Name: 문화의 세포에 대한 생존 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 세포 생존 분석 방법으로 ATP 측정과 적외선 형광 면역염색을 결합하여 대사 기능과 구조적 무결성을 동시에 평가하는 종합적인 세포 건강 평가 기법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 ATP 분석에서 시약의 볼륨에 저장하는 아이디어 Juliann Jaumotte을 인정합니다. 우리는이 연구에 대한 재정 지원을 제공하는 메리 카루소, 뎁 WILLSON, 재키 파러의 약학 Mylan는 학교에 최상의 행정 지원에 대한 깊이 감사하고 있습니다. 감사는 또한 Hunkele 두려워한 질환 재단과 파킨슨 병 및 운동 장애 차 신경 세포 연구의 재정적 지원을위한 재단에 기인한다.

저자 중에 공개 할 충돌이 없습니다.

우리는 세 가지 생존 분석의 신호 강도가 선형 및 도금 밀도와 상관 관계가 있음을 발견했다. 그러나, 모든 분석은 2 배 또는 도금 밀도의 1.5 배의 변화에​​ 동등하게 구분합니다. N2A 세포의 경우, 적외선 분석은 특히 낮은 도금 밀도에서, ATP 분석보다 덜 민감하다. 적외선 분석이 ATP보다 덜 민감하지만, DRAQ5 + 사파이어 분석 및 α-튜 불린 분석은 그들이 N-아세틸 시스테인의 높은 보호에 미치는 영향을 밝혀 잘 일치합니다. 이 두 분석으로 적외선 신호의 투여 량 - 반응 손실이고 세 생존 곡선은 N-아세틸 시스테인으로 오른쪽으로 시프트 하였다. α-튜 불린과 ATP 분석이 DRAQ5 + 사파이어 분석 (Unnithan 등의 그림 4 참조보다 암모늄 클로라이드 등의 화합물에 더 민감하게 반응하는 것 등이 중첩는 항상 N2A 세포 치료의 모든 종류의 관찰되지 않습니다. 8 ). 따라서, 생존 phenotypES는 항상 동일하게 세 가지 분석으로 표시되지 않습니...

생물 과학에서 가장 일반적인 생존 분석은 세포 수를 포함한다. 이것은 2013년 4월 29일 및 2013년 4월 30일의 키워드 중 하나 &quot;시험관&quot;또는 &quot;문화&quot;로 PubMed를 등장 최고 (가장 최근) (200) 출판물의 분석에 의해 입증된다. 이 간행물의 수동 세포 수의 계산을 포함하여 23.5 % 사용하는 세포 수의 분석은 자동화 된 세포 수는 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산하고 트리 판 블루 배제. 라이브 / 데드 분석은이 책의 1 %에 사용되었다. MTT (3 - (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드)하여 출판물의 개수 대사 생존력에 대한 분석은 11 %였다. 문학의이 조사는 또한 세포 수의 분석과 함께 같은 MTT 등의 분석을 사용하여 출판물의 수는 3.5 %였다 있음을 보여줍니다. 휴대폰 번호와 함께 세포 기능을 평가, 그 자체로 하나의 생존 분석을 사용하는 추세는 휴대 전을 평가하기위한 최선의 선택을 보인다에도 불구하고ntegrity. 나머지 세포가 기능 또는 그들이 잘 1,2에 존재에도 불구하고 건강한 수없는 경우가 있기 때문에 그 자체로 세포 수는 충분하지 않다. 반대로, 같은 ATP와 같은 기능적 수단 증가 또는 세포의 수가 병렬 변화의 부재에서 저하 될. 휴대폰 번호에서 대사 판독 값의 연결을 풀기는 ATP와 MTT 분석이 유일한 생존 분석으로 사용하지 말아야하는 것이 좋습니다. 본 보고서에서는, 세포 구조와 대사 기능을 모두 조사 세 생존 분석은 감당할 수있는 그 자체로 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 뷰에 대해 설명합니다. 우리의 분석의 두 개는 700과 800 nm의 채널에서 형광을 측정하는 적외선 이미 저를 필요로합니다. 잡음은 높은 신호 - 대 - 잡음 비 (3)에 이르는, 적외선 파장에서 낮다. 우리가 사용하는 오디세이 화상 카메라는 4.5 로그 동적 범위와 16 translatin의 비트 깊이적외선의 2 (16) 또는 65,536 그늘에 g. 이뿐만 아니라, 각각의 파장에 대해 색이 8 또는 256 음영을 수득 8 비트 컬러 이미징, 대조 할 수있다. 따라서, 16​​ 비트 영상은 미세한 해상도를 가지고 있습니다. 원래 적외선 이미지는 종종 프레젠테이션 게시 된 보고서에 (800 NM)과 적색 (700 nm의) 녹색 모조 착색되는 것을 주목해야한다. 오디세이 화상 카메라는 일반적으로 웨스턴 블로 팅과에서 셀 서부 4-7 모두에 사용됩니다. 에서 셀 포름 알데히드 고정 된 세포에 서부는 관심의 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 적외선 형광 보조 항체 차례로 레이블을 지정. 이 기술은 인산화 엔드 포인트 6에 특히 유용한 것으로 알려져있다. 우리의에서 셀 서부에서, 우리는 세포 골격 단백질 α-튜 불린 또는 800 nm의 채널에서 신경 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)에 대한 고정 된 세포를 얼룩. 이들 단백질은 높은 신호 - 대 - 잡음 비를 수득 할 정도로 풍부하다. 우리는 또한 700에있는 우리의 판을 얼룩DRAQ5의 얼룩과 사파이어 얼룩 세포질에 대한 핵에 대한 나노 채널. 세포 골격 단백질과 DRAQ5 + 사파이어 얼룩 두 따라서 세포 구조를 반영합니다. 제 생존력 분석은 대사 기능을 측정하여 호출 &quot;셀 역가 글로.&quot;이 루시페라아제 기반 분석에서, 발광 값 ATP 농도에 정비례한다. ATP 분석은 일반적으로 가능한 세포에게 8-12을 정량화하는 데 사용됩니다. 셀 당 ATP 출력 독소 치료의 함수로 변경할 수 있기 때문에, 분석의 이름으로 단어 &quot;역가&quot;를 포함하는 것은 다소 명칭이 잘못된 것입니다 및 휴대폰 번호 8에 비례하므로 항상이다. ATP 농도는 13 시간주기 리듬에 의해 세포 분열 (14) 및 세포 분화 (15)에 의해 영향을받을 수있다. ATP 대사의 강력한 측정하기 때문에 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된 ATP 분석을 수행 간단하고 유용합니다생존 16-21, 자체 수를 셀하지 않을 경우. 서부 따라서 혼자 하나 분석보다 세포의 무결성을보다 포괄적 인 사진을 얻을 수에서 셀 적외선을 보완하기 위해이 분석을 사용하여.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>더 비싼 10ml 수량을 구입하는 대신 100ml 수량과 부분 표본으로 구입하십시오. 재구성되고 사용되지 않은 시약은 -20°C에서 재동결할 수 있습니다. C 최소 21 주 동안</td></tr><tr><td>18 % 포르말린</td><td>써모 샨돈</td><td>9990244</td><td>이 정착제를 구입하면 포름 알데히드 분말의 무게가 측정되고 용액이 끓는 것을 피할 수 있습니다. 증기에 대한 노출은 그로 인해 최소화됩니다</td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S0389</td><td>포름 알데히드 용액에 이것을 첨가하는 것은 필수적이지는 않지만 고정 세포의 외관을 향상시킵니다</td></tr><tr><td>오디세이 블록</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>이 피쉬 세럼은 대량으로 구매하고 -20 &deg에서 동결할 수 있습니다; 장기 사용을 위한 C</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>우리는 10% Triton-X 100의 원액을 4°C의 멸균수에 저장합니다. C</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>피셔</td><td>S468</td><td>PBS 정제 또는 10x PBS 용액도 구입할 수 있지만 더 비쌉니다</td></tr> 인<tr><td>산나트륨 이염기성</td><td>피셔</td><td>S373</td><td>위 참조</td></tr><tr><td>아지드화나트륨 (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>아지드화나트륨은 독성이 매우 강하므로 분말을 구입하지 마십시오. 우리는 사용한 모든 항체를 1x 아지드화나트륨에 4°C로 저장합니다. C 파편으로 오염될 때까지</td></tr><tr><td>마우스 안티-알파;-튜불린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>이 항체는 비싸지만 크게 희석될 수 있으며 특이성이 매우 높습니다</td></tr><tr><td>마우스 anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>이 항체는 비싸지만 특이성이 높습니다(In-Cell Westerns의 전제 조건)</td></tr><tr><td>800nm 염소 안티-마우스 IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>다른 회사들도 적외선 2차 항체를 판매합니다. 고도로 교차 흡착된 항체를 구입하고 IgG의 농도가 소스 DRAQ5 Bio DR50200 status에 따라 다를 수 있다는 점에 유의하십시오.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>이 화합물은 LI-COR에 의해 1mM</td></tr><tr><td>사파이어</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 다중 라벨 카운터</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>에서 판매되었습니다.9201-01</td><td></td></tr><tr><td>셰이커/믹서</td><td>연구 제품 국제</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

Viability Assays for Cells in Culture

현미경에서 수동 세포 수는 세포 생존 능력을 평가하는 중요한 수단이지만 시간이 많이 소요되므로 고가이다. 컴퓨터 생존 분석 장비의 측면에서 비용이 더 빠르고 더 객관적인 수동 세포 수보다 수 있습니다. 본 보고서는 이러한 세 생존 분석의 사용을 설명합니다. 이러한 분석의 두 적외선이며, 하나는 발광입니다. 두 적외선 분석은 16 비트 오디세이 이미 저에 의존하고 있습니다. 한 적외선 분석은 세포 기질에 대한 사파이어의 얼룩과 함께 핵의 DRAQ5 얼룩을 사용하고 700 nm의 채널을 시각화한다. 다른 적외선 분석, 인 - 셀 양식, 세포 골격 단백질 (α-tubulin의 또는 미세 소관 관련 단백질 2)에 대한 항체를 사용하여 800 nm의 채널을 레이블. 세 번째 생존 분석은 ATP를 위해 일반적으로 사용되는 발광 분석이지만, 우리는 비용을 절약하는 데 권장되는 볼륨의 내무반을 사용합니다. 이들 측정은 모두 선형 및 세륨의 개수와 상관 관계LLS 도금,하지만 감도에 따라 다릅니다. 세 가지 분석법은 시간 소모적 현미경을 회피하고 전체를 잘 샘플링함으로써 샘플링 에러를 감소시킨다. 마지막으로, 분석의 모든 쉽게 짧은 시간 프레임 내에서 수행되는 실험의 많은 수 있도록, 실험의 단부 중 하나 일 이내에 완료 될 수있다. 그러나, 그들은 모두 세포 수는 치료, 때때로, 특히 셀룰러 ATP에 대한 충족되지 않은 가정 후, 신호 강도에 비례하여 유지한다는 가정에 의존한다. 세포가 증가하거나 치료 후 감소 사이즈면 더욱이,이 세포 수에 영향을주지 않고 신호 강도에 영향을 미칠 수있다. 우리는 수동 계산을 포함한 모든 가능성의 분석은,주의 사항의 숫자에서 고통 결론하지만 컴퓨터 생존 분석은 초기 투자 가치가 있습니다. 세 가지 분석을 함께 사용하면 세포의 구조와 기능에 대한 포괄적 인 뷰를 생성합니다.

이들 실험에서 속도 제한 요인은 ATP 분석이 비교적 짧은 기간이기 때문에, 적외선 염색법이다. 적외선 분석을 위해, 우리는 여덟 96 - 웰 플레이트 (그림 1 참조) 4 판 각각의 압도적 인 두 개의 일괄 처리에 의해 하루 만에 염색 검사 할 수 있다는 것을 기대하고 있습니다. 이 추정은 고정의 20 분을 가정, 세탁 30 분, 세척의 3​​0 분 뒤에 2 시간 차 항체 배양을 차단 30 분, 액체의 30 분 뒤에 1 시간 차 항체 배양은 30 분 DRAQ5는 + 사파이어 30 다음 세척, 4 판에 대한 스캔 시간의 34 분의 분. 열 다섯 추가 분은 네 개의 개별 판의 엇갈린 피펫을 설명하기 위해 세척 그림 1에 반영됩니다. 데이터 분석을위한 시간이 추정에 포함되지 않습니다. ATP 분석 측정은 모든 적외선 플레이트 병렬로 발생하는 경우, 열두 판은 하루에 정량 할 수있다 - 적외선 얼룩 여섯s와 ATP 수준에 대한 여섯. <p class="jove_co...

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

이 절차의 전반적인 목적은 단일 분석법만으로는 얻을 수 없는 세포 적합성에 대한 보다 종합적인 관점을 제공하기 위해 다각적인 생존능 분석을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 도말된 세포의 ATP 수치를 측정하여 대사 기능을 평가합니다. 두 번째 단계는 800 nm 파장의 적외선 항체를 사용하여 alpha tubulin 또는 microtubule-associated protein 2와 같은 세포골격 단백질을 면역 염색하는 것입니다.다음으로, 700 nm에서 핵과 세포질을 염색하기 위해 infrared drac five와 sapphire로 세포를 표지합니다. 마지막 단계는 적외선 이미저를 사용하여 alpha tubulin 또는 map two, 그리고 drac five와 sapphire를 700 nm 및 800 nm 파장에서 모두 촬영하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 발광 및 적외선 분석은 해부학적 구조와 생리적 기능 모두에 대한 정보를 제공합니다.MTT 생존능 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이러한 기술의 주요 장점은 세포 무결성의 여러 측면을 신속하고 민감하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법은 치료 화합물이 해부학적 구조와 대사 기능을 보호할 수 있는지와 같이 신경과학 및 약리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 동봉된 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에 다양한 세포 밀도로 100 또는 200 µL의 배지에서 세포를 수확하고 재팽창시키기 시작하려면, 가장자리 증발 효과를 줄이기 위해 주변 웰에 200 µL의 멸균수를 채우십시오.세포를 CO2 버퍼 처리된 인큐베이터에서 37°C로 하룻밤 동안 부착시킵니다. 다음 날, 각 웰에 50 µL의 배지가 남도록 100 µL의 배지 중 50 µL를 제거하거나, 200 µL의 배지 중 150 µL를 제거합니다. 그 다음, 2열부터 6열까지의 내부 웰에 cell titer glow 시약 25 µL를 각각 첨가합니다.7~11열 B~D행의 1:2 희석액을 얻으려면, 나머지 웰인 7~11열 E~G행에 Cell Titer-Glo 시약 50 µL를 첨가하여 1:1 희석액을 만듭니다. 배지를 제거하지 말고, Cell Titer-Glo 시약 100 µL를 추가하여 총 부피 200 µL의 1:1 희석액을 만듭니다. 즉시 플레이트를 진탕기 또는 궤도형 쉐이커(orbital shaker)에 올리고 10분 동안 배양하며 샘플을 혼합합니다.그런 다음 각 웰

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

문화 세포의 수를 결정하는 것은 문화 조건을 표준화하고 정확한 quantitation 실험을 수행 중요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세포가 hemacytometer를 사용하여 계산하는 방법을 보여줍니다.

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

체외 시스템에 수정 3 - D는 재구성 지하 막 여러 종양 세포 라인의 성장 특성 전이성 보조 사이트에서 종양 세포의 휴지 또는 proliferative 행위와 연관있는...

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

이 비디오는 세포요법 효과를 유도하는 바이러스의 생존 역학을 연구하기 위한 세포 임피던스 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 식염수로 전처리된 바이러스에 감염된 부착 세포의 전기 임피던스를 측정합니다.

바이러스 생존을 평가하기 위한 세포 임피던스 기반 생존 역학 분석

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주의 세포독성 평가에 적합한 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(Alamar Blue[AB], CFDA-AM, Neutral Red 및 MTT 분석)을 제시합니다.

Zebrafish 세포주를 이용한 세포독성 분석

여기에서는 효모 샘플에서 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 원형질막 무결성을 정량화하기 위해 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)이라는 두 가지 형광 염료를 사용합니다. 유세포 분석을 사용하여 산화 후 스트레스 샘플에 대한 살아있는 세포, 죽은 세포 및 손상된 세포 분획에 대한 정량적이고 재현 가능한 추정치를 제공합니다.

효모 세포의 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 유세포 분석법과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석

배우세요 세포 생존 분석 방법으로 ATP 측정과 적외선 형광 면역염색을 결합하여 대사 기능과 구조적 무결성을 동시에 평가하는 종합적인 세포 건강 평가 기법을 익히세요.

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

더 많은 동영상 탐색