Name: 모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 57 s
Description: 학습하세요 약물 전달 시스템의 세포 장벽 투과 평가 방법을 Caco-2 세포와 transwell 모델을 사용하여. 이 기술은 경구 약물 전달 및 표적화된 폴리머 나노캐리어 효율성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) RG, 그리고 건강 (그랜트 R01 - HL98416)의 국립 연구소와 미국 심장 협회 (American Heart Association, 그랜트 09BGIA2450014)가 SM에게 수여 자금의 친교에 의해 지원되었다.

1. 없이 Transwell 삽입의 세포 단층 배양 <ol><li> 멸균, 바이오 안전성 레벨 2 세포 배양 후드에서 0.8 mm 애완 동물은 집게로 (통계적 의미에 대해, 상태 당 4 우물) 24 - 웰 플레이트에 삽입 트랜스 웰 기공 놓습니다. 후드를 입력 모든 자료는 에탄올로 소독해야한다. </li></ol> 참고 : 필터의 기공 크기가 사용되는 NC의 평균 크기에 맞는 선택해야, 멤브레인을 가로 질러 수송 가능하도록. 또한, 통계적으로 유의 한 결과를 각각의 실험 조건은 동일한 실험을 반복 내의 넷 (웰)의 최소 및 세 독립적 인 실험의 최소 필요하다. <ol start="2"><li> 수조에서 37 ° C로 세포 배양 4.5 g / L 글루코오스, 15 % 소 태아 혈청, 1 % 스트렙토 펜 보충 된 DMEM 배지를 함유하는 매체와 열을 준비한다. </li><li> 세포 매체와 장소에서 (된 Caco-2) 인간의 상피 세포 대장 선암을 희석/ cm 2 1.5 × 105 세포의 밀도로 트랜스 웰 인서트의 상부 (정점) 챔버 내로 세포 용액 200-400 μL. 세포 매체의 900 μL - 700 이하 (기저) 챔버를 입력합니다. </li><li> 단계 1.3에 표시된 양을 사용하여, 모든 3~4일 상부 및 하부 챔버에 매체를 교체 37 °의 C, 5 % CO 2 및 16-21일 95 % 습도에서 배양 세포. 하부 챔버로부터 배지를 흡인 상부 챔버로부터 매체를 대기음, 신선한 매체와 함께 상부 챔버를 채울 수 있고, 하부 챔버와 채우기 : 세포 단층 (오히려 아래보다) 위의 압력을 유지하기 위해 다음과 같은 순서로 배지를 교체 신선한 매체. </li></ol> 2. 단단한 접속점의 GI 상피 투수 Transepithelial 전기 저항을 사용하여 배리어 (봉사자)과 면역 염색의 검증 <ol><li> 단기 보관 (2 주 미만)의 경우, 전해질 솔루션에 STX100 전극 잠수함기 (0.1 ~ 0.15 M의 KCl 또는 염화나트륨). 시스템이 내부적으로 단락 전극 대칭이 유지되도록 EVOM 볼트 옴 미터의 전극 단자에 전극 케이블을 연결합니다. 장기 저장을 위해, dH보다 2 O 씻어 건조하고 어두운 상태로 저장합니다. </li><li> , 전극을 살균 15 분 동안 에탄올에 담그고 15 초 동안 공기 건조하도록 허용합니다. 대안 적으로, 전극은 UV 후드에 저장 될 수있다. 각각의 저항을 측정하기 전에, 멸균 전해질 용액 (인산 완충 식염수, PBS) 또는 0.1 ~ 0.15 M의 KCl 또는 염화나트륨 용액에 전극을 씻어. </li><li> 볼트 옴 미터는 저항 설정으로 설정 한 상태에서 수직 방향으로 상부 챔버의 짧은 전극과 우물의 바닥에 닿는 하부 챔버의 긴 전극과, 잘 트랜스 웰 인서트를 포함에 전극을 배치합니다. 각 웰에, EVOM 독서가 안정되면 (Ω 옴에 주어진)의 저항 값을 기록합니다. </li><li> 저항 (점 용접을 계산CE는 지역에 정상화; Ω × cm 2) 배경 저항 세포없이 트랜스 웰 인서트 (봉사자)를 뺀 막 면적을 곱하여 샘플. 비저항 값은 주로 문헌에보고되어있다. (설명 참조) </li><li> 봉사자는 일반적으로 세포를 땋는의 순간부터 2 ~ 3 주간 걸립니다 투과성 장벽의 형성을 나타내는 최대 및 고원에 상승 값까지 모든 1-2일 측정을 반복합니다. 고원 티이 값과 장벽의 무결성을 달성하기 위해 필요한 시간은 세포의 통과 수에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 높은 티이 (장벽 형성을위한 임계 값 이상 동일)와 세포 단일 층에있는 단단한 접속점의 존재를 확인하기 위해 15 분 동안 차가운 2 % 파라 포름 알데히드와 배양 세포를 고정합니다. 그런 다음, 1 ㎍ / ㎖의 안티 occludin 실온에서 30 분 동안을 PBS로 세포를 씻어 품어. PBS로 다시 세포를 세척하고 7.5 ㎍ / ㎖의 F 실온에서 30 분 동안 그들을 품어luorescently 표지 된 이차 항체. 장벽 형성을위한 음성 대조군으로 낮은 봉사자와 우물을 사용합니다. </li></ol> 참고 : 안티 occludin 대신 대체 꽉 접합 단백질에 대한 항체를 사용할 수있다. <ol start="7"><li> 조심스럽게 고정 단층이 부착되어있는 필터 멤브레인을 절제하고, 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지에 대한 슬라이드에 탑재합니다. </li></ol> 3. 대상 사업자의 Transepithelial 전송을 평가 <ol><li> 이전에 7 설명한 바와 같이, 125 I와 표적 항체 (이 예에서 ICAM-1에 대한 마우스 단일 클론 항체, 항-ICAM를) 레이블. 표지 항체의 항체에 125 I 내용을 결정하는 단백질 농도 및 감마 카운터를 추정하기 위해 브래드 포드 분석을 사용하여, 다음 분 (CPM) 당 카운트에서 특정 활동을 계산 / MG. </li></ol> 참고 : 특이성 제어하기 위해, 다시비 표적 코팅 된 나노 결정을 제조하는 데 사용되는 표지 마우스 IgG에 의해 절차 이탄. 치료화물의 수송을 연구하기 위해,이 예에서화물을 라벨 절차, 예를 들어, 알파 - 갈 락토시다 제 (α-갈)를 반복합니다. 대안 타겟팅 에이전트가 아닌 특정 제어 또는 치료화물을 위해 사용될 수있다. 다른 방법도 또한 화합물을 라벨과 표지 된 대응의 농도를 추정하기 위해 사용될 수있다. <ol start="2"><li> 몇 나노 결정의 표면에 항체 (예에서 항 ICAM)을 대상으로 표시. 이 예에서, 7 바와 같이, 표면 흡착을 허용하도록 125 I-항-ICAM 실온에서 1 시간 동안 폴리스티렌 나노 비드 (100 nm의 직경) 부화. </li></ol> 참고 :이 아닌 특정 제어 125 I-IgG의를 사용하십시오. 화물의 이동을 추적하기 위해 항체와 125 I-표지화물 (예에서 α-갈)를 대상의 조합을 사용합니다. <ol start="3"><li> 3 분 13,000 XG에 원심 분리기와 열망에 의해 상층 액의 비 코팅 상대를 제거합니다. 잠재적 인 입자 집계 (20 ~ 30 짧은 펄스를) 방해하는 낮은 전력에서 1 % 소 혈청 피펫으로 PBS에서 알부민 (BSA), 및 초음파 처리를 이용하여 코팅 된 나노 결정을 포함하는 펠렛을 Resuspend. </li><li> NC 특성화, 크기, 분산도 및 동적 광산란 (벤더 지시에 따라)를 사용하여 코팅 된 입자의 ζ 전위를 측정하고, 수를 정량화 (125)를 사용하여 입자 표면에 항체 분자 (예, 항-ICAM)를 대상으로 I-표지 감마 카운터. </li></ol> 참고 :이 방법은 비특이적 및 치료의 대응에 대해 반복 할 수 있습니다. 코팅 된 입자의 크기는 200 나노 미터 주위에 배열한다. <ol start="5"><li> 티이 &amp;와 합류 된 Caco-2 단층 위의 상부 챔버에, 125 I-항체 나노 결정 (56 NCI / ㎖ 예를 들어 125 I-항 ICAM 나노 결정을) 추가# 8805; 배경에 350 Ω × 센티미터 2 (토론 참조) (16-21일 후 파종). 하나 이상의 원하는 시간 간격으로 37 ° C에서 알을 품다. 투과성 장벽에 나노 결정의 효과를 평가하기 위해 배양 전후 티이 (2.3)를 측정한다. </li></ol> 참고 :이 절차는 비특이적 및 치료의 대응에 대해 반복 할 수 있습니다. <ol start="6"><li> 상부 및 하부 챔버에서 매체를 수집하고 37 ° C (다락방) 또는 1 ㎖ dH보다 2 O (하부 챔버)에 0.5 ㎖의 DMEM으로 그들을 한 번 씻는다. 감마 카운터를 사용하여 방사성 동위 원소의 총 함량의 측정을위한 세척을 모은다. </li><li> 세포 분획의 측정의 경우, 가장자리가 절단, 세포를 측정하기 전에 10 분 (셀 내용 발매), 1 % 트리톤 X-100으로 감마 계수관에서 배양 면도날을 사용하여 예를 들어, 투과 필터를 절제 총 방사능 관련. </li><li> 나는 다시 125을 측정하려면때문에 잠재적 인 성능 저하, 첫 번째 믹스 PBS에서 3 % BSA 700 μL, 200 μL 트리클로로 아세트산 (TCA)와 (, 상하, 또는 세포 분획) 샘플의 300 μL를 전송하는 동안 나노 결정 또는 임대. 15 분 동안 실온에서 배양한다. 한편 이번에는 감마 카운터에있는이 샘플의 총 방사능 량을 측정합니다. </li><li> 성능이 저하 된 단백질 또는 125 I 분획 (상층)에서 그대로 단백질 (펠렛)을 분리하는 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 TCA 샘플. 무료 125 I 분획의 방사능의 양을 원심 분리하기 전에 측정 된 총 방사능에서이 값을 뺍니다. 이것은 분해되지 않은 표지 단백질의 양을 제공 할 것입니다. </li></ol> 4. 대상 Nanocarriers의 Transepithelial 전송의 메커니즘 <ol><li> 라벨 이전에 3.1 절에 설명 된대로 내가 125 알부민 7을보고했다. </li></ol> 참고 : 알부민은 66.5입니다따라서 kDa의 단백질과, 상대적으로 큰 물질. 작은 약물 캐리어의 이동을 연구 할 때 더 큰 물체 (예를 들어 200 nm의 나노 결정이 여기에 사용)의 수동 수송에 유효한 제어, 그것은 (토론 참조) 작은 불활성 추적 분자로 대체해야하지만. <ol start="2"><li> 알부민 세포층 누설, 전술 한 바와 같이 트랜스 웰 인서트에 배양 된 Caco-2 단층을 사용하여 전송 세포층을 평가. </li><li> 세포 단일 층 위의 상부 챔버 매체 (3.5 절에 설명 된대로) 125 I-알부민 형 (누설의 기초 수준을 보여주는 음성 대조군), 또는 125 I-알부민 및 비 방사성 표지 항체를 대상으로 나노 결정 하나를 추가 할 수 있습니다. NC 전송을 테스트 할 때 조사와 일치한다 선택한 시간 간격 (들), 37 ° C에서 알을 품다. 이전, 도중 티이 (2.3 절)을 측정 한 바와 같이 배양 한 후, 다음 총 125 I 무료 125 I 측정을위한 모든 분수를 수집. 제 3 주 : 125 I-알부민 및 비 방사성 동위 원소 제어 IGG 나노 결정의 병용 추가 컨트롤로 사용할 수 있습니다. </li><li> 세포 간 접합을 열기위한 포지티브 대조군으로서, 세포 미디어 트랜스 웰 인서트의 상부 및 하부 챔버에 5 mM의 H 2 O 2를 함유하는 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 그런 다음, 티이 (2.3 절)을 측정하고 선택한 시간 간격에 대한 상부 챔버에 125 I-알부민을 추가합니다. H 2 접합 셀의 O 2에 의한 개방으로 인한 티이 값 붕괴를 확인하기 위해 배양에 걸쳐 다양한 시점에서 봉사자를 측정한다. </li><li> 병렬 실험에서, 50 μM의 monodansylcadaverine 하나와 융합 된 Caco-2 단층 배양 125 I-대상 나토, 또한 transcytosis라고, 세포 횡단 수송을 평가 (MDC, 방 clathrin 매개 엔도 시토 시스의 억제), 1 ㎍ / ㎖의 filipin (caveolar의 억제제 - 매개 엔도 시토 시스), 0.5 μM의 WORTMANN소재, 또는 20 μM [5 - (N-에틸-N-이소 프로필) 아밀로 라이드 (포스파티딜 이노시톨 3 macropinocytosis 개인 키나아제 [PI3K]의 억제제) (macropinocytosis 및 CAM - 매개 엔도 시토 시스 (15)의 억제제 EIPA). </li></ol> 참고 : 125 I-IgG의 나노 결정 (125) 및 I-알부민 이러한 억제제의 효과에 대한 음성 대조군으로서 사용될 수 있고, 다른 방법 (예를 들어 siRNA의 기법)보다 선택적 억제를 제공 할 수있다. <ol start="6"><li> 단일 층의 투과성에 억제제의 효과에 대한 추가 제어로, 티이시 이전 (2.3 절) 및 억제제 및 방사성 동위 원소 표지 물질과 세포의 배양 후를 측정한다. </li></ol>

<ol><li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li>
<li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+nature%3A+%22Pathogen-Mimetic%22+systems+for+mucosal+nano-medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li>
<li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers%3A+implications+for+oral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li>
<li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li>
<li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persorption+of+particles%3A+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Pharmacol.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li>
<li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cell+junctions%3A+happy+together%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li>
<li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides%3A+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li>
<li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li>
<li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis%3A+crossing+cellular+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li>
<li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li>
<li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li>
<li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption%3A+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Ther.+Drug+Carrier+Syst%22%5BJournal%5D)">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li>
<li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li>
<li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional%2C+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-%2C+co-%2C+and+tri-cultivation+Transwell+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li>
<li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li>
<li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li>
<li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li>
<li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li>
<li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li>
<li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement%3A+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li>
<li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li>
<li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li>
<li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li>
<li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li>
<li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

상기 논의 된 방법을 사용하여 세포 장벽에 걸쳐 표적 나토 수송을 연구 셀 모델은 이러한 경우의 혈액으로 GI 루멘으로부터 수송을 평가 관련된 된 Caco-2 상피 세포, 제공된 예로서 확립 될 수있다 경구 용 약물 전달 시스템의. 트랜스 웰 인서트의 GI 상피 세포 단일 층의 배양은 세포 투과성 장벽의 형성을 확인하는 봉사자의 측정 꽉 접합의 형광 면역 염색을 가능하게했다. 그 후, 125로 타겟팅 및 치료제의 방사성 표지 나는 세포 단일 층에와 GI에 걸쳐 대상으로 나노 결정의 신속하고 민감한 정량을 제공했다. 마지막으로, 기계 론적 연구는 수송은 세포층의 경로 대 기공을 갖는 경로를 통해 발생하는지 여부를 평가하기 위해 세포 내 이입 억제제, 봉사자, 그리고 알부민 세포층의 누출 분석을 사용하여 적용 하였다. 유사한 모델을 구축하는 데 중요한 매개 변수 나연구중인 세포 장벽의 생리적 특성을 반영해야한다 세포 유형의 선택. 사람 또는 동물 유래의 다양한...

외부 환경과 내부 구획 사이의 게이트웨이 등 신체의 행위에 휴대 장벽. 이는 위장관 혈류 1-3의 외부 노출면을 분리하는 상피의 경우입니다. 세포 장벽은 혈액과 실질 및 조직과 장기의 세포 구성 요소 사이의 인터페이스를 나타낸다. 본문에 이러한 세포 장벽을 통과 할 수있는 능력이 치료 및 진단 요원의 효율적인 전달을 위해 매우 중요 하나 이는 등 혈액 폐 장벽, 혈액 - 뇌 장벽과 같은 혈관의 안쪽 내피 안감의 경우 개입이 필요한 순환 및 조직 / 기관에. 치료 또는 진단 요원의 전달을 향상시키기 위해, 이러한 화합물은 서브 마이크로 미터 nanocarriers (나노 결정)에로드 할 수 있습니다. 이러한 약물 전달 차량은 다양한 제형으로 할 수있다화학 물질 및 약물의 용해도, 보호, 약물 동력학, 릴리스 및 신진 대사 4,5을 최적화 구조. 나노 결정은 또한 치료 조치 2,6 필요한 신체의 영역에 접착을 촉진 또는 친 화성 (예, 항체 등, 펩티드 당, 앱 타머,) 잔기를 표적으로 작용 화 될 수있다. 세포 장벽의 표면에 발현 결정에 나노 결정의 대상으로하는 것은 더 2,6로 및 / 또는 이러한 라이닝에 걸쳐 전송을 용이하게 할 수있다. 선택적으로 두 환경 사이의 물질 수송의 역할은 세포의 층 사이에서 특정 고유의 기능을 필요로합니다. 충치의 루멘에 직면 정점 막 막 형태와 지질, 운송 및 수용체 2의 구성과 관련하여, 조직의 간질을 지향 기저 막에서 변화함으로써 하나의 기능은 세포의 극성입니다. 또 다른 특징은 세포 간 junctio을 포함인접한 셀을 연결 NS. 꽉 접합, 특히 접합부 접착 분자 (용지), occludins 및 claudins을 형성하는 단백질의 규제에 루멘에서 물질의 통과를 허용, 선택적 세포층의 전송로 알려진 세포 사이의 물질의 수송을 허용하거나하지 않도록 장벽 기능을 조절 기저 공간 3. 몸에있는 세포 장벽에 많은 천연 및 합성 요소 (백혈구, 분자, 입자 및 약물 전달 시스템)의 결합은, 그러므로,의 액세스와 안전하지 않은 과도 비교적 무해한 이상 연장하고 수있는, 세포 접합 개방을 유도 할 수있다 장벽 2,5,7-9에서 바람직하지 않은 물질. 결과적으로,이 통로가 transepithelial 전기 저항 (티이) 및 분자의 수동적 세포층 확산 (본원 불리는 세포층 누설)을 측정함으로써 평가 될 수있다 전류 또는 아민의 증가 세포층 누설 저항을 감소기저 공간으로 RT 화합물은 세포 접합의 개방을 나타내는 각각 5,10,11. 염색은 모든 세포 주변 5,10,12 주위 세포 셀 테두리에 집중 나타나는 위치를 이러한 방법을 보완하기 위해, 위에 나열된 꽉 접합 단백질의는 자신의 무결성을 평가하기 위해 염색 할 수 있습니다. 또한, 같은 방 clathrin 코팅 구덩이 또는 caveolae라고 플라스크 모양의 막 함입에 관련된 것과 같은 특정 세포 표면의 결정을 대상으로 약물 전달 시스템, 세포 내 구획 5에 약물 전달을위한 수단을 제공, 엔도 시토 시스에 의해 세포에 기공을 갖는 흡수를 게재 할 수 13. 또한, 엔도 시토 시스는 기저 측 릴리스 transyctosis로 알려진 현상, 또는 세포 횡단 수송 14 세포체에서 소포의 인신 매매로 이어질 수 있습니다. 따라서, 엔도 시토 시스의 반응 속도와 메커니즘의 지식은 세포 내를 악용 할 수있다차 세포층의 노선에 비해 배달 상대적으로 안전하고 제어 모드를 제공 세포 횡단 약물 전달. 엔도 시토 시스의 메커니즘 고전 경로 (방 clathrin 및 카베 올린 매개 엔도 시토 시스, 그리고 macropinocytosis) 또는 비 고전 노선의 변조기로 평가 될 수있다 (예 : 세포 접착 분자의 경우와 (CAM) - 매개 엔도 시토 시스) 5,13,15 . 세포 내 인신 매매는 종종 표준 우물 커버 슬립으로 연구되는 반면, 기저 구획의 부재는 세포 편광 셀 계층에서 전송을 연구 할 수있는 능력을 배제한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 세포 단일 층에 걸쳐 전송 긴 트랜스 웰은 상부 (정점) 실, 세포 부착과 꽉 단일 층을 형성 다공질 투과 막으로 구성되는, 10,11,16,17를 삽입하고, 낮은 사용하여 연구되고있다 (기저) 챔버 (그림 1). 이 구성에서는, 전송은 측정 할 수있다정점 간 측저, 상부 챔버로 치료 투여 세포 단층 및 내부 다공성 막을 통해 전송을 다음, 마지막 반송물의 정량화를위한​​ 하부 챔버에 매체를 수집하여 방향. 측저에서 첨단으로의 전송 방향은 상부 챔버 5,10,12,16로부터 하부 챔버 및 후속 컬렉션에 초기 투여에 의해 측정 될 수있다. 다양한 기술이 전술 한 바와 같이, 티이 및 세포층의 전송 분석법 등 트랜스 웰에 투과성 장벽의 형성을 확인하기 위하여 존재한다. 또, 세포가 배양되는 투과 필터 (형광 공 촛점, 전자 현미경에 의해 예) 영상 분석을 위해 제거 될 수 있고, 또한 세포 단층 모델의 검증뿐만 아니라 전송의 메커니즘. 다른 기공 크기, 재질 및 표면 영역에서 사용할 멤브레인 타입의 선택은, 다양한 사실상에 달려이러한 물질의 크기 또는 전송되는 개체, 세포 유형, 및 이미징 방법 16,18-20으로 RS. 트랜스 웰 인서트는 또한 챔버 및 세포 표면 영역의 양이 상수를 공지 된 바와 복잡한 포유류 시스템에 비해 전송 제어하고 정확한 정량을 용이하게한다. 생체 내 전달에 관련된 여러 가지 요소가 등 장 점액의 존재, 전단 응력, 소화 효소, 면역 세포를 포함하여, 제거하는 동안, 체외 모델이 작은 규모의 운송에 관한 유용한 사전 정보를 제공합니다. 휴대 장벽 10,11,16,17 통해 NC 전송을 공부하는이 방법의 적응을 설명하기 위해 예를 들어, 우리는 여기에 GI 상피에서 NC 전송의 가능성을 모델 약물 전달의 통로를 평가에 의해 모델링 된 경우를 설명 인간 상피 대장 선암 (된 Caco-2) 세포의 단일 층을 통해 시스템. 이러한 목적으로, C 들면ELL을 투명하고 현미경 이미징에 사용될 수있는 0.8 μm의 세공 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 필터 (6.4 mm 직경)에서, 트랜스 웰 인서트에서 배양 하였다. 투과성 장벽의 상태는 티이, 제어 물질, 알부민 및 단단한 접합부, occludin 단백질의 요소의 형광 현미경 시각화의 정점 간 측저 전송 측정에 의해 확인된다. 대상 폴리머 NC의 모델은 100 nm의, 생분해 폴리스티렌 나노 입자로 구성된 사용됩니다. 나노 결정은 표면 만 대상으로 항체 흡착 또는 표적 항체의 조합과 구성 요소 중 하나는 방사성 동위 원소 추적 125 I로 표시 할 수있는 치료화물에 의해 코팅된다. 선택된 예에서, 항체는 세포 간 부착을 분자 -1 (ICAM-1)을 인식하고, 단백질은 GI 상피의 표면에 발현 (및 기타), 세포 내 및 세포 횡단 수송 O를 용이하게하기 위해 도시 된 세포<html> F 약물 사업자와 그들의화물 21. 화물은 α-갈 락토시다 제 (α-GAL), 파브리 질환, 유전 리소좀 저장 장애 (22)의 치료에 사용되는 치료 효소이다. 크기가 약 200nm의 코팅 된 나노 결정은, 시간의 변화 기간의 세포 단일 층에 혀끝의 챔버에 첨가하고 37 ° C에서 배양 된 후 125 나노 결정에 나는 세포 단일 층 및 / 또는 관련된 검출 할 수있다 세포 아래의 기저 챔버로 이송. 무료 125 I의 추가 결정이 코팅 된 NC 전송의 성능이 저하 된 부분 및 추정의 뺄셈을 할 수 있습니다. 운송기구는 상기 세포 횡단 수송이 엔도 시토 시스와 transcytosis의 경로를 변조 할 때 전송의 변화를 검토하여 결정되는 동안, 상기 파라미터를 통해 세포층 경로에 속하는 투과성 장벽의 변화를 조사하여 평가한다. &quot;ontent&gt; 이들 방법은 모두 세포 장벽을 가로 질러 약물 전달에 대한 가능성을 평가할 수 있도록, 귀중한 셀룰러 배리어 모델에 대한 정보, 약물 전달 시스템의 전송 범위 및 속도와 같은 전송 메커니즘을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Transwell,</td><td>BD Falcon</td><td>삽입 353095</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CM</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-015-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>펜 스트렙</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 상피 결장 직장 선암종 (Caco-2) 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-37TM&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>125요오드</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ033H002MC</td><td>방사성 위험</td></tr><tr><td>인산염 버퍼 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Equitech Bio</td><td>BAH-66</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15710</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 면역글로불린 G (IgG)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 ICAM-1에 대한 마우스 단클론 항체 (anti-ICAM)</td><td>Marlin 1987</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&알파;-갈락토시다아제, 생두에서 추출한</td><td>시그마</td><td>G8507-25UN&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>FITC 라텍스 비드, 100nm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17150</td><td>년&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>234729-500ML</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트리클로로아세트산 (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA433-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Occludin 항체 (Y-12), 염소 다클론 항-인간</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-27151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>모노단실카다베린 (MDC)</td><td>시그마</td><td>D4008</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>필리핀</td><td>시그마</td><td>F9765</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5-(N-에틸-N-이소프로필) 아밀로라이드(EIPA)</td><td>시그마</td><td>A3085</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>워트만닌</td><td>시그마</td><td>W1628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>감마 카운터</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>볼트-옴 미터</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TEER 전극</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX100</td><td>전극은 다양한 웰 플레이트에 사용 가능</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td><td>Malvern</td><td>Nano-ZS90</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

서브 마이크로 미터 캐리어 (nanocarriers, 나노 결정은) 용해도, 안정성, 순환 시간, 타겟팅 및 방출을 개선하여 약물의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 몸에있는 세포 장벽을 통과하면 개입이 필요한 조직에 혈액 순환 및 전송에 치료 나노 결정의 모두 구두 전달을위한 중요합니다. 인접 셀, 또는 (ii) 상기 세포 횡단의 세포체를 통해 전송 자료는 엔도 시토 시스에 의해 내장되어 경로,,, 분비를 연동 접속점의 일시적인 중단을 통해, (I) 세포층 경로 : 세포 장벽에 걸쳐 NC 전송에 의해 달성된다 반대의 세포 표면 (transyctosis)에서. 세포 장벽에 걸쳐 배달 운송에 관련된 세포 표면 마커에 특이 적으로 결합 대상 에이전트와 치료 또는 사업자의 결합에 의해 촉진 될 수있다. 여기, 우리는 WHI 모델 세포 장벽에 걸쳐 범위와 NC 수송 메커니즘을 측정하는 방법을 제공합니다채널은 트랜스 웰 인서트에있는 다공성 막에 성장 위장의 단층 (GI) 상피 세포로 구성되어 있습니다. 투과성 장벽의 형성은 transepithelial 전기 저항 (티이), 제어 물질 transepithelial 수송, 타이트 접합부의 면역 염색을 측정함으로써 확인된다. 예로서, ~ 200 nm의 중합체 나노 결정은 치료화물을 운반하고 세포 표면 행렬식을 표적으로하는 항체로 코팅되어있는, 사용된다. 항체 또는 치료화물은 방사성 동위 원소 추적에 125 I로 표시되고, 표시된 나노 결정은 시간의 변화 기간 동안 세포 단일 층에 다락방에 추가됩니다. 내부 챔버로 이송 세포 및 / 또는 연결된 나노 결정은 검출 될 수있다. 무료 125 I의 측정 성능이 저하 된 분수의 뺄셈을 할 수 있습니다. 세포층 경로는 위에서 설명한 장벽 매개 변수에 NC 전송으로 인한 잠재적 인 변경을 결정함으로써 평가된다. 세포 횡단 수송 난엔도 시토 시스와 transcytosis 경로를 조절하는 효과를 주소에 의해 결정들.

대상으로 나노 결정의 transepithelial 전송을 공부하는 우리의 세포 모델의 검증으로, 그림 2는, 된 Caco-2 세포 단층이 합류 ~ 12 일째에 도달 1.5 × 10 5 세포 / ㎠의 밀도로 도금 일 18까지 단일 층의 무결성을 유지하고 있음을 보여줍니다 티이 (그림 2A)로 표시. 이 낮은 티이에서 가난한 꽉 접합 라벨 (17 Ω × 센티미터 2, 5 일에 비해 높은 티이 (390 Ω × 센티미터 2 일 14)와 단층에 occludin 양성 꽉 접합의 존재 (그림 2B)에 의해 확인되었다 ). NC 요소에 방사성 라벨의 추적은 기저 측에 이송 처음 혀끝의 챔버에 추가 된 이러한 구성 요소의 총량 (NC 항체 또는화물을 대상으로), 자신의 휴대 관련된 부분, 그 부분을 결정한다. 이러한 값은 N...

많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

이 절차의 전반적인 목표는 약물 전달 시스템 또는 치료제의 수송 능력을 평가하는 것입니다. 이는 경구 약물 전달과 관련된 위장관 상피 모델과 같은 세포 장벽을 통해 이동하는 과정을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Transwell 인서트에서 Caco-2 세포를 배양하여 세포 분화와 세포 단일층 형성을 유도합니다.두 번째 단계는 경상피 전기 저항(trans epithelial electrical resistance) 측정, 세포 접합부의 면역 염색, 그리고 검출 가능한 추적 분자의 수동 투과성 평가를 통해 이 모델이 투과 장벽을 나타내는지 검증하는 것입니다. 다음 단계는 약물 전달 시스템을 준비하는 것으로, 본 예시에서는 표적형 폴리머 나노 운반체가 사용되었습니다. 운반체에는 약물 화물이 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있으며, 비표적형 운반체 또는 유리 약물과 같은 대조군이 반드시 포함되어야 합니다.이들 요소는 검출이 가능하도록 방사성 동위원소로 표지됩니다. 그 후 배양 후, 캐리어를 세포 단층 위의 apical chamber에 첨가합니다. 다양한 시간대별로 apical chamber, basolateral chamber 및 세포 단층에서 캐리어를 수집하여 표지된 성분의 잠재적 분해 여부를 테스트합니다.수송 메커니즘을 조사하기 위해 마지막으로 세포 단층을 가로지르는 나노운반체의 수송량을 계산합니다. 세포 간 transcytosis의 약리학적 억제제 또는 세포 간 paracellular 수송 리포터가 존재하는 환경에서 유사한 실험을 수행해야 합니다. 본 연구에서 설명하는 기술은 신체 내 세포 장벽을 나타내는 배양된 세포 단층에서 약물 및 약물 나노운반체의 수송 속도와 메커니즘을 평가하는 데 사용되는 잘 확립된 방법들을 응용한 것입니다.여기서 중점적으로 다룬 예시는 표적 고분자 나노입자의 위장관 상피 모델 통과 수송을 검증하는 것이었지만, 유사한 방법을 적용하여 이와 같거나 또는 혈류와 조직 및 장기 사이의 장벽을 형성하는 내피세포와 같은 다른 세포 단층을 통한 다양한 약물 전달 시스템의 통과 여부를 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 경우가 이에 해당합니다. 일반적으로 이 방법에 처음 입문하는 사용자는 특히 적은 양이 세포를 통해 수송되는 경우, 약물 전달 시스템을 적절히 추적하기 위한 라벨을 선택하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.이 측면에서, 본 연구에서는 약물 전달 시스템을 표지하기 위해 방사성 동위원소를 사용할 것이며, 또 다른 주요 고려 사항은 모델 세포 장벽의 무결성을 검증하고 실험을 통해 이를 확인하기 위한 적절한 대조군을 사용하는 것입니다. 이 과정은 멸균된 생물안전 2등급(BSL-2) 세포 배양 후드 내에서 수행되며, 후드에 들어가는 모든 재료는 에탄올로 멸균해야 합니다. 통계적으로 유의미한 결과를 얻기 위해 핀셋을 사용하여 0.8 µm 기공의 polyethylene terephthalate(PET) transwell insert를 24 웰 플레이트에 배치합니다.각 실험 조건은 최소 4회 반복이 필요합니다. 이전에 준비한 세포 배지에 인간 상피 결장직장 선암 또는 caco two 세포를 희석합니다. 200에서 400 µL의 세포 용액을 트랜스웰의 상부 또는 apical 챔버에 넣습니다.1.5 × 10⁵ cells/cm²의 밀도로 세포를 분주합니다. 하단 또는 기저측 챔버에 700 내지 900 µL의 세포 배지를 채우고, 37 °C, 5% CO₂ 및 95% 습도 조건에서 16 내지 21일 동안 배양하며 3~4일마다 상단 및 하단 챔버의 배지를 교체합니다.세포 단층 위의 압력을 유지하기 위해 다음 순서로 배지를 교체하십시오. 먼저 하단 챔버의 배지를 흡입하고, 이어서 상단 챔버의 배지를 흡입합니다. 상단 챔버에는 200 to 400 µL의 신선한 배지를 채우고, 하단 챔버에는 700 to 900 µL의 신선한 배지를 채워 TEER로 상피 투과성 장벽을 검증합니다. 전압계를 저항 설정으로 맞춘 후, 트랜스웰 인서트가 들어 있는 웰에 전극을 수직으로 배치합니다.짧은 전극은 상부 챔버에, 긴 전극은 하부 챔버의 웰 바닥에 닿도록 배치해야 합니다. 전압계의 수치가 안정되면 각각의 저항값을 옴(ohms) 단위로 기록합니다. 투과성 장벽의 형성을 나타내는 TER 수치가 최대치에 도달하여 고점을 유지할 때까지 1~2일마다 측정을 반복하며, 이는 일반적으로 세포 플레이팅 시점부터 2~3주가 소요됩니다.세포 단일층에 tight junction이 형성되었는지 먼저 확인하기 위해, 세포를 고정하고 양쪽 챔버의 배지를 흡입하여 제거한 후 따뜻한 DMEM으로 세포를 3회 세척하고 차가운 2% paraformaldehyde에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 paraformaldehyde를 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그다음, 각 챔버에 1 µg/mL의 anti-occludin을 첨가합니다.장벽 형성의 음성 대조군으로 누출이 적은 웰을 사용합니다. 상온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 세포를 PBS로 다시 세척한 다음, 각 웰에 7.5 µg/mL 농도의 표지된 2차 항체를 첨가하고 암실 상태의 상온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 세포를 PBS로 세척하고 고정된 단일층이 부착된 필터 막을 조심스럽게 절제하여 슬라이드에 장착한 후, 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 이미징합니다.이 절차는 이전에 발표된 프로토콜을 사용하여 표적 항체에 iodine 1 25를 표지하고, 표지된 항체의 비방사능을 µg당 분당 계수(counts per minute per microgram)로 계산하는 것으로 시작합니다. 본 예시에서 표적 항체는 특이성을 제어하기 위한 인간 세포간 접착 분자-1(intercellular adhesion molecule, one)에 대한 마우스 단일클론 항체 또는 anti ICAM one입니다. 치료 화물을 운반하는 비표적 코팅 나노 운반체를 준비하기 위해 iodine 1 25가 표지된 마우스 IgG가 사용됩니다.화물은 또한 iodine 1 25로 표지됩니다. 본 예시에서 화물은 유전성 리소좀 축적 질환인 파브리병 치료에 사용되는 치료 효소인 alpha galacto SASE 또는 Alpha G입니다. 이 절차에서 가장 어려운 점 중 하나는 운송된 물질을 적절하게 검출하는 것을 보장하는 것입니다.성공적인 결과를 보장하기 위해서는 나노운반체 구성 요소가 높은 비방사능의 충분한 양의 동위원소로 표지되어야 합니다. 다음 단계는 표지된 anti ICAM을 나노운반체의 표면에 결합하는 것입니다. 본 실험에서는 비특이적 대조군 모델로서 iodine 1 25로 표지된 anti ICAM과 직경 100 nanometer의 폴리스티렌 나노비드를 단순히 혼합합니다.Iodine 1 25 표지 IgG를 사용하고, 화물의 운송을 추적하기 위해 anti ICAM과 iodine 1 25 표지 Alpha G의 조합을 사용합니다. 표면 흡착이 일어날 수 있도록 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 13,000 GS에서 3분간 원심분리하고, 흡입 피펫을 사용하여 상층액에 있는 코팅되지 않은 대응물들을 제거합니다. 코팅된 나노 운반체가 포함된 펠릿을 PBS 내 1% Bovine serum albumin에 현탁시킨 다음, 낮은 출력으로 초음파 처리하여 잠재적인 입자 응집체를 분해합니다. iodine 1 25 anti ICAM 나노 운반체를 고밀도의 confluent caco two 단층 세포 위의 상단 챔버에 첨가합니다. TEER을 측정한 후, 비특이적 및 치료적 대응물에 대해 동일한 절차를 반복합니다.37 °C에서 원하는 시간 간격으로 하나 이상 배양합니다. 배양 후 다시 눈물을 측정합니다. 이 눈물 측정은 투과성 장벽에 대한 나노 운반체의 영향을 평가하기 위한 것입니다.상부 및 하부 챔버에서 배지를 수집합니다. 상부 챔버는 37 °C의 DMEM 0.5 mL로 세척하고, 하부 챔버는 탈이온수 1 mL로 세척합니다. 세포 분획 측정을 위해 감마 카운터를 사용하여 총 방사성 동위원소 함량을 측정할 수 있도록 세척액을 수집합니다.면도날을 사용하여 테두리를 따라 자른 후 투과성 필터를 절제합니다. 나노 운반체로부터 방출되었거나 잠재적 분해로 인해 방출된 iodine 1 25의 세포 관련 총 방사능을 측정하기 위해, 1% Triton X 100이 담긴 감마 카운터 튜브에서 10분 동안 배양하여 세포 내용을 방출시킵니다. 먼저 각 시료 300 µL를 PBS 내 3% BSA 700 µL 및 200 µL의 트리클로로아세트산(TCA)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.15분 동안 배양하는 동안, 감마 카운터로 시료의 총 방사능을 측정합니다. TCA 시료를 3000 GS에서 5분간 원심분리하여 온전한 단백질을 분해된 단백질 또는 iodine 1 25 분획으로부터 분리합니다. 유리 iodine 1 25 분획의 방사능을 정량하고, 이 값을 원심분리 전 측정된 총 방사능에서 뺍니다. 이를 통해 방사성 추적자가 단백질에서 분리된 분획 대비 표지된 단백질의 양을 구할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 transwell insert에 KCO two 단일층을 배양하여 albumin paracellular leakage culture를 이용한 세포 간 수송을 평가하기 위해, 상단 챔버의 세포 단일층 위 배지에 기저 누출 수준을 보여주는 음성 대조군으로서 iodine 1 25 표지 albumin만을 처리하거나 iodine를 처리합니다.125 표지 알부민과 방사성 표지 되지 않은 항체를 준비합니다. 표적 나노 운반체를 nz.Transport 테스트 시 조사했던 것과 동일한 선택된 시간 간격 동안 37 °C에서 배양합니다. 배양 전, 배양 중, 그리고 배양 후에 앞서 설명한 방식대로 눈물을 측정합니다.세포 간 접합부 개방의 양성 대조군으로 total iodine 1 25 및 free iodine 1 25를 측정하기 위해 배양 후 모든 분획을 수집합니다. transwell의 상단 및 하단 챔버에 5 mM 과산화수소가 포함된 세포 배지를 추가합니다. 이를 삽입하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.선택한 시간 간격마다 눈물(tear)을 측정하고 상부 챔버에 iodine 1 25 albumin을 첨가하십시오. 배양 과정 중 다양한 시점에서 눈물을 측정하여 과산화수소로 유도된 세포 접합부 개방으로 인한 눈물 값의 감소를 확인합니다. 병행 실험에서는 각 억제제를 처리하여 Caco two 단층 세포를 배양함으로써 iodine 1 25 표적 나노 운반체의 세포횡단 수송 또는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 평가하십시오.클라트린 매개 세포내섭취(clathrin mediated endocytosis) 억제제인 50 µM MDC, 클라트린 매개 세포내섭취 억제제인 1 µg/mL filipin, 거대세포음작용(macropinocytosis)에 관여하는 Phosphatidylinositol 3-kinase 억제제인 0.5 µM WT manin, 그리고 20 µM EIPA.마크로피노사이토시스(macropinocytosis) 및 클라트린 매개 엔도사이토시스(clathrin mediated endocytosis) 억제제를 사용하였으며, CACO-2 단층의 투과성에 미치는 억제제의 영향을 검증하기 위한 추가 대조군으로서 억제제 및 방사성 표지 물질과 세포를 함께 배양하기 전, 도중 그리고 후에 TEER을 측정하였습니다. 표적 나노 운반체의 상피세포 간 수송 모델로서, CACO-2 세포를 Transwell 인서트 상에 1.5 × 10⁵ cells/cm² 밀도로 배양하였으며, 단층의 무결성을 평가하기 위해 상피세포 간 전기 저항(TEER)을 측정하였습니다. 이 그래프에 나타난 바와 같이, 단층은 12일째에 합쳐졌으며(confluence) 18일까지 단층 무결성을 유지하였습니다. 이러한 결과는 14일째에 TEER 값이 380 Ω/cm²로 높았던 단층에서 occludin 양성 밀착 연접(tight junctions)이 관찰된 반면, TEER 값이 17 Ω/cm²로 낮았던 경우에는 밀착 연접 표지가 불충분했다는 점을 통해 추가로 검증되었습니다. 5일째에 CACO-2 세포 단층을 통한 anti-ICAM 나노 운반체의 수송을 평가하기 위해, Transwell 인서트에서 배양된 합쳐진 CACO-2 단층의 apical chamber에 iodine-125로 표지된 anti-ICAM 나노 운반체를 첨가하여 배양하였습니다.기저측 챔버 내의 Iodine 125 함량을 표시된 시점에서 측정하여, 상단 패널에 나타난 바와 같이 세포당 운송된 나노 운반체의 양을 계산하였습니다. 하단 패널에서는 운송된 나노 운반체의 백분율을 기저측 분획에서 발견된 운반체의 양과 기저측 및 세포 분획의 합산량의 비율로 계산하였습니다. Iodine 125 anti-ICAM 나노 운반체에 대해 이 예시에서 추정한 이러한 파라미터들을 대조군인 Iodine 125 IgG 나노 운반체의 결과와 비교하여 표적화되지 않은 대조군 대비 운송 효율을 입증하였으며, 그 결과는 상단 패널에 제시되어 있습니다.방사성 표지가 나노 운반체 화물에 통합되었을 때, 하단 패널에 표시된 바와 같이 iodine 1 25 anti ICAM 나노 운반체 또는 iodine 1 25 IgG 나노 운반체의 수송 속도를 반영하는 겉보기 투과 계수 또한 계산되었습니다. 설명된 매개변수들은 화물의 수송을 반영하며, 이 예시에서의 화물은 파브리병(Fabry Disease)으로 알려진 유전성 리소좀 축적 질환의 치료에 사용되는 alpha GA 효소입니다. apical, basolateral 및 세포 분획의 방사성 동위원소 함량을 3시간과 24시간에서 측정하였으며, 이를 이 표에 표시된 바와 같이 수송과 관련된 다양한 값으로 변환하였습니다.화물을 추적하여 나노운반체 수송을 계산하는 방법 외에도, 이 치료 효소의 상피 세포 통과 전달량은 세포당 수송된 Alpha-gal의 분자 수 또는 picograms으로 환산하여 추정할 수 있습니다. Caco-2 단일층을 통한 anti-ICAM 나노운반체의 수송 기전 또한 조사되었습니다. 합류된 Caco-2 단일층을 통한 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노운반체의 세포 통과 수송(Transcellular Transport)은 다음 억제제인 EIPA, Filipin, MDC 또는 Wortmannin의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 평가되었습니다. EIPA는 거대음세포작용(macropinocytosis) 및 caveolae 매개 내포작용(caveolae mediated endocytosis)의 억제제입니다. Filipin, MDC 및 Wortmannin은 각각 clathrin 매개 내포작용(clathrin mediated endocytosis), clathrin 매개 내포작용 및 거대음세포작용의 억제제입니다.이 그래프에 나타난 바와 같이, EIPA는 Caco-2 세포 단층을 가로지르는 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노 운반체의 수송을 감소시켰습니다. 반면 Filipin MDC와 Wortmannin은 대조군 조건과 비교하여 수송 수준을 감소시키지 않았습니다. 이는 anti-ICAM 나노 운반체가 세포 가로지르기 수송(transcellular transport)을 위해 caveolae 매개 내포 작용을 이용하며, clathrin 또는 거대음세포작용(macropinocytosis) 관련 세포횡단수송(transcytosis)은 이용하지 않음을 시사합니다.Paracellular 수송을 평가하기 위해, Caco-2 층을 가로질러 이동하는 iodine 125 표지 anti-ICAM 나노 캐리어의 수송 과정 동안 TEER을 측정하였습니다. 나노 캐리어가 없을 때의 두 단일층 TEER 값은 대조군으로 표시되었으며, 점선 구간은 평균의 SEM을 나타냅니다. 5 mM H₂O₂ 배양은 세포 간 결합의 개방에 대한 양성 대조군으로 사용되었으며, 이는 TEER 값의 기저 수준 감소로 확인되었습니다.또한, 5 mM 과산화수소, IgG 나노 운반체 또는 anti-ICAM 나노 운반체의 존재 또는 부재 하에 세포 단층을 통과하는 iodine 1 25, albumin의 겉보기 투과 계수로 측정된 세포 간 단백질 누출을 측정하고 계산하였습니다. 이 그래프들에 나타난 바와 같이, 과산화수소는 기저측 챔버로의 iodine 1 25 및 albumin 누출을 현저히 증가시켜 양성 대조군 역할을 하였습니다. anti-ICAM 나노 운반체와 함께 배양했을 때, 운반되지 않는 대조군 IgG 나노 운반체와 마찬가지로 48시간 동안 iodine 1 25 및 albumin의 세포 간 누출에 변화가 없었습니다.이러한 결과는 세포 간 수송(paracellular transport) 가능성을 배제하며, anti ICAM 나노 운반체가 세포횡단 수송(transcellular transport)을 위해 ICAM 매개 세포내섭취(endocytosis)를 이용한다는 이전 결과들과 일치합니다. 이 절차를 수행할 때는 Transwell 모델에 적합한 하나 이상의 세포 유형과 적절한 공극 크기, 재질 직경 등을 갖춘 투과성 필터를 선택하는 것이 중요하며, 본 절차 이후 약물 전달 시스템을 효과적으로 정량화하기 위한 라벨링 기술을 선택해야 합니다. 수송된 물질의 위치를 결정하고 수송된 물질의 상태를 추가로 확인하기 위해 형광 현미경이나 투과 전자 현미경과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.Western blot은 단백질 분해를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. EISA는 운송체의 표적 능력을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 약물 화물의 활성은 분광 광도법 분석 또는 기타 적절한 기술을 사용하여 측정할 수 있습니다.

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