Name: 앞으로 유전 접근 클라미디아의 trachomatis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 Chlamydia trachomatis의 화학적 돌연변이 유도 및 전게놈 시퀀싱을 활용한 유전자형-표현형 연관 분석 방법입니다. 이 기술은 미생물 유전학 연구에 활용됩니다.

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1. 화학적 돌연변이 유발 참고 : 우리는 증식하는의 RB 양식 EB 양식보다 화학적 돌연변이 유발에 더 순종 것으로 나타났습니다. 중간 사이클 (HPI 20-18 사이)에서 RBS는 사전 RB-EB 전환에 가장 큰 숫자에 있습니다. 클라미디아의 trachomatis는 의무 세포 내 병원체이기 때문에, 호스트 건강에 돌연변이의 효과는 세균의 회복을 제한 할 수 있습니다. 베로 세포는 테스트를 다른 세포 라인보다 EMS 높은 수준의 부작용에 ​​저항 것으로 밝혀졌다. 재조합에 의한 변이의 분리는 항생제 내성 유전자 재조합 자손에 대한 선택을해야합니다. 우리는 재조합 분석을 수행하고 isogenic 균주를 분리하는 능력 돌연변이를 생성하기위한 약물 내성 변종 (예를 들어, 리팜핀, 스펙 티노 마이신, 또는 트리 메토 프림) 사용하는 것이 좋습니다. 항생제 내성은 단계적으로 선택 과정 (15, 16)에 의해 생성되었다. 아니E : 클라미디아의 trachomatis (변형 L2 / 434/Bu / ATCC VR902B가) BSL2 병원체이다. 이러한 병원균을 처리하기위한 제도적 표준 운영 절차 (SOP)를 참조하십시오. <ol><li> 배양 세포와 감염의 준비 : <ol><li> 25cm 2 (T25) Dulbecco 수정 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 3 ㎖의 플라스크 당 종자 약 1 × 10 6 베로 세포 (ATCC CCL-81). 37 품어 ° C, 5 % CO 2.에게 세포는 24 시간 안에 합류 단층을 형성해야한다. </li><li> 매체를 대기음. 매체의 3 ML의 총 볼륨 5 (~ 14 × 10 6)의 감염의 다중성 (모이) (DMEM, 200 NG / ML cyclohexamide, 10 % FBS)에서 클라미디아와 베로 세포의 합류 T25 플라스크를 감염. </li></ol></li><li> 18 시간 게시물 감염 (HPI)에서 돌연변이를 시작합니다 : <ol><li> 인산의 20 MG / ML EMS (에틸 메탄)를 준비 식염수 (PBS)는 0.9 mM의 칼슘과 버퍼EMS와 같은 화학 물질 안전성 후드 염화 0.49 밀리미터 염화 마그네슘은 휘발성 액체이다. 참고 : EMS는 강력한 돌연변이 및 발암 물질이다. EMS 낭비하고 1 M 수산화 나트륨과 유출, 플라스틱, 종이 및 유리의 오염을 제거 중화. </li><li> 매체를 대기음 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 2 3 ㎖ 한 번 세포를 씻으십시오. 상온에서 흄 후드에서 한 시간 동안 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 20 MG / ML EMS 3 ml의 세포를 품어. 베로 세포는 짧은 기간 동안 인큐베이터 외부 EMS 및 조건이 농도 살아남을 수 있습니다. mutagenized되지 않은 컨트롤 샘플을 포함해야합니다. </li><li> EMS를 포함하는 매체를 제거하고 돌연변이를 비활성화하는 1 M NaOH를 용기에 넣습니다. 잔여 돌연변이를 제거하는 3 ML PBS + MgCl 2 / 염화칼슘에 감염된 세포에게 3 번 씻으십시오. 200 NG / ML cyclohexamide 25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신과 DMEM/10 % FBS 6 ML을 추가하고, 5 % CO 품어 <suB&gt; 2, 48-72 시간 동안 37 ° C. 흠 돌연변이 유발 후 36 시간에 대한 박테리아의 결여가 나타납니다. 나머지는 비어있는 동안 72 시간에 함유의 약 10 %는 박테리아로 가득 차 있습니다. </li><li> 저장성 용해에 의해 사채를 추출 완전히 매체를 대기음. 10 분 동안 세포를 이동시키다하는 1.0 ML H 2 O와 바위를 추가합니다. 적어도 10 번과 위아래로 pipetting하여 세포를 용해. 의 microfuge에서 해물과 1X 최종 농도를 가져다 0.250 ML 배 자당 인산 글루 탐 산염 버퍼 (SPG)를 추가를 수집합니다. -80에서 보관 ° C. 참고 : 돌연변이 유발의 수준이 리팜핀 내성의 유도에 의해 평가 될 수있다. 리팜핀 내성 시험 주파수를, 패 1 × 10 8 7 X 200 NG / 리팜핀의 ML의 면전에서 박테리아의 10 배 연속 희석. 리팜핀 내성의 빈도는 도금 된 박테리아의 총 개수로 나눈 리팜핀 내성 패의 숫자로 정의됩니다. 플라크 지침은 아래 섹션을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 패 정화하여 클라미디아의 trachomatis 돌연변이 균주의 클론 분리 <ol><li> 6 잘 접시의 베로 세포의 합류 단층을 설정 종자 ~ 0.4도 당 3 ML DMEM/10 % FBS에서 x 10 6 세포. 세포는 다음 24 시간 동안 균일 한 단일 층을 형성 할 수 있습니다. </li><li> 얼음에 mutagenized 클라미디아의 원액을 녹여. DMEM/10 % FBS에 희석 당 200 μL의 총 볼륨 6 X 10 배 연속 희석을 수행하고 얼음을 설정합니다. 참고 : 포함 형성 단위 세균 역가 (IFU)이 플라크 형성 단위의 좋은 추정치 (PFU)입니다. 패 10, 100 목표로 1000 PFU. </li><li> 물론 당 3 ML PBS로 두 번 베로 세포를 씻으십시오. </li><li> 6 - 잘 접시와 중복의 세균 희석 100 μl를 각 well에 3 ML DMEM을 추가합니다. 소용돌이도 혼합물을 보장하기 위해 판. </li><li> 15시 30 분 2,700 XG에 감염된 접시를 스핀 ° C 다음 가습에 37 ° C에서 알을 품다,1 ~ 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기. </li><li> 0.54 % DMEM의 아가로 오스 (6 우물) 준비 : <ol><li> 18.9 ML 추위 2X DMEM, 4.2 ML FBS, 0.42 ML 100 배 NEAA, 0.042 ML 200 ㎍ / ㎖ cyclohexamide, 0.021 ML 50mg/ml 겐타 마이신 : 다음 성분을 추가합니다. 잘 섞는다. </li><li> 수풀을 방지하기 위해 교반, 뜨거운 멸균 1.2 % 아가로 오스 / H 2 O의 18.9 ㎖를 혼합한다. 혼합물에 열이어야합니다. 감염된 세포에 추가하기 전에 55 ° C에서 따뜻한 물을 욕조에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 접시에서 세균 현탁액을 대기음 6 ML 0.54 % 아가로 오스 / DMEM을 당에도 적용됩니다. 아가로 오스 15 분 후드 외부 실온에서 완전히 응고 할 수 있습니다. 뚜껑은 15 분 동안 바이오 안전성 후드 제거와 접시를 건조. 참고 : 생물학적 밀폐 후드에서 진동 고형화 아가을 왜곡 할 수 있습니다. </li><li> 7 ~ 10 일 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. 플라크는 해부 현미경의 도움으로 볼 수 있어야합니다. (재플라크의 전형적인 이미지 그림 3 FER). </li><li> 사전 분리 돌연변이에 하루 씨앗 1 개 10 100 μL에 잘 당 96 - 웰 플레이트의 4 베로 세포. 세포는 24 시간 안에 합류 할 것입니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 표시 패를 선택할 수 있습니다. 멸균 1.0 ML 장벽 피펫 팁을 사용하여 패의 플러그를 수집합니다. </li><li> DMEM 100 μL의를 Resuspend 패 10 % FBS, 400 NG / ML cyclohexamide, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 보충. </li><li> 돌연변이 균주를 확장하려면, 베로 세포의 합류 단층에 현탁액을 오버레이. 30 분 2,700 XG, 15 ° C에서 접시를 회전. </li><li> 가습 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 48 HPI 빠르면 14 일로 늦게 발생할 수있는 세포의&gt; 50 % 감염되어 수확 사채. 감염된 세포의이 금액은 충분히 가능한 박테리아가 저장 될 수 있습니다. 돌연변이 균주의 성장 속도와 감염에 차이가 있습니다. 타고난로 성장하는 균주를 느리게 할 수충분한 세포가 감염 될 때까지 에서야 이웃 세포를 다시 감염. </li><li> 감염된 세포의 삼투압 용해에 의해 사채의 압축을 풉니 다 : <ol><li> 완전히 매체를 대기음. </li><li> 멸균 물 160 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 완전한 용해를 보장하기 위해 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 세포를 중단, 교차 오염을 방지하기 위해 장벽 팁을 사용합니다. </li><li> 의 microfuge 튜브에 해물 160 μl를 전송합니다. </li><li> 배 SPG의 40 μL에 섞는다. -80에서 보관 ° C. </li></ol></li><li> 그 표현형 (들)에 대한 분석 및 화면 돌연변이. </li></ol> 3. 선택한 클라미디아 돌연변이의 전체 게놈 시퀀싱 <ol><li> 호스트 DNA 오염의 대부분 무료입니다 그라디언트 정제 사채에서 게놈 DNA를 추출합니다. 사채의 클라미디아와 정화의 대규모 문화 프로토콜은 심판에서 찾을 수 있습니다. (17). 내선 번호에 상용 게놈 DNA 정제 키트 (예 : Qiagen의 고양이. 69504)를 사용하여제조업체의 지침에 따라 2 × 10 9 박테리아에서 DNA를 ract. </li><li> 정확하게 DNA의 양을 측정하는 형광을 (큐 비트, Invitrogen의 고양이. Q32866)를 사용합니다. 정제 된 DNA를 1-5 μg은 Illumina의 시퀀싱 플랫폼이 필요합니다. 참고 : 여러 플랫폼을 Illumina/Solexa- 고체 기반의 시스템을 포함한 일련의 세균 게놈에 사용할 수 있습니다. 우리는 짧은 고밀도 생산으로 HiSeq (Illumina의)를 사용하기로 결정했습니다, 그러나 고품질 시퀀싱을 읽습니다. 같은 IonTorrent (생명 기술)와 MySeq (Illumina의)와 같은 작은 규모의 게놈 시퀀서도 적합하며, 적절한 유전체 어셈블리 25X의 최소 범위를 초과하는 시간에 4 클라미디아 게놈까지 이러한 quencing 다중화를위한 충분한보다. 일루미나 플랫폼의 DNA 시퀀싱 라이브러리의 준비 아래에 설명되어 있습니다. </li><li> 에 S220 적응 집중 음향을 사용하여 적절한 크기로 조각 DNA (Illumina의 시퀀싱 300-400 기본 쌍)제조업체의 권장 설정에 따라 (Covaris) strument. 참고 : 샘플 aerosolization에 의한 시료의 큰 손실 분무 결과로 DNA 파편. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, 상업 건설 장비 (Illumina의 FC-102-1001)을 사용하여 게놈 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다. 라이브러리는 여러 샘플을 풀링 동시에 염기 서열 될 수있는 바코드 프라이머 (Illumina의 FC-121-1003)를 사용하여 인덱싱 할 수 있습니다. </li><li> 샘플 시퀀싱 실행합니다. 이 단계는 일반적으로 상용 서비스 또는 전용 기술 직원에 의해 운영 핵심 시설에 의해 수행됩니다. 그 절차와 권장 사항을 따르십시오. </li><li> Illumina의 읽기는 (FASTQ 형식)는 SNP / 돌연변이 식별에 이용 될 수있는, 그러한 (Biomatters) Geneious으로, 사용자 친화적 인 그래픽 사용자 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 참조 게놈에 조립 될 수있다. 지도 돌연변이에 최소 변형 주파수 및 최소 범위에 대한 50X를 90 %로 매개 변수를 설정합니다. 오픈 원료에서같은 MAQ (18)와 BWA (19)와 같은 전자 게놈 어셈블러는,도 사용할 수 있습니다. </li><li> 생어 시퀀싱으로 돌연변이를 확인 : 생어 시퀀싱으로 정제 또는 (1시 20분) PCR 제품을 희석하여 확인 된 돌연변이 순서를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 게놈 DNA를 사용합니다. </li></ol> 4. 클라미디아 재조합의 생성 참고 : 클라미디아 감염 중 DNA를 교환 할 수있는 재조합 균주의 생성 (12, 13, 20) 할 수 있습니다. 이후 두 개의 고유 한 항생제 내성 재조합 &quot;자손&quot;로 세포의 공동 감염 (12, 13) 이중 항생제 내성 선택할 수 있습니다. 우리는 돌연변이를 분리하고 공동 isogenic 변종을 생성하는이 현상을 이용했다. 따라서 돌연변이 균주 (CTL0567 (rpoB) 예를 들면 리팜핀 내성 (RIF R) H471Y) 항생제 내성 백그라운드에서 생성 된 그들은 야생형 균주 bearin에 교차 될 수있는조지아 다른 항생제 내성 대립 유전자 (예를 들어, 스펙 티노 마이신 저항 SPC (R), r01/r02에 G1197A (16SRNA 1, 2 부)). 클라미디아의 DNA 교환 및 재조합에 대한 자세한 내용은 참조 (12, 13)를 참조하십시오. <ol><li> 24 잘 접시에 성장 베로 세포의 합류 단층 위에 각 변형에서 centrifuging6 × 10 5 박테리아에 의해 야생 유형 및 클론 돌연변이 균주를 공동 감염. 병렬로 혼자 각 변형에 단일 층을 감염. </li><li> 44시 HPI, 감염된 세포의 삼투압 용해하여 수확 사채 : <ol><li> 완전히 매체를 대기음. </li><li> 멸균 0.4 ML을 추가하고 10 분 동안 서 보자. </li><li> 활발한 적어도 10 번 상하 pipetting하여 세포를 용해. 전송의 microfuge 튜브에 해물. </li><li> 1X 배속 SPG의 최종 농도 5 배 SPG 0.1 ㎖를 혼합한다. </li><li> 원유 해물 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 원유 EB의 플라크 50 μL은을 준비합니다D 5 아가 / DMEM에서 x 1시 10분 시리얼 희석은 재조합을 위해 선택할 수있는 적절한 항생제로 보충. (재조합의 선택에 대한 일반적인 항생제의 농도에 대한 표를 참조하십시오.) </li><li> 플라크 정화 상기 재조합 균주를 풍부. 원하는 표현형의 존재 또는 부재에 대한 점수 재조합. 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자형의 목적을 위해 DNAzol 치료 (다음 섹션 참조)에 의해 재조합 균주에서 DNA를 추출합니다. </li><li> 십자가는 더욱 돌연변이를 분리하고, isogenic 변종을 생성하는 다른 항생제 내성 마커가 부착 된 균주 반복 ​​할 수 있습니다. 다른 항생제 마커가 부착 된 다른 야생형 균주에 선택한 재조합을 공동 감염. </li></ol> 표 1 : 재조합의 선택을위한 항생제 농도 : <table border="1"><tbody><tr><th> 최종 농도 </th><th> 준비 지침 </th></tr><tr><td> 200 NG / ML 리팜핀 </td&gt; <td> 25 ㎎ / 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 ML 저장 재고를 확인합니다. H 2 O와 스토리지 주식을 희석하여 200 ㎍ / ㎖ 작업 솔루션을 만들 어둠 속에서 -20 ° C에서 보관. </td></tr><tr><td> 200 ㎍ / ㎖의 메소 </td><td> DMSO에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 200 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신 </td><td> 100 μL 분주 물에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C.에 저장 반복되는 동결 융해를 피할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table> 5. 유전자형에 대한 재조합 균주의 게놈 DNA의 추출 참고 : 열 기반의 정화 키트도 사용할 수 있습니다. DNAzol 처리에 의한 DNA 추출의 장점은 비용입니다. <ol><li> 12 잘 접시에 성장 베로 세포의 단일 층에 1.2 × 10 5 chlamydiae를 감염. </li><li> 36-48 HPI에서 매체를 대기음 DNAzol (Invitrogen 사 10503-027)의 0.375 ML을 추가합니다. 부드럽게 세포와 피펫 리사를 교반1.5 ML의의 microfuge 튜브에 TES. </li><li> 100 % 에탄올 0.188 mL를 첨가하여 침전 DNA. 반전으로 섞는다. </li><li> 피펫 팁과 스풀링하여 DNA를 추출하고 깨끗한 튜브에 넣습니다. 또한, 펠릿 2 실온에서 분, 4 ° C, 그리고 가만히 따르다 뜨는을위한 최고 속도로 원심 분리하여 DNA. </li><li> 세척 DNA는 75 % 에탄올 1.0 ML로 두 번 침전. </li><li> 15 초 동안 에탄올을 제거한 후 공기 건조 DNA. </li><li> 0.2 ML 8 개 MM NaOH를 다음 0.1 M의 HEPES의 20.2 μL로 pH를 8.0으로 중화와 DNA를 용해. 물이나 TE로 0.5 ML의 최종 볼륨에 불러옵니다. 또는, TE 버퍼를 Resuspend의 DNA가 (DNA 침전물이 완전히 용해되지 않습니다.). </li><li> 확인 된 돌연변이를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 DNAzol - 추출 된 DNA를 사용합니다. 순서는 정제 또는 생어 시퀀싱에 의해 (1시 20분) PCR 제품을 희석. </li></ol>

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</ol>

공개 할 아무것도 없다.

이 유전자형과 표현형 사이의 연계를 설정으로이 방법은 유전자 분석을위한 기본 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은,이 재조합 DNA의 변화와 종종 비 모델 미생물의 유전자 기능의 분석 속도 제한 단계는 박테리아 유전자의 insertional 비활성화에 대한 기존의 분자 도구의 도움없이 달성된다. 하나의 중요한 단계는 패 정제 된 돌연변이 체의 클론을 보장하는 것입니다. 야생 유형 또는 &quot;벤치&quot;돌연변이와 교차 오염을 신속 얻은 결과되는 돌연변이 균주로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 비 클론 샘플의 전체 게놈 시퀀싱에 의해 매핑 돌연변이는 모호한 결과를 초래할 수 있습니다. 많이 plaqued 우물에서 돌연변이를 분리하거나 서로 너무 가까이에 플라크를 연결은 피해야한다. 또한, 느린 성장 돌연변이를 들어, revertants는 상대적으로 높은 주파수에서 나올 수 있습니다. 우리는 원본 또는 낮은 통로 주식을 보존 좋습니다. REPL교차 오염 또는 revert...

관련과 미국에서 연간 약 280 만 생식기 감염 (질병 통제 센터) 후유증과 같은 골반 염증성 질환, 자궁외 임신, 불임 (1)에 대한 의무 세포 내 세균 클라미디아의 trachomatis 계정. 클라미디아 균은 고유 한이 전염성하지만 비 복제 초등학교 바디 (EB) 및 비 감염성하지만, 증식하는 그물 몸 (RB) : 두 가지 형태로 구성된 이상성 개발주기 생리학. 감염 endoctyotosis (2) 다음 상피 세포에 사채의 첨부 파일이 시작됩니다. 막 바인딩 공포는 포함을라고 이내에 교환 사채는 이진 핵분열에 의해 복제 RB 형태로 분화. 중반 사이클에서, RBS 전환 당시 감염의 새로운 라운드를 시작하기 위해 세포 공간으로 추방 사채,에 때 숙주 세포 lyses (3). C. trachomatis에 있습니다이러한 세균 유전학 대부분의 연구 중심되었습니다 타겟 유전자 교체, 트랜스포존과 transducing에 파지, 표준 분자 유전 학적 도구와 일상적인 조작에 내화물, 그것은 개인의 클라미디아 유전자가 타고난 면역 회피에 기여하는 정도 불분명하다 , 영양소 수집, 개발 전환, 또는 진핵 호스트 (4) 내 병원체의 생존에 중요한 다른 프로세스. 따라서이 병원체는 임상 적 중요성에도 불구하고 저조한 특징 남아있다. 클라미디아 균의 게놈. 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 염기 서열 여러 종 biovars와 (5) (~ 1MB의) 상대적으로 작은 수 있습니다. WGS하여 비교 게놈 분석은 독성 요인의 잠재적 기능 (9, 10)에 관해서 몇 가지 정보를 제공하고 있습니다 클라미디아 종과 인간 (6-8)에 어느 정도에 그들의 적응의 진화에 독특한 통찰력을 제공하고 있습니다. 티임상 분리하여 표시 그는 유전 적 다양성은 유전자의 돌연변이가 쉽게에 대한 선택했을 아마도 때문에, 체계적으로 대부분의 독성 요소의 기능을 매핑하는 데 필요한 해상도를 제공하지 않습니다. 독성의 측정 결함, 조사 할 수있는 돌연변이의 스펙트럼을 확장 할 수있는 정의 된 분석과 함께 자연 선택, 돌연변이 유발 유전자 변이의 혼란 함을 주죠 효과없이. 화학 돌연변이는 특히 그들이 널, 조건, hypomorphic (감소 함수)를 생성 할 수 있습니다으로 유용하고, hypermorphic (함수의 이득) 대립 유전자이다. 강력한 차세대 게놈 시퀀싱 기술의 도착과 함께, 이러한 돌연변이 쉽게 식별 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 강한 협회는 앞으로 유전자 접근 방식의 적용을 가능하게하는 유전자 또는 유전 경로의 변이와 일반적인 표현형 사이에 만들 수 있습니다. 임상 균주의 게놈 시퀀스 모자이 B 밝혀etween의 혈청 형과 자주 재조합 (11)의 궤적. 재조합 경험적 증거는 두 계통에서 유전 적 기여 (12, 13)을 가지고 계시 이중 저항 재조합 자손의 두 가지 항생제 내성과 선택의 공동 감염을 통해 증명되었다. 따라서, 공동 감염 설정 야생형과 돌연변이 균주 간의 유전 적 교환은 화학적으로 유도 된 돌연변이의 분리가 관찰 된 표현형에 이르게 영향을받는 유전자를 찾아 낼 수 있습니다. 여기에서 우리는 화학 돌연변이, WGS, 감염된 세포 내에서 DNA 교환 (14) (그림 1)에 대한 시스템을 기반으로 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>에틸 메탄 설포 네이트 (EMS) </td><td>Sigma</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexamide</td><td>Sigma</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin </td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.493mM MgCl2 및 0.901mM CaCl2></sub(PBS+MgCl2/CaCl2)를 사용한</td> <td>Life Technologies</td><td>14190-133</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x SPG 완충액(1.25 M 자당, 50mM 인산나트륨, 25mM 글루탐산)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG 완충액(0.25M 자당, 10mM 인산나트륨, 5mM 글루탐산)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물(멸균, 조직 배양 등급)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x DMEM(분말로 준비, 7.4g/L 중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)으로 </td> 완충) <td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1.2% GTG 아가로스, 오토클레이브</td><td>Lonzo</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Life Technologies</td><td>10503-027</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(분자생물학 등급)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8mM NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1M HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1- piperazineethanesulfonic acid) 완충</td><td></td><td></td><td></td>액</tr><tr><td>25cm2 조직 배양 플라스크 (T25 플라스크)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-웰 조직 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 조직 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학적 안전 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학 안전 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>>조직 플레이트</td><td></td><td></td><td></td> 회전용 원심분리기 및 어댑터</tr><tr><td>>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광계(Qubit)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>적응형 집속 음향 S220 기기</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

클라미디아의 trachomatis, 성병 및 안구 감염의 병인 에이전트, 재조합 DNA와 가난 때문에 실험 변환에 해당 다루기 힘듦을 특징으로 남아있다. 우리는 C에서 유전자 분석을 수행 할 수있는 방법을 개발 분자 유전 학적 도구의 부족에도 불구의 trachomatis. 우리의 방법이 포함됩니다 : I)를 빠르게 별개의 표현형과 유전 정의 된 돌연변이의 포괄적 인 라이브러리를 생성하는 화학 돌연변이, ii)에서 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)가 기본 유전 병변을지도하고 변이 유전자 (들) 사이의 연결을 발견하고.. 일반적인 표현형;. 돌연변이 야생형 박테리아와 포유 동물 세포의 공동 감염을 통해 재조합 균주의 III는) 생성. 따라서, 우리는 유전자형과 표현형 사이의 인과 관계를 확립 할 수 있었다. 화학적으로 유도 된 유전자 변이와 WGS의 결합은 상호 유전자형 - 표현형 협회에게 우리말을 설정하려면LD는 유전자 분석에 현재 어려운 의학 및 환경 중요한 미생물의 큰 목록에 광범위하게 적용합니다.

돌연변이에 노출 세균 세포의 죽음으로 인해 아마도, 세균없는 표시 함유로 연결됩니다. 일반적으로 혈청 형 LGV-L2 완전히 48 시간 게시물 감염에서 감염 세포를 용해되지만, 돌연변이와 치료&gt; 90 시간이 사이클을 확장 할 수 있습니다. 흠의 약 10 %를 회복 할 것으로 예상된다. 우리의 실험에서, 감염 베로 세포 치료 컨트롤에 비해 전염성 자손의 회복에 99 % 감소했다 20 MG / ML EMS로 처리. 돌연변이 처리는 작은 플라크 (SPQ) (그림 3)를 포함 변경된 형태학과 plaques의 출현했다. 다른 형태학은 세분화 clumpy, 또는 (그림 3) 모양의 벌집 표시 패 (가) 있습니다. 이러한 표현형은 호스트 환경에서 감염과 생존을 위해 필요한 과정에 결함이 반영 될 수 있습니다. 작은 플라크 (SPQ)의 돌연변이 형태 일반적으로 훨씬 적은 전염성 자손을 생산하고 2 ~ 3 주 소요될 수 있습니다mplify. reversions과 억제 돌연변이 ...

우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

본 절차의 전반적인 목표는 화학적 돌연변이 유발을 수행하고 유전자형-표형 연관성을 결정함으로써 chlamydia tritus에 대한 유전적 분석을 실시하는 것입니다. 이는 먼저 화학적 돌연변이 유발을 통해 chlamydia tracom 돌연변이 균주를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 전장 유전체 시퀀싱과 이어서 레퍼런스 기반 유전체 조립을 통해 화학적으로 생성된 모든 돌연변이를 식별합니다.그런 다음 돌연변이 균주에서 표현형-유전자형 연관성을 확인합니다. 마지막으로, 재조합 균주를 생성하고 분석하여 표현형-유전자형 연관성을 검증합니다. 궁극적으로 고전적인 화학적 돌연변이 유발법과 차세대 염기서열 분석법(NGS)의 조합을 통해 특정 클라미디아 유전자의 돌연변이가 관심 표현형을 유발한다는 결과를 얻을 수 있습니다.현재 클라미디아(chlamydia)의 유전자 교체를 위한 방법은 없으며, 이를 연구하기 위한 분자 유전학적 도구들은 아직 초기 단계에 머물러 있습니다. 본 방법은 재조합 DNA를 이용한 형질전환이나 분자 유전학적 도구의 개발을 필요로 하지 않으면서도, 개별 유전자 산물에 기능을 부여한다는 동일한 목적을 달성할 수 있습니다.배양 세포를 준비하려면, 10% FBS가 보충된 3 mL의 DMEM에서 25 cm²당 약 1 × 10⁶ 개의 vir 세포를 분주하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 약 24시간 후 세포가 완전히 밀집(confluency)되면, 배지를 흡입하여 제거하고 감염 다중도(MOI) 5로 클라미디아를 감염시킵니다. 이때 200 ng/mL의 cycloheximide가 포함된 총 3 mL의 DMEM-FBS를 사용합니다. 감염 18시간 후 돌연변이 유발을 시작하기 위해, 화학 흄 후드 내에서 CaCl₂와 MgCl₂가 포함된 PBS를 사용하여 20 mg/mL의 ethyl methane sulfonate(EMS)를 준비합니다.EMS는 강력한 돌연변이원 및 발암물질입니다. 따라서 폐기 방법은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. Vero 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고, 염화 마그네슘과 염화 칼슘이 포함된 PBS 3 mL로 세포를 한 번 세척합니다.그 다음 3 mL의 EMS 용액을 가하고 흄 후드 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, EMS를 제거하고 1 M 수산화나트륨 용액이 담긴 용기에 넣어 돌연변이 유발 물질을 불활성화시킨 다음, 잔류 EMS를 제거하기 위해 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 200 ng/mL의 cyclo heximide와 25 µg/mL의 Gentamycin이 포함된 DMEM 10% FBS 6 mL를 가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48~72시간 동안 배양합니다.돌연변이 유발 36시간 후, 72시간 시점에서 봉입체 내에 박테리아가 없는 것으로 보입니다. 봉입체의 약 10%는 박테리아로 채워져 있으며, 나머지는 비어 있습니다. 저장성 용해를 통해 기본체(elementary bodies) 또는 EB를 추출하려면 배지를 완전히 흡입하여 제거하십시오. 물 1 mL를 첨가하고 10분 동안 흔들어 세포를 탈락시킨 후, 피펫팅을 최소 10회 이상 반복하여 세포를 용해하십시오.마이크로 원심분리 튜브에 용해물을 수집한 후, 5x sucrose, phosphate glutamate buffer(SPG) 0.25 mL를 첨가하여 최종 농도를 1x로 맞추고 -80 °C에서 보관합니다. 6-well 플레이트의 웰당 3 mL DMEM 10% FBS에 약 0.4 × 10⁶개의 VES 세포를 분주하여 세포 단일층을 형성시키고, 이후 24시간 동안 균일한 단일층이 형성되도록 둡니다. 다음으로, 클라미디아(chlamydia) 돌연변이체 스톡 용액을 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 DMEM 10% FBS를 사용하여 희석당 총 부피 200 µL로 10배 연속 희석액 6개 튜브를 준비하고 얼음에 보관합니다. 웰당 3 mL의 PBS를 사용하여 Vero 세포를 두 번 세척합니다. 그 후 6-웰 플레이트의 각 웰에 3 mL의 DMEM을 추가하고, 박테리아 희석액 100 µL를 두 번씩 분주합니다.플레이트를 회전시켜 균일하게 혼합합니다. 감염된 플레이트를 15 °C에서 2,700 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그 후 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다.그동안 다음 성분들을 먼저 결합하고 혼합하여 DMEM 내 0.54% AROS를 준비합니다. 그런 다음 덩어리가 생기지 않도록 저어주면서, 멸균된 뜨거운 1.2% AROS 수용액 18.9 milliliters를 혼합합니다. 혼합물을 55 degrees Celsius 항온수조에서 따뜻하게 유지합니다.디쉬에서 박테리아 현탁액을 흡입하여 제거하고, 따뜻한 aro 용액 6 mL를 첨가합니다. 후드 밖의 상온에서 완전히 응고될 때까지 둡니다. 그런 다음 바이오안전 작업대 내에서 뚜껑을 열어 플레이트를 15분 동안 더 건조시킵니다. 플레이트가 건조되면 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 7~10일 동안 배양합니다.돌연변이체를 분리하기 하루 전, 해부 현미경을 통해 플라크가 보여야 합니다. 웰당 100 µL에 1×10⁴ 개의 세포를 접종하십시오. 96-웰 플레이트의 경우, 세포는 24시간 이내에 컨플루언트(confluent) 상태가 됩니다.해부 현미경 하에서 피킹할 플라크를 표시한 다음, 멸균된 1 mL 배리어 피펫을 사용하여 플라크 플러그를 수집합니다. 10% FBS, 400 ng/mL cycloheximide, 그리고 50 µg/mL Gentamicin이 첨가된 100 µL의 DMEM에 플라크를 재현탁하여 변이 균주를 증식시키며, 해당 현탁액을 Vero 세포의 confluent 단층 위에 오버레이합니다.감염된 세포가 50% 이상일 때 수확하되, 이는 감염 후 빠르면 48시간에서 늦게는 14일까지 소요될 수 있습니다. 수확 전 플레이트를 2,700 GS, 15 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 이 정도 양의 감염된 세포가 있어야 감염된 세포의 저장성 용해를 통해 EV를 추출하기에 충분한 생존 박테리아를 확보할 수 있습니다. 배지를 흡입하여 제거한 후 160 µL의 멸균수를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다.배리어 팁을 사용하여 피펫팅을 여러 번 반복함으로써 세포를 파쇄하고 완전한 용해를 유도합니다. 마지막으로, 각 용해물 160 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여기에 5X SPG 40 µL를 첨가하고, 분석 및 관심 표현형에 대한 돌연변이 스크리닝 전까지 -80 °C에서 보관합니다.돌연변이 유발 물질에 노출되면 박테리아 세포 사멸로 인해 박테리아가 없는 것처럼 보이는 봉입체가 나타납니다. 일반적으로 serovar LGVL 2는 감염 후 48시간 이내에 감염된 세포를 완전히 용해시키지만, 돌연변이 유발 물질로 처리하면 이 주기가 90시간 이상으로 연장될 수 있으며, 본 실험에서는 봉입체의 약 10%가 회복될 것으로 예상됩니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 20 mg/mL의 EMS로 처리한 감염된 Vero 세포는 처리하지 않은 대조군에 비해 감염성 자손의 회복률이 99% 감소했습니다.돌연변이원 처리로 인해 작은 플라크를 포함하여 형태가 변형된 플라크들이 나타났습니다. 다른 형태로는 여기에서 보여지는 것과 같이 과립형, 덩어리형 또는 벌집 모양의 플라크들이 있습니다. 이러한 연구들에 사용된 EMS 용량은 NGS로 실험적으로 평가했을 때 KCL 게놈당 3개에서 30개 사이의 돌연변이를 유발할 수 있습니다.구배 정제된 EBS는 대부분 숙주 세포 물질이 제거되어 있으나, 이 절차를 거친 후의 게놈 분석물에서도 숙주 DNA가 검출되며 이는 약 10~15%를 차지합니다. 조직 배양 세포에서의 복제 장애, 생화학적 활성 상실 또는 박테리아 형태 변화와 같은 표현형 스크리닝을 통해, 클라미디아의 병원성 인자 형성 및 유지에 어떤 박테리아 인자가 필요한지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

조사를위한 인적 나팔관 모델<em&gt; C. trachomatis</em&gt; 감염

클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

이 프로토콜은 클라미디아 트라코마티스의발달 돌연변이를 식별하고 격리하기 위해 방향유전 적 접근법에서 형광 프로모터 기자, 살아있는 세포 현미경 검사법 및 개별 포괄 추출을 활용합니다.

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

여기에서는 표적 농축을 사용하여 임상 샘플에서 박테리아 성병 감염의 전체 게놈 시퀀싱을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 증후군 패널 기반 방법은 풍부한 인간 DNA와 낮은 박테리아 부하의 문제를 극복하여 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 팔리듐 트레포네마 및 마이코플라스마 제니탈리움에 대한 게놈 감시를 용이하게 합니다.

표적 농축 워크플로우를 사용하여 임상 샘플에서 전체 박테리아 게놈 생성

앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한...

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

여기에서 우리는 유형 I 및 유형 II를 사용하는...

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

Amoebal 공 배양 선택적 같은 아메바 및 대 식세포와 같은 식세포에 저항 할 수 세포 내 병원체를 성장 자기편 아메바를 사용하여 세포 배양 시스템이다. 그것은 따라서 새로운 감염원을 발견 할 수있는 중요한 도구를 나타냅니다. Amoebal 농축 새로운 amoebal 종과 특정 세포 내 박테리아의 발견을 할 수 있습니다.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Forward genetics는 세포 내 병원체에서 세포 자율 면역에 대한 저항에 중요한 유전자를 식별하는 강력한 접근 방식입니다. 현재 접근 방식은 선천성 면역 세포, 특히 대식세포를 사용하여 면역 회피에 중요한 새로운 Toxoplasma gondii 유전자를 식별합니다.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

학습하세요 Chlamydia trachomatis의 화학적 돌연변이 유도 및 전게놈 시퀀싱을 활용한 유전자형-표현형 연관 분석 방법입니다. 이 기술은 미생물 유전학 연구에 활용됩니다.

앞으로 유전 접근

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