Name: 높은 해상도 전체 마운트 제자리에서 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 제자리 하이브리드화를 통해 Danio rerio 배아에서 특정 유전자의 시공간적 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 저발현 전사체 검출과 배경 신호 감소에 효과적입니다.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 높은 해상도로 RNA를 시각화하는 개선 된 방법을 개발했습니다. 현장 하이브리드 절차는 다공성 바닥 (그림 1) 간단한 사용자 정의 - 만든 바구니를 사용하여 수행됩니다. 배아는 무균 조건 하에서 상온에서 6 - 웰 플레이트에서 RNase가없는 솔루션을 사용하여 처리됩니다. 분리 할 배아 바구니는 다른 색깔 에펜 도르프 튜브에서 만들어집니다. 또는 테두리없이 바구니는 쉬운 방향으로 사용되며 특정 프로브에 해당하는 등 바구니에서 배아를 식별 할 수 있습니다. 65 Prehybridization 70 ° C 및 하이브리드 ° 50 %의 탈 아미드와 C는 고해상도 신호를 얻기 위해 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한 15 분 포스트 PBST에 대한 알칼리 트리스 버퍼를 두 번 배아를 배양하는 안티 - DIG 항체와 BCIP의 면전에...

제브라 피쉬 (Danio rerio)는 척추 동물의 개발, 질병, 행동의 연구를위한 강력한 동물 모델로 등장하고있는 약물 검사 1-3습니다. 제브라 피쉬 배아는 하나의 교차점에서 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 수정 및 개발 전 자궁 및 광학적으로 명확한 배아 신속하게 개발을 발생합니다. 중요한 발달 이벤트는 처음 48 시간 후 수정 (HPF) 동안 발생합니다. 이 기관 원기의 모양과 세포 분화의 시작을 포함합니다. 단백질의 최저 이상 발현은 안티센스 모르 (MO) 올리고 뉴클레오티드와 배아의 microinjection을 통해 달성하거나 하나 또는 두 개의 세포 단계 (825 HPF)에서 각각 mRNA의 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아의 소원이 그 특정 유전자의 시공간적 표현의 연구를 용이하게합니다. 소원 기​​술의 응용 프로그램은 오버 EXPR을 발현 또는 MO와 배아의 microinjection에 따라ESS 또는 최저 특정 단백질 수준이 다른 유전자의 차등 규제를 보여준다. 유전자 발현 패턴의 변화는 표현형의 변화와 상관 관계와 초기 형성기 동안 표적 유전자의 기능을 표시 할 수 있습니다. 프로브를 준비하고 사전에 저장 될 수 있기 때문에, ISH 기법은 6 잘 접시와 사용자 정의 만든 바구니를 사용하여 한 번에 적어도 20 유전자의 유전자 발현 패턴을 나타 내기 위해 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Taq 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA 클로닝 키트- 이중 프로모터 pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ 미니 플라스미드 정제 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 및 HindIII 제한 효소</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>완충액 포화 페놀, 초순수</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td><td>4°C에서 보관하십시오. 눈, 피부 및 호흡기 자극성 물질 및 발암 물질이 의심되는 물질. 취급하는 동안 주의해야 합니다.</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>독성 및 발암 의심 물질. 흄 후드 아래에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>RNase-free DNAse I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>작은 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Sp6, T7 및 T3 RNA 중합 효소</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td>와 DIG-RNA 라벨링 믹스 <td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M 아세트산 나트륨 (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100 % 에탄올</td><td>상업용 알코올</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC는 눈, 피부 및 호흡기 자극제입니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 보안경, 장갑, 마스크를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 m (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>-20°C에서 준비하고 보관하십시오. C는 나중에 사용할 수 있도록 40ml 분취량으로 사용합니다. PFA는 독성이 있습니다. 보안경, 장갑, 방진 마스크를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>페닐티오카르보마이드(PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC는 독성이 강합니다. 보안경, 장갑, 방진 마스크를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (시계 제작자 ' s) 겸자 패턴 번호 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Six-well Cell Culture Cluster</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>바구니는 나일론 메쉬와 Eppendorf 튜브로 만들어집니다</td><td>사내 준비</td><td></td><td>바구니를 만들려면 테두리가 있거나 없는 Eppendorf 튜브(1.5ml)를 잘라 원뿔형 끝을 제거합니다. 나일론 메쉬를 크기에 해당하는 작은 조각으로 자릅니다. Eppendorf 튜브의 절단된 끝단. 절단된 끝을 덮는 나일론 메쉬가 있는 튜브를 전기&nbsp; 튜브와 나일론 메쉬가 서로 달라붙을 때까지 핫 플레이트(흄 후드에서 수행). 바구니에서 여분의 메쉬를 잘라내고 사용할 때까지 100% 메탄올에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트(트윈 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>발효</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td><td>시그마</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>시그마</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드, 고순도 등급</td><td>시그마</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 수지</td><td>바이오 라드</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일수화물</td><td>시그마</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 소금</td><td>시그마</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>식염수-구연산나트륨 완충액(SSC)</td><td>시그마</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>베이커스 효모 X형</td><td>시그마</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>피셔</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>레바미솔 염산염</td><td>시그마</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드 무수(DMF)</td><td>시그마</td><td>227056</td><td>자극성, 독성, 가연성 및 기형 유발 물질이 의심됩니다. 장갑과 고글을 포함한 적절한 안전 복장으로 취급하십시오.</td></tr><tr><td>5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>이 용액을 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>니트로블루 테트라졸륨(NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>이 용액을 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>소 혈청의 알부민, 정제 분획 V (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well cell culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg (mnx1 : GFP) ml2 / Tg (hb9 : GFP) ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg (mnx1 : GFP) ml2</td><td></td></tr><tr><td>인스턴트 오션</td><td>아쿠아리움 시스템</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

이 문서에서는 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화 (소원)의 전체 마운트에 초점을 맞추고 있습니다. 소원 기​​술은 조직의 분포와 발달 단계의 측면 모두에서 유전자 발현의 평가를 용이하게합니다. 프로토콜은 digoxigenin으로 표시 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 제브라 피쉬 배아의 소원의 사용을 설명합니다. 프로브는 복제와 선형화 된 유전자 템플릿의 시험 관내 전사의를 통해 digoxigenin 연결된 뉴클레오티드를 통합하여 생성됩니다. 정의 개발 단계에서 수확 배아의 chorions는 특정 프로브를 배양하기 전에 제거됩니다. 여분의 프로브를 제거하는 세척 절차에 따라 배아는 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 결합 된 항 digoxigenin 항체 배양한다. 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)에 대한 발색 기판을 채용하여, 특정 유전자의 발현을 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현의 수준에 따라 전체 절차는 2-3 일 이내에 완료 할 수 있습니다.

바구니 당 50 배아 (유전자 당 / 실험 조건 당)이 유전자의 발현 패턴이 하나의 실험에서 얻을 수와 프로토콜을 사용하여. 거의 모든 배아는 특정 유전자와 유사한 발현 패턴을 보여줍니다. 원위치 하이브리드 염색의 대표적인 예는 그림 3-6에 표시됩니다. 감각과 안티 센스 모두 riboprobes은 PC5.1에 해당하는 cDNA를, PC5.2 6 SCL/tal-1 7, GATA-1 8,9, FLK / kdrl 10, 쉿 11 dlx2 12 fkd7에서 합성 하였다 / foxa1 13, 인슐린 14,15, 트립신 16 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용하여 전체 길이의 mRNA의 세그먼트를 증폭하여 구성하고, pCRII-TOPO (I...

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될 수있다<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드. 우리의 향상된 프로토콜은 낮은 비 특정 배경 신호를 낮은 풍부한 성적 검출 할 수 있습니다.

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

이 절차의 전반적인 목표는 단계적 제브라피시 배아 내에서 특정 관심 유전자의 공간적 시간적 발현을 평가하는 것입니다. 이는 시험관 내 전사를 사용하여 연결된 뉴클레오티드에 digo 산소를 통합하여 CD NA 프로브를 먼저 생성함으로써 수행됩니다. 다음으로, 배아는 정의된 발달 단계에서 채취됩니다.진피(corium)를 제거하고 배아를 섭씨 영하 20도의 메탄올에 보관합니다. 그런 다음 소화 및 고정 후 배아를 적절한 프로브와 혼성화합니다. 마지막으로, 배아는 안티드 유전자와 항체로 염색되고 신호는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)에 대한 기질로 발달합니다.궁극적으로, 전체 마운트 제자리 교잡 및 이미징을 통해 주어진 발달 단계에서 유전자 발현의 조직 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 표적 유전자의 정상적인 발현에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있지만, 질병 모델에서 표적 유전자 발현과 같은 다른 조건과 다른 유전자가 과다 또는 과소 발현되는 경우에도 적용할 수 있습니다. 마이크로 주입 기술 사용 관심 유전자에 대한 CDNA를 사용하여 RNA 라벨링 반응을 설정하여 RNA 자유 반응 바이알에서 라벨링된 RNA 프로브에서 1-5마이크로그램의 정제된 템플릿 DNA를 멸균 RNA에 첨가하여 최대 13마이크로리터 용량의 이중 증류수를 합성합니다.얼음 위에서 반응을 식히고 원심분리기 2000 RPM을 실온에서 30초 동안 부드럽게 혼합한 후 다음 시약을 첨가한 후 배양 후 섭씨 37도에서 2시간 동안 반응을 배양하고 2마이크로리터의 RNA를 무료로 첨가하여 템플릿 DNA를 제거합니다. DNA 1은 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하고 0.2 몰 EDTA의 2 마이크로 리터를 첨가하여 반응을 중단하고 4 몰 염화 리튬 2.5 마이크로 리터와 100 % 에탄올 75 마이크로 리터를 첨가하여 반응 생성물을 침전시킵니다. 용액을 섞어 섭씨 영하 20도에서 45분 동안 또는 하룻밤 동안 배양합니다.13, 000 RPM 및 섭씨 4도에서 30분 동안 서스펜션을 원심분리하십시오. 그런 다음 10분 동안 회전한 후 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 펠릿을 세척합니다. 펠릿을 소생시키기 전에 2분 동안 건조시키고 50마이크로리터의 뉴클레아제, 유리 이중 증류수에 현탁시킵니다.그런 다음 30분 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 1% aros 젤에 1-2마이크로리터의 프로브를 약 30분 동안 실행하여 품질과 무결성을 확인합니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 프로브를 정량화하여 이전에 고정되고 동결된 배아를 재수화합니다.1.5ml 마이크로 튜브의 원뿔형 끝을 잘라 바구니를 만드는 것으로 시작합니다. 그런 다음 절반에서 상단 테두리를 제거합니다. 끝을 덮기 위하여 나일론 메시의 작은 조각을 자르고, 그 후에 약간 두건에서, 전기 열판에 관 끝을 가열하고 냉각된 후에 메시로 그(것)들을 누르십시오.여분의 나일론 메쉬를 제거하고 바구니를 실온에서 100% 메탄올에 보관하십시오. PBS에서 메탄올을 연속적으로 희석한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 각각 4밀리리터를 6개의 웰 접시의 웰에 첨가하여 각 프로브에 대한 개별 바구니에 배아를 배치하고 웰당 5분 동안 메탄올 PBS 시리즈에서 배양을 배양한 후 PBST에서 3회 세척한 후 배양합니다. 실온에서 proteinase K로 배아를 투과하고, 발달 단계당 다음 배양 시간을 사용합니다.그런 다음 PBS의 4% 파라폼 알데히드에 배아를 20분 동안 고정하고 PBST에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 아세틸화 혼합물을 준비하고 배아를 각각 10분씩 두 번 배양합니다. 그런 다음 배아와 PBST를 각각 10분씩 두 번 세척합니다.배아를 멸균 마이크로 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 혼성화 혼합물 또는 HM으로 섭씨 70도의 수조에서 2-4시간 동안 배양합니다. 용액에 100-200나노그램의 프로브를 추가하고 수조에서 섭씨 70도에서 밤새 배양합니다. 프로브 용액을 미리 예열된 HM으로 교체하고 샘플을 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다.샘플을 H-M-S-S-C 시리즈에 투입하고 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 차단한 후, 배아를 1-5, 000 희석한 완충기로 배아를 배양 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 교반으로 배아를 배양합니다. 배아를 각각 15분씩 6회 씻습니다. 배아를 염색 한 후 BCIP 및 NBT에서 배양합니다.어둠 속에서 30분 동안 실내 온도를 높입니다. 실체 현미경을 사용하여 30분마다 염색 반응을 모니터링하여 반응을 중지합니다. 배아 바구니를 정지 용액이 들어있는 우물로 옮기고 각각 10분씩 두 번씩 부드럽게 저어줍니다.PBS에서 4% 파라 포름알데히드로 배아를 20분 동안 고정한 후. 배아를 100%글리세롤을 함유한 6개의 웰 플레이트에 가능한 한 적은 PBS로 전달하여 배아를 장착합니다. 실온의 어두운 곳에서 배아를 부드럽게 흔들어 실체 현미경으로 100% 글리세롤로 하룻밤 동안 이미지를 만듭니다.교잡에 대한 제자리(situ) 염색의 대표적인 예가 여기에 나와 있습니다. 관심 있는 ribo probe와의 교잡 후 관찰된 보라색 염색은 특정 유전자의 존재량과 발현 부위를 모두 나타냅니다. 예를 들어, PC 5.1은 수정 후 24시간에 이낭과 원시측의 전방 및 후방 부분에서 매우 불연속적인 발현을 보이며, 수정 후 72시간까지 전방 및 후방 측측 신경 마스트 내에서 강하게 국소화됩니다.이와는 대조적으로, PC 5.2는 중추신경계 내에서 유비쿼터스 발현을 보여주며, 솜털 소포 및 엎드린 소낭 내에서 뚜렷한 국소화를 보이며, 수정 후 96시간이 지나면 간과 장 내에서 많이 발현됩니다. 각각의 sense Ribo 프로브를 사용할 때 유전자 발현이 없는 것은 여기에서 볼 수 있듯이 음성 대조군으로 작용합니다. 혈액 마커의 발현 분석은 양측 두개골 세포 및 중간 세포 덩어리 또는 ICM에서 SCL T one의 염색을 보여주었습니다.gata one에 대한 염색은 ICM 내에서도 볼 수 있지만 발현 패턴은 다릅니다. F-L-K-K-D-R-L의 발현은 뒷뇌 주혈관 및 분절간 혈관 내에서 관찰되었으며, ICM에서는 음파 고슴도치에 대한 염색이 탯줄이 없는 혈관에서 관찰되었습니다. 이러한 예에서, 수정 후 34시간에 DLX 2의 발현은 Talon, Cephalon, 시상하부, 두개골 중간엽궁에 국한되어 있으며, 수정 후 24시간에 1개의 발현은 주로 바닥판과 HypoChlor 발현에서 볼 수 있습니다.췌장 마커의 패턴은 내분비 췌장에서 인슐린 염색을, 외분비 췌장에서 트립신을 보여주었습니다. 고해상도의 발현 패턴을 보여주는 결과는 표시된 고농도 유전자와 저농도 유전자의 발현을 모두 검출하기 위해 개략적인 프로토콜의 성공을 확인합니다. 다음은 몇 가지 최적의 조건에서 수행된 실험의 몇 가지 예입니다.예를 들어, 음파 고슴도치 발현이 좋지 않은 높은 배경 신호는 섭씨 55도에서 60도 사이의 부적절하고 투과성 및 혼성화로 인해 발생했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 도랑 표지된 RNA 프로브, 혼성화 후 염색 및 이미징을 사용하여 얼룩말 물고기 배아의 두 가지 혼성화에서 전체 마운트를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

배우세요 제자리 하이브리드화를 통해 Danio rerio 배아에서 특정 유전자의 시공간적 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 저발현 전사체 검출과 배경 신호 감소에 효과적입니다.

높은 해상도 전체 마운트

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