Name: 문화의 세포에 대한 생존 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 세포 생존 분석 방법으로 ATP 측정과 적외선 형광 면역염색을 결합하여 대사 기능과 구조적 무결성을 동시에 평가하는 종합적인 세포 건강 평가 기법을 익히세요.

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우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.

저자 중에 공개 할 충돌이 없습니다.

우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에​​ 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 영향을 밝혀 잘 일치합니다. 이 두 분석으로 적외선 신호의 투여 량 - 반응 손실이고 세 생존 곡선은 N-아세틸 시스테인으로 오른쪽으로 시프트 하였다. α-튜 불린과 ATP 분석이 DRAQ5 + 사파이어 분석 (Unnithan 등의 그림 4 참조보다 암모늄 클로라이드 등의 화합물에 더 민감하게 반응하는 것 등이 중첩는 항상 N2A 세포 치료의 모든 종류의 관찰되지 않습니다. 8 ). 따라서, 생존 phenotypES는 항상 동일하게 세 가지 분석으로 표시되지 않습니...

생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 &quot;시험관&quot;또는 &quot;문화&quot;로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 - (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값의 연결을 풀기는 ATP와 MTT 분석이 유일한 생존 분석으로 사용하지 말아야하는 것이 좋습니다. 본 보고서에서는, 세포 구조와 대사 기능을 모두 조사 세 생존 분석은 감당할 수있는 그 자체로 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 뷰에 대해 설명합니다. 우리의 분석의 두 개는 700과 800 nm의 채널에서 형광을 측정하는 적외선 이미 저를 필요로합니다. 잡음은 높은 신호 - 대 - 잡음 비 (3)에 이르는, 적외선 파장에서 낮다. 우리가 사용하는 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위와 16 translatin의 비트 깊이적외선의 2 (16) 또는 65,536 그늘에 g. 이뿐만 아니라, 각각의 파장에 대해 색이 8 또는 256 음영을 수득 8 비트 컬러 이미징, 대조 할 수있다. 따라서, 16​​ 비트 영상은 미세한 해상도를 가지고 있습니다. 원래 적외선 이미지는 종종 프레젠테이션 게시 된 보고서에 (800 NM)과 적색 (700 nm의) 녹색 모조 착색되는 것을 주목해야한다. 오디세이 화상 카메라는 일반적으로 웨스턴 블로 팅과에서 셀 서부 4-7 모두에 사용됩니다. 에서 셀 포름 알데히드 고정 된 세포에 서부는 관심의 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 적외선 형광 보조 항체 차례로 레이블을 지정. 이 기술은 인산화 엔드 포인트 6에 특히 유용한 것으로 알려져있다. 우리의에서 셀 서부에서, 우리는 세포 골격 단백질 α-튜 불린 또는 800 nm의 채널에서 신경 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)에 대한 고정 된 세포를 얼룩. 이들 단백질은 높은 신호 - 대 - 잡음 비를 수득 할 정도로 풍부하다. 우리는 또한 700에있는 우리의 판을 얼룩DRAQ5의 얼룩과 사파이어 얼룩 세포질에 대한 핵에 대한 나노 채널. 세포 골격 단백질과 DRAQ5 + 사파이어 얼룩 두 따라서 세포 구조를 반영합니다. 제 생존력 분석은 대사 기능을 측정하여 호출 &quot;셀 역가 글로.&quot;이 루시페라아제 기반 분석에서, 발광 값 ATP 농도에 정비례한다. ATP 분석은 일반적으로 가능한 세포에게 8-12을 정량화하는 데 사용됩니다. 셀 당 ATP 출력 독소 치료의 함수로 변경할 수 있기 때문에, 분석의 이름으로 단어 &quot;역가&quot;를 포함하는 것은 다소 명칭이 잘못된 것입니다 및 휴대폰 번호 8에 비례하므로 항상이다. ATP 농도는 13 시간주기 리듬에 의해 세포 분열 (14) 및 세포 분화 (15)에 의해 영향을받을 수있다. ATP 대사의 강력한 측정하기 때문에 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된 ATP 분석을 수행 간단하고 유용합니다생존 16-21, 자체 수를 셀하지 않을 경우. 서부 따라서 혼자 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 사진을 얻을 수에서 셀 적외선을 보완하기 위해이 분석을 사용하여.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>더 비싼 10ml 수량을 구입하는 대신 100ml 수량과 부분 표본으로 구입하십시오. 재구성되고 사용되지 않은 시약은 -20°C에서 재동결할 수 있습니다. C 최소 21 주 동안</td></tr><tr><td>18 % 포르말린</td><td>써모 샨돈</td><td>9990244</td><td>이 정착제를 구입하면 포름 알데히드 분말의 무게가 측정되고 용액이 끓는 것을 피할 수 있습니다. 증기에 대한 노출은 그로 인해 최소화됩니다</td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S0389</td><td>포름 알데히드 용액에 이것을 첨가하는 것은 필수적이지는 않지만 고정 세포의 외관을 향상시킵니다</td></tr><tr><td>오디세이 블록</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>이 피쉬 세럼은 대량으로 구매하고 -20 &deg에서 동결할 수 있습니다; 장기 사용을 위한 C</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>우리는 10% Triton-X 100의 원액을 4°C의 멸균수에 저장합니다. C</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>피셔</td><td>S468</td><td>PBS 정제 또는 10x PBS 용액도 구입할 수 있지만 더 비쌉니다</td></tr> 인<tr><td>산나트륨 이염기성</td><td>피셔</td><td>S373</td><td>위 참조</td></tr><tr><td>아지드화나트륨 (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>아지드화나트륨은 독성이 매우 강하므로 분말을 구입하지 마십시오. 우리는 사용한 모든 항체를 1x 아지드화나트륨에 4°C로 저장합니다. C 파편으로 오염될 때까지</td></tr><tr><td>마우스 안티-알파;-튜불린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>이 항체는 비싸지만 크게 희석될 수 있으며 특이성이 매우 높습니다</td></tr><tr><td>마우스 anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>이 항체는 비싸지만 특이성이 높습니다(In-Cell Westerns의 전제 조건)</td></tr><tr><td>800nm 염소 안티-마우스 IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>다른 회사들도 적외선 2차 항체를 판매합니다. 고도로 교차 흡착된 항체를 구입하고 IgG의 농도가 소스 DRAQ5 Bio DR50200 status에 따라 다를 수 있다는 점에 유의하십시오.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>이 화합물은 LI-COR에 의해 1mM</td></tr><tr><td>사파이어</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 다중 라벨 카운터</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>에서 판매되었습니다.9201-01</td><td></td></tr><tr><td>셰이커/믹서</td><td>연구 제품 국제</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

Viability Assays for Cells in Culture

현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 - 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.

이들 실험에서 속도 제한 요인은 ATP 분석이 비교적 짧은 기간이기 때문에, 적외선 염색법이다. 적외선 분석을 위해, 우리는 여덟 96 - 웰 플레이트 (그림 1 참조) 4 판 각각의 압도적 인 두 개의 일괄 처리에 의해 하루 만에 염색 검사 할 수 있다는 것을 기대하고 있습니다. 이 추정은 고정의 20 분을 가정, 세탁 30 분, 세척의 3​​0 분 뒤에 2 시간 차 항체 배양을 차단 30 분, 액체의 30 분 뒤에 1 시간 차 항체 배양은 30 분 DRAQ5는 + 사파이어 30 다음 세척, 4 판에 대한 스캔 시간의 34 분의 분. 열 다섯 추가 분은 네 개의 개별 판의 엇갈린 피펫을 설명하기 위해 세척 그림 1에 반영됩니다. 데이터 분석을위한 시간이 추정에 포함되지 않습니다. ATP 분석 측정은 모든 적외선 플레이트 병렬로 발생하는 경우, 열두 판은 하루에 정량 할 수있다 - 적외선 얼룩 여섯s와 ATP 수준에 대한 여섯. <p class="jove_co...

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

이 절차의 전반적인 목적은 단일 분석법만으로는 얻을 수 없는 세포 적합성에 대한 보다 종합적인 관점을 제공하기 위해 다각적인 생존능 분석을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 도말된 세포의 ATP 수치를 측정하여 대사 기능을 평가합니다. 두 번째 단계는 800 nm 파장의 적외선 항체를 사용하여 alpha tubulin 또는 microtubule-associated protein 2와 같은 세포골격 단백질을 면역 염색하는 것입니다.다음으로, 700 nm에서 핵과 세포질을 염색하기 위해 infrared drac five와 sapphire로 세포를 표지합니다. 마지막 단계는 적외선 이미저를 사용하여 alpha tubulin 또는 map two, 그리고 drac five와 sapphire를 700 nm 및 800 nm 파장에서 모두 촬영하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 발광 및 적외선 분석은 해부학적 구조와 생리적 기능 모두에 대한 정보를 제공합니다.MTT 생존능 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이러한 기술의 주요 장점은 세포 무결성의 여러 측면을 신속하고 민감하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법은 치료 화합물이 해부학적 구조와 대사 기능을 보호할 수 있는지와 같이 신경과학 및 약리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 동봉된 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에 다양한 세포 밀도로 100 또는 200 µL의 배지에서 세포를 수확하고 재팽창시키기 시작하려면, 가장자리 증발 효과를 줄이기 위해 주변 웰에 200 µL의 멸균수를 채우십시오.세포를 CO2 버퍼 처리된 인큐베이터에서 37°C로 하룻밤 동안 부착시킵니다. 다음 날, 각 웰에 50 µL의 배지가 남도록 100 µL의 배지 중 50 µL를 제거하거나, 200 µL의 배지 중 150 µL를 제거합니다. 그 다음, 2열부터 6열까지의 내부 웰에 cell titer glow 시약 25 µL를 각각 첨가합니다.7~11열 B~D행의 1:2 희석액을 얻으려면, 나머지 웰인 7~11열 E~G행에 Cell Titer-Glo 시약 50 µL를 첨가하여 1:1 희석액을 만듭니다. 배지를 제거하지 말고, Cell Titer-Glo 시약 100 µL를 추가하여 총 부피 200 µL의 1:1 희석액을 만듭니다. 즉시 플레이트를 진탕기 또는 궤도형 쉐이커(orbital shaker)에 올리고 10분 동안 배양하며 샘플을 혼합합니다.그런 다음 각 웰에서 60 µL를 흰색 벽 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 흰색 플레이트는 빛을 검출기 방향 위쪽으로 반사하므로 투명하거나 검은색 플레이트보다 발광 값이 더 높게 나타납니다. 옮기는 과정에서 기포가 발생하면 플라스틱 전송 피펫 벌브의 강제 공기를 사용하여 제거하십시오.그런 다음 시약을 첨가한 후 12분 이내에 플레이트를 루미노미터(luminometer)에 놓고 발광 값을 측정합니다. 각 그룹의 3개 또는 6개 웰에서 얻은 발광 값의 평균을 내고, 이를 세포 수의 함수로 도식화하십시오. 동봉된 텍스트에 정의된 대로 선형적이고 비례적인 결과가 여전히 나타나는 가장 높은 시약 희석 배수를 사용하여 진행하십시오. 이렇게 하면 적외선 분석 비용을 절감할 수 있으며, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 회수하고 서로 다른 밀도로 재현탁하십시오.온도 구배와 가장자리 증발 효과를 줄이기 위해 주변 웰을 200 µL의 멸균수로 채웁니다. 세포를 37 °C의 CO2 버퍼 인큐베이터에서 하룻밤 동안 부착시킨 후, 0.1 M 인산 버퍼에 4% formaldehyde와 4% sucrose가 포함된 고정액 100 µL를 첨가하여 세포를 고정합니다. 플레이트를 상온에서 20분 동안 배양한 다음, 고정액을 제거하고 200 µL의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.다음으로, 블로킹 용액을 PBS로 1:1 비율로 희석하고 세포 투과제로서 0.3% Triton X 100을 첨가합니다. 그 후, 웰 내에 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 웰에 블로킹 용액 35 µL를 넣습니다. 블로킹 용액이 담긴 플레이트를 상온에서 30~60분 동안 배양합니다.이 배양 단계 동안, 표적 단백질에 대한 1차 항체를 희석합니다. 예를 들어, 절차 최적화 테스트를 수행하는 동안 Antifa tubulin 1차 항체를 블로킹 버퍼와 0.3% TRITTON X 100이 포함된 PBS를 1:1 비율로 혼합한 용액에서 1:10,000으로 희석합니다. 추가적인 항체 희석 조건으로, Antifa tubulin 1차 항체를 블로킹 버퍼와 0.3% Triton X 100이 포함된 PBS의 1:1 혼합액에서 1:5,000으로 희석하기도 합니다.다음으로, 플레이트에 고정된 세포에 여기에 표시된 농도의 항체를 첨가합니다. 두 번째 열의 음성 대조군 웰은 2차 항체에만 노출될 예정이므로 블로킹 용액 상태로 유지하십시오. 세포를 1차 항체와 함께 실온에서 1~2시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 1차 항체 배양 후 블로킹 버퍼와 0.3% Triton X 100이 포함된 PBS를 1:1 비율로 혼합한 용액에 800 nanometer 항-마우스 IgG 2차 항체를 1:1000 또는 1:2000 비율로 희석하여 준비합니다. 각 웰에 200 µL의 PBS를 넣고 10분씩 3회 세척합니다. 그 후, 각 웰에 35 µL의 2차 항체를 첨가합니다.1:1000 희석액을 플레이트의 상단 절반에, 1:2000 희석액을 하단 절반에 첨가하십시오. 빛을 차단한 상태로 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 세포를 배양하십시오. 그 후, 웰당 200 µL의 PBS로 10분씩 3회 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거하십시오.다음으로, DRAC five 스톡은 최종 농도가 0.5 micromolar가 되도록 1:10,000로 희석하고, sapphire 스톡은 0.3% Triton X 100이 포함된 PBS에서 1:1,000로 희석합니다. 이 혼합물 35 microliters를 플레이트의 왼쪽 절반에 첨가하되, 2열의 음성 대조군 웰에는 아무것도 첨가하지 마십시오. 플레이트의 오른쪽 절반에는 1:20,000로 희석한 drac five와 1:2,000로 희석한 sapphire를 각각 35 microliters씩 첨가합니다.빛이 차단된 상온에서 이 용액들에 30분 동안 배양합니다. 그 후 각 웰당 200 microliters의 PBS로 플레이트를 3회, 매회 10분씩 세척합니다. 강도 5, 해상도 169 microns 설정으로 적외선 이미저에서 플레이트 스캔을 시작합니다.중간 품질 또는 낮은 품질 설정으로도 충분합니다. 그런 다음 2.5 millimeters, 3.0 millimeters, 3.5 millimeters, 4.0 millimeters의 서로 다른 초점 오프셋으로 스캔하여 가장 높은 신호 대 잡음비와 선명한 신호가 얻어지는 지점을 확인하십시오. 초점 오프셋이 최적화되면, 소프트웨어의 인셀 웨스턴(incel western) 기능을 사용하여 플레이트 이미지 위에 적절한 크기의 그리드를 배치하고 데이터를 Microsoft Excel로 내보내십시오.음성 대조군 웰의 적분 강도 평균값을 700 및 800 나노미터 채널의 모든 해당 데이터 포인트에서 뺍니다. 그런 다음 각 웰 그룹에 대해 적분 신호 강도의 평균을 구하고, 최적화 후 세포 밀도에 따른 산점도로 데이터를 도식화합니다. 세 가지 분석 모두에서 신호 강도는 웰당 세포 수와 유의미한 상관관계를 보였으며, 세 분석 모두 높은 선형성을 나타냈으나 민감도는 동일하지 않았습니다.ATP 분석법은 쥐 일차 신경 세포에서 세포 수 감소에 따른 발광 출력의 변화가 가장 비례적으로 나타나, 세 가지 분석법 중 가장 높은 민감도를 보였습니다. 최적 시약 농도는 서로 달랐으며, 분석 전 범위에 걸쳐 선형성은 낮게 나타났습니다. 하지만 여기 제시된 100,000 cells 미만의 도말 밀도에서는 두 분석법 모두 선형성과 민감도가 확보되었습니다.글루타치온 전구체이자 아세틸시스테인인 N-아세틸시스테인의 존재 여부에 따라 프로테아좀 억제제 MG 1 32를 처리한 신경모세포종 세포의 용량 반응 곡선을 확인한 결과, N-아세틸시스테인은 세 개의 곡선을 모두 오른쪽으로 이동시켰습니다. 예를 들어, DRAC five plus sapphire로 측정한 IC 50 값은 N-아세틸시스테인이 없을 때 1.64 µM MG 1 32였으며, N-아세틸시스테인이 있을 때는 4.64 µM MG 1 32였습니다. 이는 알파-튜불린 분석에서 각각 1.96 µM 및 6.35 µM MG 1 32로 나타난 수치와 유사했습니다.그러나 MG 1 32의 낮은 농도에서 ATP 수준이 상승했는데, 이는 호르메시스(hormesis)라고 불리는 현상입니다. 이러한 데이터는 처리 시 ATP 수준이 반드시 세포 농도에 비례하는 것은 아니며, N-Acetyl cysteine 또한 대사 기능을 보호할 수 있음을 보여줍니다. 발광 ATP 분석법을 숙달하면 30분 이내에 완료할 수 있으며, 적외선 염색은 8시간 이내에 쉽게 완료할 수 있습니다.이 절차들을 수행할 때, 고해상도 현미경과 동일한 방식으로 세포 수를 측정하는 것이 아니라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 한 가지 주의할 점은 세포 수의 병행 변화 없이도 처리 과정에 의해 alpha tubulin 단백질 수준이나 TP 수준이 변할 수 있다는 것입니다.

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연구

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배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주의 세포독성 평가에 적합한 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(Alamar Blue[AB], CFDA-AM, Neutral Red 및 MTT 분석)을 제시합니다.

Zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석

여기에서는 효모 샘플에서 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 원형질막 무결성을 정량화하기 위해 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)이라는 두 가지 형광 염료를 사용합니다. 유세포 분석을 사용하여 산화 후 스트레스 샘플에 대한 살아있는 세포, 죽은 세포 및 손상된 세포 분획에 대한 정량적이고 재현 가능한 추정치를 제공합니다.

효모 세포의 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 유세포 분석법과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석

배우세요 세포 생존 분석 방법으로 ATP 측정과 적외선 형광 면역염색을 결합하여 대사 기능과 구조적 무결성을 동시에 평가하는 종합적인 세포 건강 평가 기법을 익히세요.

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