluency)되면, 배지를 흡입하여 제거하고 감염 다중도(MOI) 5로 클라미디아를 감염시킵니다. 이때 200 ng/mL의 cycloheximide가 포함된 총 3 mL의 DMEM-FBS를 사용합니다. 감염 18시간 후 돌연변이 유발을 시작하기 위해, 화학 흄 후드 내에서 CaCl₂와 MgCl₂가 포함된 PBS를 사용하여 20 mg/mL의 ethyl methane sulfonate(EMS)를 준비합니다.

EMS는 강력한 돌연변이원 및 발암물질입니다. 따라서 폐기 방법은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. Vero 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고, 염화 마그네슘과 염화 칼슘이 포함된 PBS 3 mL로 세포를 한 번 세척합니다.

그 다음 3 mL의 EMS 용액을 가하고 흄 후드 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, EMS를 제거하고 1 M 수산화나트륨 용액이 담긴 용기에 넣어 돌연변이 유발 물질을 불활성화시킨 다음, 잔류 EMS를 제거하기 위해 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 200 ng/mL의 cyclo heximide와 25 µg/mL의 Gentamycin이 포함된 DMEM 10% FBS 6 mL를 가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48~72시간 동안 배양합니다.

돌연변이 유발 36시간 후, 72시간 시점에서 봉입체 내에 박테리아가 없는 것으로 보입니다. 봉입체의 약 10%는 박테리아로 채워져 있으며, 나머지는 비어 있습니다. 저장성 용해를 통해 기본체(elementary bodies) 또는 EB를 추출하려면 배지를 완전히 흡입하여 제거하십시오. 물 1 mL를 첨가하고 10분 동안 흔들어 세포를 탈락시킨 후, 피펫팅을 최소 10회 이상 반복하여 세포를 용해하십시오.

마이크로 원심분리 튜브에 용해물을 수집한 후, 5x sucrose, phosphate glutamate buffer(SPG) 0.25 mL를 첨가하여 최종 농도를 1x로 맞추고 -80 °C에서 보관합니다. 6-well 플레이트의 웰당 3 mL DMEM 10% FBS에 약 0.4 × 10⁶개의 VES 세포를 분주하여 세포 단일층을 형성시키고, 이후 24시간 동안 균일한 단일층이 형성되도록 둡니다. 다음으로, 클라미디아(chlamydia) 돌연변이체 스톡 용액을 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 DMEM 10% FBS를 사용하여 희석당 총 부피 200 µL로 10배 연속 희석액 6개 튜브를 준비하고 얼음에 보관합니다. 웰당 3 mL의 PBS를 사용하여 Vero 세포를 두 번 세척합니다. 그 후 6-웰 플레이트의 각 웰에 3 mL의 DMEM을 추가하고, 박테리아 희석액 100 µL를 두 번씩 분주합니다.

플레이트를 회전시켜 균일하게 혼합합니다. 감염된 플레이트를 15 °C에서 2,700 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그 후 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다.

그동안 다음 성분들을 먼저 결합하고 혼합하여 DMEM 내 0.54% AROS를 준비합니다. 그런 다음 덩어리가 생기지 않도록 저어주면서, 멸균된 뜨거운 1.2% AROS 수용액 18.9 milliliters를 혼합합니다. 혼합물을 55 degrees Celsius 항온수조에서 따뜻하게 유지합니다.

디쉬에서 박테리아 현탁액을 흡입하여 제거하고, 따뜻한 aro 용액 6 mL를 첨가합니다. 후드 밖의 상온에서 완전히 응고될 때까지 둡니다. 그런 다음 바이오안전 작업대 내에서 뚜껑을 열어 플레이트를 15분 동안 더 건조시킵니다. 플레이트가 건조되면 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 7~10일 동안 배양합니다.

돌연변이체를 분리하기 하루 전, 해부 현미경을 통해 플라크가 보여야 합니다. 웰당 100 µL에 1×10⁴ 개의 세포를 접종하십시오. 96-웰 플레이트의 경우, 세포는 24시간 이내에 컨플루언트(confluent) 상태가 됩니다.

해부 현미경 하에서 피킹할 플라크를 표시한 다음, 멸균된 1 mL 배리어 피펫을 사용하여 플라크 플러그를 수집합니다. 10% FBS, 400 ng/mL cycloheximide, 그리고 50 µg/mL Gentamicin이 첨가된 100 µL의 DMEM에 플라크를 재현탁하여 변이 균주를 증식시키며, 해당 현탁액을 Vero 세포의 confluent 단층 위에 오버레이합니다.

감염된 세포가 50% 이상일 때 수확하되, 이는 감염 후 빠르면 48시간에서 늦게는 14일까지 소요될 수 있습니다. 수확 전 플레이트를 2,700 GS, 15 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 이 정도 양의 감염된 세포가 있어야 감염된 세포의 저장성 용해를 통해 EV를 추출하기에 충분한 생존 박테리아를 확보할 수 있습니다. 배지를 흡입하여 제거한 후 160 µL의 멸균수를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다.

배리어 팁을 사용하여 피펫팅을 여러 번 반복함으로써 세포를 파쇄하고 완전한 용해를 유도합니다. 마지막으로, 각 용해물 160 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여기에 5X SPG 40 µL를 첨가하고, 분석 및 관심 표현형에 대한 돌연변이 스크리닝 전까지 -80 °C에서 보관합니다.

돌연변이 유발 물질에 노출되면 박테리아 세포 사멸로 인해 박테리아가 없는 것처럼 보이는 봉입체가 나타납니다. 일반적으로 serovar LGVL 2는 감염 후 48시간 이내에 감염된 세포를 완전히 용해시키지만, 돌연변이 유발 물질로 처리하면 이 주기가 90시간 이상으로 연장될 수 있으며, 본 실험에서는 봉입체의 약 10%가 회복될 것으로 예상됩니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 20 mg/mL의 EMS로 처리한 감염된 Vero 세포는 처리하지 않은 대조군에 비해 감염성 자손의 회복률이 99% 감소했습니다.

돌연변이원 처리로 인해 작은 플라크를 포함하여 형태가 변형된 플라크들이 나타났습니다. 다른 형태로는 여기에서 보여지는 것과 같이 과립형, 덩어리형 또는 벌집 모양의 플라크들이 있습니다. 이러한 연구들에 사용된 EMS 용량은 NGS로 실험적으로 평가했을 때 KCL 게놈당 3개에서 30개 사이의 돌연변이를 유발할 수 있습니다.

구배 정제된 EBS는 대부분 숙주 세포 물질이 제거되어 있으나, 이 절차를 거친 후의 게놈 분석물에서도 숙주 DNA가 검출되며 이는 약 10~15%를 차지합니다. 조직 배양 세포에서의 복제 장애, 생화학적 활성 상실 또는 박테리아 형태 변화와 같은 표현형 스크리닝을 통해, 클라미디아의 병원성 인자 형성 및 유지에 어떤 박테리아 인자가 필요한지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.