모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 약물 전달 시스템 또는 치료제의 수송 능력을 평가하는 것입니다. 이는 경구 약물 전달과 관련된 위장관 상피 모델과 같은 세포 장벽을 통해 이동하는 과정을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Transwell 인서트에서 Caco-2 세포를 배양하여 세포 분화와 세포 단일층 형성을 유도합니다.

두 번째 단계는 경상피 전기 저항(trans epithelial electrical resistance) 측정, 세포 접합부의 면역 염색, 그리고 검출 가능한 추적 분자의 수동 투과성 평가를 통해 이 모델이 투과 장벽을 나타내는지 검증하는 것입니다. 다음 단계는 약물 전달 시스템을 준비하는 것으로, 본 예시에서는 표적형 폴리머 나노 운반체가 사용되었습니다. 운반체에는 약물 화물이 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있으며, 비표적형 운반체 또는 유리 약물과 같은 대조군이 반드시 포함되어야 합니다.

이들 요소는 검출이 가능하도록 방사성 동위원소로 표지됩니다. 그 후 배양 후, 캐리어를 세포 단층 위의 apical chamber에 첨가합니다. 다양한 시간대별로 apical chamber, basolateral chamber 및 세포 단층에서 캐리어를 수집하여 표지된 성분의 잠재적 분해 여부를 테스트합니다.

수송 메커니즘을 조사하기 위해 마지막으로 세포 단층을 가로지르는 나노운반체의 수송량을 계산합니다. 세포 간 transcytosis의 약리학적 억제제 또는 세포 간 paracellular 수송 리포터가 존재하는 환경에서 유사한 실험을 수행해야 합니다. 본 연구에서 설명하는 기술은 신체 내 세포 장벽을 나타내는 배양된 세포 단층에서 약물 및 약물 나노운반체의 수송 속도와 메커니즘을 평가하는 데 사용되는 잘 확립된 방법들을 응용한 것입니다.

여기서 중점적으로 다룬 예시는 표적 고분자 나노입자의 위장관 상피 모델 통과 수송을 검증하는 것이었지만, 유사한 방법을 적용하여 이와 같거나 또는 혈류와 조직 및 장기 사이의 장벽을 형성하는 내피세포와 같은 다른 세포 단층을 통한 다양한 약물 전달 시스템의 통과 여부를 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 경우가 이에 해당합니다. 일반적으로 이 방법에 처음 입문하는 사용자는 특히 적은 양이 세포를 통해 수송되는 경우, 약물 전달 시스템을 적절히 추적하기 위한 라벨을 선택하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 측면에서, 본 연구에서는 약물 전달 시스템을 표지하기 위해 방사성 동위원소를 사용할 것이며, 또 다른 주요 고려 사항은 모델 세포 장벽의 무결성을 검증하고 실험을 통해 이를 확인하기 위한 적절한 대조군을 사용하는 것입니다. 이 과정은 멸균된 생물안전 2등급(BSL-2) 세포 배양 후드 내에서 수행되며, 후드에 들어가는 모든 재료는 에탄올로 멸균해야 합니다. 통계적으로 유의미한 결과를 얻기 위해 핀셋을 사용하여 0.8 µm 기공의 polyethylene terephthalate(PET) transwell insert를 24 웰 플레이트에 배치합니다.

각 실험 조건은 최소 4회 반복이 필요합니다. 이전에 준비한 세포 배지에 인간 상피 결장직장 선암 또는 caco two 세포를 희석합니다. 200에서 400 µL의 세포 용액을 트랜스웰의 상부 또는 apical 챔버에 넣습니다.

1.5 × 10⁵ cells/cm²의 밀도로 세포를 분주합니다. 하단 또는 기저측 챔버에 700 내지 900 µL의 세포 배지를 채우고, 37 °C, 5% CO₂ 및 95% 습도 조건에서 16 내지 21일 동안 배양하며 3~4일마다 상단 및 하단 챔버의 배지를 교체합니다.

세포 단층 위의 압력을 유지하기 위해 다음 순서로 배지를 교체하십시오. 먼저 하단 챔버의 배지를 흡입하고, 이어서 상단 챔버의 배지를 흡입합니다. 상단 챔버에는 200 to 400 µL의 신선한 배지를 채우고, 하단 챔버에는 700 to 900 µL의 신선한 배지를 채워 TEER로 상피 투과성 장벽을 검증합니다. 전압계를 저항 설정으로 맞춘 후, 트랜스웰 인서트가 들어 있는 웰에 전극을 수직으로 배치합니다.

짧은 전극은 상부 챔버에, 긴 전극은 하부 챔버의 웰 바닥에 닿도록 배치해야 합니다. 전압계의 수치가 안정되면 각각의 저항값을 옴(ohms) 단위로 기록합니다. 투과성 장벽의 형성을 나타내는 TER 수치가 최대치에 도달하여 고점을 유지할 때까지 1~2일마다 측정을 반복하며, 이는 일반적으로 세포 플레이팅 시점부터 2~3주가 소요됩니다.

세포 단일층에 tight junction이 형성되었는지 먼저 확인하기 위해, 세포를 고정하고 양쪽 챔버의 배지를 흡입하여 제거한 후 따뜻한 DMEM으로 세포를 3회 세척하고 차가운 2% paraformaldehyde에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 paraformaldehyde를 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그다음, 각 챔버에 1 µg/mL의 anti-occludin을 첨가합니다.

장벽 형성의 음성 대조군으로 누출이 적은 웰을 사용합니다. 상온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 세포를 PBS로 다시 세척한 다음, 각 웰에 7.5 µg/mL 농도의 표지된 2차 항체를 첨가하고 암실 상태의 상온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 세포를 PBS로 세척하고 고정된 단일층이 부착된 필터 막을 조심스럽게 절제하여 슬라이드에 장착한 후, 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 이미징합니다.

이 절차는 이전에 발표된 프로토콜을 사용하여 표적 항체에 iodine 1 25를 표지하고, 표지된 항체의 비방사능을 µg당 분당 계수(counts per minute per microgram)로 계산하는 것으로 시작합니다. 본 예시에서 표적 항체는 특이성을 제어하기 위한 인간 세포간 접착 분자-1(intercellular adhesion molecule, one)에 대한 마우스 단일클론 항체 또는 anti ICAM one입니다. 치료 화물을 운반하는 비표적 코팅 나노 운반체를 준비하기 위해 iodine 1 25가 표지된 마우스 IgG가 사용됩니다.

화물은 또한 iodine 1 25로 표지됩니다. 본 예시에서 화물은 유전성 리소좀 축적 질환인 파브리병 치료에 사용되는 치료 효소인 alpha galacto SASE 또는 Alpha G입니다. 이 절차에서 가장 어려운 점 중 하나는 운송된 물질을 적절하게 검출하는 것을 보장하는 것입니다.

성공적인 결과를 보장하기 위해서는 나노운반체 구성 요소가 높은 비방사능의 충분한 양의 동위원소로 표지되어야 합니다. 다음 단계는 표지된 anti ICAM을 나노운반체의 표면에 결합하는 것입니다. 본 실험에서는 비특이적 대조군 모델로서 iodine 1 25로 표지된 anti ICAM과 직경 100 nanometer의 폴리스티렌 나노비드를 단순히 혼합합니다.

Iodine 1 25 표지 IgG를 사용하고, 화물의 운송을 추적하기 위해 anti ICAM과 iodine 1 25 표지 Alpha G의 조합을 사용합니다. 표면 흡착이 일어날 수 있도록 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 13,000 GS에서 3분간 원심분리하고, 흡입 피펫을 사용하여 상층액에 있는 코팅되지 않은 대응물들을 제거합니다. 코팅된 나노 운반체가 포함된 펠릿을 PBS 내 1% Bovine serum albumin에 현탁시킨 다음, 낮은 출력으로 초음파 처리하여 잠재적인 입자 응집체를 분해합니다. iodine 1 25 anti ICAM 나노 운반체를 고밀도의 confluent caco two 단층 세포 위의 상단 챔버에 첨가합니다. TEER을 측정한 후, 비특이적 및 치료적 대응물에 대해 동일한 절차를 반복합니다.

37 °C에서 원하는 시간 간격으로 하나 이상 배양합니다. 배양 후 다시 눈물을 측정합니다. 이 눈물 측정은 투과성 장벽에 대한 나노 운반체의 영향을 평가하기 위한 것입니다.

상부 및 하부 챔버에서 배지를 수집합니다. 상부 챔버는 37 °C의 DMEM 0.5 mL로 세척하고, 하부 챔버는 탈이온수 1 mL로 세척합니다. 세포 분획 측정을 위해 감마 카운터를 사용하여 총 방사성 동위원소 함량을 측정할 수 있도록 세척액을 수집합니다.

면도날을 사용하여 테두리를 따라 자른 후 투과성 필터를 절제합니다. 나노 운반체로부터 방출되었거나 잠재적 분해로 인해 방출된 iodine 1 25의 세포 관련 총 방사능을 측정하기 위해, 1% Triton X 100이 담긴 감마 카운터 튜브에서 10분 동안 배양하여 세포 내용을 방출시킵니다. 먼저 각 시료 300 µL를 PBS 내 3% BSA 700 µL 및 200 µL의 트리클로로아세트산(TCA)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

15분 동안 배양하는 동안, 감마 카운터로 시료의 총 방사능을 측정합니다. TCA 시료를 3000 GS에서 5분간 원심분리하여 온전한 단백질을 분해된 단백질 또는 iodine 1 25 분획으로부터 분리합니다. 유리 iodine 1 25 분획의 방사능을 정량하고, 이 값을 원심분리 전 측정된 총 방사능에서 뺍니다. 이를 통해 방사성 추적자가 단백질에서 분리된 분획 대비 표지된 단백질의 양을 구할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 transwell insert에 KCO two 단일층을 배양하여 albumin paracellular leakage culture를 이용한 세포 간 수송을 평가하기 위해, 상단 챔버의 세포 단일층 위 배지에 기저 누출 수준을 보여주는 음성 대조군으로서 iodine 1 25 표지 albumin만을 처리하거나 iodine를 처리합니다.

125 표지 알부민과 방사성 표지 되지 않은 항체를 준비합니다. 표적 나노 운반체를 nz.Transport 테스트 시 조사했던 것과 동일한 선택된 시간 간격 동안 37 °C에서 배양합니다. 배양 전, 배양 중, 그리고 배양 후에 앞서 설명한 방식대로 눈물을 측정합니다.

세포 간 접합부 개방의 양성 대조군으로 total iodine 1 25 및 free iodine 1 25를 측정하기 위해 배양 후 모든 분획을 수집합니다. transwell의 상단 및 하단 챔버에 5 mM 과산화수소가 포함된 세포 배지를 추가합니다. 이를 삽입하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

선택한 시간 간격마다 눈물(tear)을 측정하고 상부 챔버에 iodine 1 25 albumin을 첨가하십시오. 배양 과정 중 다양한 시점에서 눈물을 측정하여 과산화수소로 유도된 세포 접합부 개방으로 인한 눈물 값의 감소를 확인합니다. 병행 실험에서는 각 억제제를 처리하여 Caco two 단층 세포를 배양함으로써 iodine 1 25 표적 나노 운반체의 세포횡단 수송 또는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 평가하십시오.

클라트린 매개 세포내섭취(clathrin mediated endocytosis) 억제제인 50 µM MDC, 클라트린 매개 세포내섭취 억제제인 1 µg/mL filipin, 거대세포음작용(macropinocytosis)에 관여하는 Phosphatidylinositol 3-kinase 억제제인 0.5 µM WT manin, 그리고 20 µM EIPA.

마크로피노사이토시스(macropinocytosis) 및 클라트린 매개 엔도사이토시스(clathrin mediated endocytosis) 억제제를 사용하였으며, CACO-2 단층의 투과성에 미치는 억제제의 영향을 검증하기 위한 추가 대조군으로서 억제제 및 방사성 표지 물질과 세포를 함께 배양하기 전, 도중 그리고 후에 TEER을 측정하였습니다. 표적 나노 운반체의 상피세포 간 수송 모델로서, CACO-2 세포를 Transwell 인서트 상에 1.5 × 10⁵ cells/cm² 밀도로 배양하였으며, 단층의 무결성을 평가하기 위해 상피세포 간 전기 저항(TEER)을 측정하였습니다. 이 그래프에 나타난 바와 같이, 단층은 12일째에 합쳐졌으며(confluence) 18일까지 단층 무결성을 유지하였습니다. 이러한 결과는 14일째에 TEER 값이 380 Ω/cm²로 높았던 단층에서 occludin 양성 밀착 연접(tight junctions)이 관찰된 반면, TEER 값이 17 Ω/cm²로 낮았던 경우에는 밀착 연접 표지가 불충분했다는 점을 통해 추가로 검증되었습니다. 5일째에 CACO-2 세포 단층을 통한 anti-ICAM 나노 운반체의 수송을 평가하기 위해, Transwell 인서트에서 배양된 합쳐진 CACO-2 단층의 apical chamber에 iodine-125로 표지된 anti-ICAM 나노 운반체를 첨가하여 배양하였습니다.

기저측 챔버 내의 Iodine 125 함량을 표시된 시점에서 측정하여, 상단 패널에 나타난 바와 같이 세포당 운송된 나노 운반체의 양을 계산하였습니다. 하단 패널에서는 운송된 나노 운반체의 백분율을 기저측 분획에서 발견된 운반체의 양과 기저측 및 세포 분획의 합산량의 비율로 계산하였습니다. Iodine 125 anti-ICAM 나노 운반체에 대해 이 예시에서 추정한 이러한 파라미터들을 대조군인 Iodine 125 IgG 나노 운반체의 결과와 비교하여 표적화되지 않은 대조군 대비 운송 효율을 입증하였으며, 그 결과는 상단 패널에 제시되어 있습니다.

방사성 표지가 나노 운반체 화물에 통합되었을 때, 하단 패널에 표시된 바와 같이 iodine 1 25 anti ICAM 나노 운반체 또는 iodine 1 25 IgG 나노 운반체의 수송 속도를 반영하는 겉보기 투과 계수 또한 계산되었습니다. 설명된 매개변수들은 화물의 수송을 반영하며, 이 예시에서의 화물은 파브리병(Fabry Disease)으로 알려진 유전성 리소좀 축적 질환의 치료에 사용되는 alpha GA 효소입니다. apical, basolateral 및 세포 분획의 방사성 동위원소 함량을 3시간과 24시간에서 측정하였으며, 이를 이 표에 표시된 바와 같이 수송과 관련된 다양한 값으로 변환하였습니다.

화물을 추적하여 나노운반체 수송을 계산하는 방법 외에도, 이 치료 효소의 상피 세포 통과 전달량은 세포당 수송된 Alpha-gal의 분자 수 또는 picograms으로 환산하여 추정할 수 있습니다. Caco-2 단일층을 통한 anti-ICAM 나노운반체의 수송 기전 또한 조사되었습니다. 합류된 Caco-2 단일층을 통한 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노운반체의 세포 통과 수송(Transcellular Transport)은 다음 억제제인 EIPA, Filipin, MDC 또는 Wortmannin의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 평가되었습니다. EIPA는 거대음세포작용(macropinocytosis) 및 caveolae 매개 내포작용(caveolae mediated endocytosis)의 억제제입니다. Filipin, MDC 및 Wortmannin은 각각 clathrin 매개 내포작용(clathrin mediated endocytosis), clathrin 매개 내포작용 및 거대음세포작용의 억제제입니다.

이 그래프에 나타난 바와 같이, EIPA는 Caco-2 세포 단층을 가로지르는 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노 운반체의 수송을 감소시켰습니다. 반면 Filipin MDC와 Wortmannin은 대조군 조건과 비교하여 수송 수준을 감소시키지 않았습니다. 이는 anti-ICAM 나노 운반체가 세포 가로지르기 수송(transcellular transport)을 위해 caveolae 매개 내포 작용을 이용하며, clathrin 또는 거대음세포작용(macropinocytosis) 관련 세포횡단수송(transcytosis)은 이용하지 않음을 시사합니다.

Paracellular 수송을 평가하기 위해, Caco-2 층을 가로질러 이동하는 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노 캐리어의 수송 과정 동안 TEER을 측정하였습니다. 나노 캐리어가 없을 때의 두 단일층 TEER 값은 대조군으로 표시되었으며, 점선 구간은 평균의 SEM을 나타냅니다. 5 mM H₂O₂ 배양은 세포 간 결합의 개방에 대한 양성 대조군으로 사용되었으며, 이는 TEER 값의 기저 수준 감소로 확인되었습니다.

또한, 5 mM 과산화수소, IgG 나노 운반체 또는 anti-ICAM 나노 운반체의 존재 또는 부재 하에 세포 단층을 통과하는 iodine 1 25, albumin의 겉보기 투과 계수로 측정된 세포 간 단백질 누출을 측정하고 계산하였습니다. 이 그래프들에 나타난 바와 같이, 과산화수소는 기저측 챔버로의 iodine 1 25 및 albumin 누출을 현저히 증가시켜 양성 대조군 역할을 하였습니다. anti-ICAM 나노 운반체와 함께 배양했을 때, 운반되지 않는 대조군 IgG 나노 운반체와 마찬가지로 48시간 동안 iodine 1 25 및 albumin의 세포 간 누출에 변화가 없었습니다.

이러한 결과는 세포 간 수송(paracellular transport) 가능성을 배제하며, anti ICAM 나노 운반체가 세포횡단 수송(transcellular transport)을 위해 ICAM 매개 세포내섭취(endocytosis)를 이용한다는 이전 결과들과 일치합니다. 이 절차를 수행할 때는 Transwell 모델에 적합한 하나 이상의 세포 유형과 적절한 공극 크기, 재질 직경 등을 갖춘 투과성 필터를 선택하는 것이 중요하며, 본 절차 이후 약물 전달 시스템을 효과적으로 정량화하기 위한 라벨링 기술을 선택해야 합니다. 수송된 물질의 위치를 결정하고 수송된 물질의 상태를 추가로 확인하기 위해 형광 현미경이나 투과 전자 현미경과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.

Western blot은 단백질 분해를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. EISA는 운송체의 표적 능력을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 약물 화물의 활성은 분광 광도법 분석 또는 기타 적절한 기술을 사용하여 측정할 수 있습니다.