문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

이 절차의 전반적인 목표는 하나의 분석법이 단독으로 감당할 수 있는 것보다 더 포괄적인 세포 적합성을 제공하는 여러 생존력 분석을 수행하는 것입니다. 이는 대사 기능을 평가하기 위해 먼저 도금된 세포의 A TP 수준을 측정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 800나노미터 파장의 적외선 항체를 사용하여 알파 튜불린 또는 마이크로 튜블러 관련 단백질 2와 같은 세포골격 단백질을 면역염색하는 것입니다.

다음 세포는 적외선 drac 5 및 사파이어로 표지되어 700나노미터에서 핵과 세포질을 염색합니다. 마지막 단계는 적외선 이미저에서 700 및 800 나노미터 파장 모두에서 알파 튜불린을 이미지화하거나 2와 drac five plus 사파이어를 매핑하는 것입니다. 궁극적으로 이러한 발광 및 적외선 분석은 해부학적 구조와 생리학적 기능 모두에 대한 정보를 제공합니다.

MTT 생존력 분석과 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 세포 무결성의 여러 측면을 빠르고 민감하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법은 치료 화합물이 해부학적 구조와 대사 기능을 보호할 수 있는지 여부와 같은 신경 과학 및 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 함께 제공된 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에서 다양한 세포 밀도로 100 또는 200마이크로리터의 배지에서 세포를 수확하고 재분해하려면 가장자리 증발 효과를 줄이기 위해 주변 웰에 200마이크로리터의 멸균수를 채웁니다.

세포를 CO2 완충 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 밤새 접착시킵니다. 다음 날, 100마이크로리터의 미디어 중 50개 또는 200마이크로리터의 미디어 중 150개를 제거하여 각 웰에 50마이크로리터의 미디어가 남도록 합니다. 다음으로, 25마이크로리터의 세포 역가 글로우 시약을 2열에서 6열까지의 각 내부 웰에 추가합니다.

B열에서 D까지 7열에서 11열까지 1-2개의 희석을 얻으려면 50마이크로리터의 세포 역가 글로우 시약을 추가하여 나머지 웰에서 1-1 희석을 얻습니다. E열부터 11열까지 7열부터 11열 G.Do 매체를 제거하지 않고 대신 100마이크로리터의 세포 역가 글로우 시약을 추가하여 총 200마이크로리터의 부피에서 일대일 희석을 얻습니다. 즉시 플레이트를 돌연변이 또는 궤도 셰이커에 10분 동안 올려 놓고 배양하는 동안 샘플을 혼합합니다.

그런 다음 각 웰에서 60마이크로리터를 흰색 벽으로 된 96으로 옮깁니다. 웰 플레이트 발광 값은 투명 또는 검은색 플레이트보다 흰색 플레이트에서 더 높은데, 이는 빛을 검출기를 향해 위쪽으로 반사하기 때문입니다. 전사 중에 기포가 형성되면 플라스틱 전사 피펫 전구에서 강제 공기를 사용하여 거품을 터뜨립니다.

그런 다음 시약을 첨가 한 후 12 분 이내에 플레이트를 광도계에 놓고 발광 값을 읽습니다. 각 그룹에 있는 3개 또는 6개의 웰에서 발광 값의 평균을 구하고 세포 수의 함수로 플롯하고, 함께 제공된 텍스트에 정의된 대로 선형 및 비례 결과를 제공하는 시약의 가장 높은 희석으로 진행합니다. 이렇게 하면 적외선 분석 비용을 절감하고, 세포를 수확하고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 밀도로 재결합할

주변 우물을 200마이크로리터의 멸균수로 채워 가장자리를 따라 온도 구배 및 증발의 영향을 줄입니다. CO2 완충 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 고착시킨 다음 0.1 몰 인산염 완충액에 4% 포름알데히드 및 4% 자당과 같은 100마이크로리터의 고정액을 첨가하여 세포를 고정합니다. 플레이트를 배양하고 실온을 20분 동안 추가한 다음 고정제를 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.

다음으로, PBS에서 차단 용액을 일대일로 희석하고 0.3% Triton X 100을 투과성 세포로 첨가합니다. 그런 다음 35마이크로리터의 차단 용액을 각 웰에 첨가하고 웰에 기포가 형성되지 않도록 주의합니다. 실온에서 30-60분 동안 차단 용액으로 플레이트를 배양합니다.

이 배양 중에 관심 단백질에 대한 1차 항체를 희석합니다. 예를 들면, 절차 시험을 낙관하고 있는 동안 막는 완충액과 PBS의 1:1 혼합물에서 Antifa tubulin 1 차적인 항체, 1에서 10, 000를 0.3%TRITTON X 100로 희석하십시오. 추가 항체 희석 여기서, Antifa tubulin 1 차 항체는 또한 0.3 % Triton X 100을 가진 막는 완충액과 PBS의 1 대 1 혼합물에서 1에서 5, 000으로 묽게 된다.

다음으로, 여기에 표시된 농도의 항체를 플레이트에 고정된 세포에 추가합니다. 차단 용액의 2열에 있는 negative control well은 2차 항체에만 노출되므로 그대로 두십시오. 1차 항체의 세포를 실온에서 1-2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 1차 항체 배양 후 800 나노미터 항 마우스 IgG 2차 항체를 0.3% Triton X 100과 함께 차단 완충액과 PBS의 일대일 혼합물에 1 - 1000 또는 1 - 2000으로 희석하여 준비합니다. 우물을 10분 동안 세 번 세척하고 각각 200마이크로리터의 PBS로 세척합니다. 그런 다음 35마이크로리터의 2차 항체를 웰에 추가합니다.

플레이트의 위쪽 절반에 1에서 1000 희석을 추가하고 아래쪽 절반에 1에서 2000 희석을 추가합니다. 2차 항체의 세포를 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 매번 웰당 200마이크로리터를 사용하여 PBS를 10분 동안 3회 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 씻어냅니다.

다음으로, 0.5 마이크로몰의 최종 농도를 위해 DRAC 5 주식을 1에서 10, 000으로 희석하고 사파이어 주식을 0.3%Triton X 100으로 PBS에서 1에서 1000으로 희석합니다. 이 혼합물 35마이크로리터를 플레이트의 왼쪽 절반에 추가하되 2열의 음극 대조군 웰에는 아무 것도 추가하지 마십시오. 플레이트의 오른쪽 절반에는 35 마이크로 리터의 drac 5를 희석 한 1을 20, 000으로, 사파이어를 희석하여 1을 2000으로 추가합니다.

이 용액에서 빛을 피해 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 그런 다음 웰당 200마이크로리터의 PBS로 플레이트를 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 먼저 적외선 이미저의 플레이트를 강도 5와 169미크론의 해상도로 스캔합니다.

중간 품질 또는 낮은 품질 설정이면 충분합니다. 그런 다음 2.5mm, 3.0mm, 3.5mm 및 4.0mm의 다양한 초점 오프셋에서 스캔하여 가장 높은 신호 대 잡음비와 크리스퍼스 신호가 달성되는 위치를 확인합니다. 초점 오프셋이 최적화되면 소프트웨어에서 인셀 웨스턴 기능을 사용하여 플레이트 이미지에 올바른 크기의 그리드를 배치하고 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다.

700 및 800 나노미터 채널의 모든 해당 데이터 포인트에서 음의 대조군 웰에 있는 적분 강도의 평균을 뺍니다. 그런 다음 각 웰 그룹에 대한 적분 신호 강도의 평균을 구하고 최적화 후 셀 밀도에 대한 산점도 플롯으로 데이터를 플로팅합니다. 세 가지 분석 모두에서 신호 강도는 웰당 세포 수와 유의한 상관관계가 있었으며, 세 가지 분석 모두 매우 선형적이었지만 감도가 동일하지 않았습니다.

A TP 분석은 쥐의 1차 신경 세포에서 세포 수의 감소와 함께 발광 출력의 가장 비례적인 변화로 정의되는 세 가지 중 가장 높은 감도를 보여주었습니다. 최적의 시약 농도는 달랐고 분석은 분석의 전체 범위에서 더 적은 선형성을 나타냈습니다. 그러나, 분석실험은 여기에 표시된 100, 000 세포 미만의 도금 밀도에서 선형적이고 민감했습니다.

글루타티온 전구체와 아세틸 시스테인 N, 아세틸 시스테인이 모두 오른쪽으로 이동함에 따라 프로테아좀 억제제인 MG 1 32를 투여한 신경모세포종 세포의 용량 반응 곡선을 적용했습니다. 예를 들어, DRAC five plus 사파이어로 측정한 IC 50은 n-아세틸시스테인이 없는 경우 1.64마이크로몰 MG 1 32, N-아세틸시스테인이 없는 경우 4.64마이크로몰 MG 1 32였습니다. 이는 각각 1.96 마이크로몰 및 6.35 마이크로몰의 MG 1 32의 알파 튜불린 분석에서 발견된 값과 유사했습니다.

그러나, TP 수치는 MG 1 32의 낮은 농도에서 상승했으며, 이는 호르메시스(hormesis)라고 불리는 현상이다. 이러한 데이터는 TP 수치가 치료 시 세포 역가에 반드시 비례하는 것은 아니며 N-아세틸 시스테인도 대사 기능을 보호할 수 있음을 보여줍니다. 발광을 마스터하면 TP 분석은 30분 이내에 완료할 수 있으며 적외선 염색은 8시간 이내에 쉽게 완료할 수 있습니다.

이러한 절차를 시도하는 동안 고해상도 현미경과 같은 방식으로 세포 수를 측정하지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 한 가지 주의 사항은 알파 튜불린 단백질 수치 또는 TP 수치가 세포 수의 평행 변화가 없는 경우 치료에 의해 변경될 수