Name: 에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 인간 비강 상피 세포를 에어 리퀴드 인터페이스에서 배양하는 방법을. 이 기술은 섬모 및 비섬모 세포로 재분화되어 호흡 점막 연구에 활용됩니다.

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저자는 도움이 입력에 대한 리사 데일리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (ES013611 및 HL095163)에서 교부금에 의해 지원되었다, 승무원 의학 연구소 (FAMRI)과 환경 보호청 (CR83346301)과 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 문서에서 설명하는 연구는 환경 의학, 천식 및 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 폐 생물학을위한 센터와 협력 계약 CR83346301을 통해 미국 환경 보호국 (EPA)에 의해 부분적으로 투자되어 있지만, 그것은 대상이되지 않았습니다 기관의 요구 피어 및 정책 검토 및 따라서 반드시 기관의 의견을 반영하지 않으며, 공식적인 승인은 그렇게 유추해서도 안됩니다. 언급 OF 무역 이름 또는 상용 제품은 사용 승인 또는 추천을 의미하지 않습니다. 로레타 뮐러는 개인 교부금과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원됩니다.

1. 플라스틱 구조물을 준비 코트 플레이트 <ol><li> 12 - 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL의 PureCol (1:100은 멸균 수로 희석)를 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다, PureCol을 제거하고 세포가 플레이트에 추가하기 전에 HBSS의 권리와 린스 (아래 단계 3.1 참조). </li></ol> 2. 획득 및 인간 NECs의 전처리 생검 <ol><li> 코 부스러기 생검 <ol><li> 검경과 운영 이경에 9mm 재사용이 가능한 폴리 프로필렌 코 검경 (모델 22009)를 통해 직접 비전 아래 코 비갑개를 안감 피상적되는 EC (모델 21700)을 얻었다. 이 장치는 코 비갑개와 운동의 유연성을 최적의 시각화를 제공합니다. </li><li> 머리를 약간 뒤로 기울거나 시험 테이블에 앙와위로 누워있는 스트레이트 백업 의자에 똑바로 앉아 주제와 조직 검사를 수행합니다. </li><li> 콧 구멍에 이경 검경 및 하부 turbi를 삽입네이트는 조명으로 시각화. </li><li> 비갑개의 뒷면에 말단 연장 끝으로 검경을 통해 멸균 열가소성 큐 렛을 삽입합니다. </li><li> 비갑개의 하부 표면에 부드러운 압력을 사용하여 큐 레트는 점막 표면의 5 배에 걸쳐 그려진 후퇴합니다. 모세관 작용에 의해 개최 점막 세포의 성공적인 검색은 큐 렛의 컵에 분명 할 것이다. </li></ol></li><li> RPMI 1640 8 ㎖, 얼음에 전송을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 샘플을 놓습니다. </li><li> 프로브를 검색 P-1000 피펫 코뿔소 조사에서 조직을 제거, 프로브를 폐기 집게를 사용하여 </li><li> 원심 분리기, 기음 뜨는 (주의 : 펠렛을 대기음하지 않도록주의를) (4 ° C에서 400 XG, 5 분) 펠렛. </li><li> 100X DNA 분해 효소 1의 10 μL와 1 ㎖ BEGM에서 펠렛을 재현 탁. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 원심 분리기 (4 ° C에서 400 XG, 5 분), 뜨는을 대기음하지 마십시오! </li></ol> 3. 에스플라스틱에 EED 셀 (0 일) <ol><li> 플레이트에서 PureCol를 제거하고 HBSS 린스 (도 1.2 단계 참조). </li><li> (미디어의 메 니스 커스 (meniscus)가 아니라 중앙에 나타날 때까지 80 ~ 100 μL) 코팅 된 플레이트 (생검의 크기에 따라) 1-4 우물에 BEGM + + 미디어의 최소 볼륨을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 너무 많은 미디어를 흡입하지 않고, 튜브에서 생검 조직의 펠렛을 제거하기 위해 P-1000 피펫을 사용합니다. </li><li> , 우물의 중앙으로 펠렛을 전송 세포의 클러스터로 함께 생검을 유지하고, 하나의 세포 현탁액을 만들기 위해 분쇄하지 않습니다. 시드 할 수있는 4 개의 우물까지 좋은 생검을 얻을 수 있습니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2,&gt; 90 % 상대 습도)에 접시를 넣어. </li><li> (메 니스 커스 (meniscus)을 방해하지 않고) 충분한 미디어가 있음을 보장하기 위해 두 시간 후에 확인합니다. </li><li> 첫째날, 24 시간 후 파종 : 모든 우물의 모든 비 부착 세포 (경사 판을 수집하고 P-1000, C에서 세포와 미디어를 수집1.5 ㎖의 원심 분리 관에 ollect 모든 우물). </li><li> 원심 분리기 (4 ° C에서 400 XG, 5 분). </li><li> 세포 현탁액을 원심 분리하는 동안 : 0 일에 씨앗을 품고 세포에 BEGM + + 및 BEGM + 미디어 혼합물 250 μL의 250 μL를 추가합니다. </li><li> 반복하여 비 부착 세포에 대한 3.1-3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 일 2-5 : 매일 세포의 변화 미디어,, 각 웰에 500 ㎕의 미디어를 추가 BEGM + + 미디어 단계적 (2 일의 양을 줄일 파종 후 : 125 μL BEGM + + 플러스 375 μL BEGM +, 파종 후 3 일째 다음과 같은 일 : 73 μL BEGM + + 플러스 427 μL BEGM +). </li></ol> 4. 플라스크에 세포 확대 <ol><li> 매일 세포를 모니터, 그들은 다음과 같은 80-90% 자랄 때 (그들은 오래 걸릴 경우 보통 5-7 일 생검 후, 그들은 성공적으로 성장하지 않습니다) 리프트 세포에 도달하면 :; 0.25 % 트립신의 500 μl를 추가 조심스럽게 대기음 미디어 세포가 분리 될 때까지 잘 당은 (그것은 일반적으로 2 ~ 3 분 소요) 37 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 필요 준비15 ML 튜브에 간장 콩 트립신 억제제 (SBTI) (1 ML 트립신 당 750 μL)의 ED 볼륨. </li><li> 반복적으로 피펫 팅에 의해 트립신 솔루션 아래 세포를 이동시키다, SBTI과 15 ML 원뿔 관에 전송 분리 된 세포. </li><li> 세포와 튜브에 HBSS를 추가, 총 1 ㎖ HBSS에 모든 우물을 씻어. </li><li> (4 ° C, 400 XG, 5 분) 펠렛 1 ㎖ BEGM + 미디어 매체에 resuspend을 흡인 튜브 와동에 원심 분리기. </li><li> 펠릿의 크기에 따라 T25이나 T75 플라스크에 세포를 확장 (이 P1이며, 약 2 합류 우물 하나 T75 플라스크에 이동 한 합류가 아니라 하나의 T25 충분하다, 보통 2 합류 우물 하나 T75) 얻었다. <ol><li> (T75를위한 5 ㎖를 각각 T25 3 ML 각) 플라스크에 BEGM +를 추가합니다. </li><li> 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다. 조직 문화 인큐베이터로 플라스크를 전송합니다. </li></ol></li><li> 24 시간 후 플라스크 - 파종 : 플라스크 (T25에 3 ㎖, T75을 10 ㎖)에 추가 BEGM + 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li><stroNG&gt; 플라스크에서 세포를 유지 : 미디어 (모서리에서 대기음)를 제거하고 BEGM + 미디어 (5 ml/T25, 20 ml/T75)를 추가합니다. 미디어는 2-3 일마다 변경해야합니다. 그들은 약 80 %의 합류 때까지 플라스크에서 세포를 유지 (, 일반적으로이 7-10 일 사이에 걸립니다; 자랄도 전체 플라스크에 걸쳐하지 않을 수 있습니다 그들은 10 일 이후 컨 플루 언트하지 않는 경우에는 제대로 성장하지 않습니다). </li></ol> 5. 조직 문화 삽입에 셀을 시드 <ol><li> 플라스크에서 용지를 제거하고 트립신 (T25를위한 3 ㎖, T75 플라스크 4 ml)에 추가합니다. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 알을 품다 (약 2 ~ 3 분). </li><li> SBTI (1 ML 트립신 당 750 μL&gt; T25, T75를위한 3 ㎖ 2.25 ㎖)을 15 ㎖의 튜브를 준비합니다. </li><li> 아래 플라스크 테이핑과 피펫 팅하여 세포를 이동시키다 SBTI과 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 튜브에 HBSS를 추가, HBSS (T25, T75 2 ML 1 ml)로 플라스크를 씻어. </li><li> 원심 분리기(4 ° C, 400 XG, 5 분) 펠렛, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 접시를 준비 시드가 될 수 있습니다 얼마나 많은 접시를 결정, 샘플 코드 번호, 통로 번호 (즉, P2) 및 날짜와 함께 접시에 레이블을. 기초 챔버에 700 ㎕의 BEGM + 미디어를 추가합니다. </li><li> 튜브를 소용돌이로 교반하여 1 ㎖ BEGM ALI 매체에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 혈구와 세포를 카운트 (T25는 일반적으로 약 4 백만 세포를 생산, T75는 섬에 따라 최대 2000 만 셀을 가질 수 하나 12 - 웰 플레이트에 세포를 1 ~ 2 만 사용)와 함께 세포 현탁액을 희석 (접시 당 2.5 ml의 미디어 1.2 X 10 6 세포)를 접종해야 플레이트의 양에 필요한 총 볼륨 BEGM ALI 미디어 (주 :. 세포의 일부가 동결 할 경우, 튜브 라벨과 세포를 제거 여기에서 우리는 일반적으로) 미디어를 동결 2 ㎖에 2 × 10 6 세포를 동결 </li><li> 각 코팅 코닝 12well 셀의 정점 측에 200 ㎕의 세포 현탁액을 추가삽입 (&gt;이 약 80,000-150,000 세포 / 삽입 될 것입니다; 0.4 ㎛의 기공 폴리 에스테르 (폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)) 막 삽입과 12mm의 트랜스 웰), 조직 문화 인큐베이터로 전송합니다. </li><li> 24 시간 후, 정점 미디어 (200 μL 확장 매체)를 변경합니다. </li><li> 세포 배양을 유지 : (BEGM ALI 미디어, 700 ㎕의 기저 200 ㎕의 정점) 미디어를 변경 매일. 삽입은 세포가 (단일 층에 구멍이 표시되지 않습니다) 완전히 합류 할 때까지 물속에 잠긴 유지해야합니다. 이 세포가 가장 가능성이 실행 가능하지 않습니다 이상 걸리는 경우 세포 수에 따라이 보통 2-6 사이의 일이 소요된다. </li></ol> 6. 일단 세포가 (트랜스 웰의 세포가 완전히 플루 때) 완전히 플루 있습니다 에어 리퀴드 인터페이스를 설정 <ol><li> 세포는 48 시간 동안 500 ㎚ 레티노 산으로 보충 BEGM ALI 매체와 두 정점과 기저 미디어를 대체 완전히 합류가되면. </li><li> 레티노 산을 추가 한 후 48 시간이 BEGM ALI 미디어를 보충 : PneumaCult-ALI 유지 보수 매체 (다음 제조 업체의 지침을) 준비 (기초 구획 보통 8.5 ㎖의 한 판을 위해) 필요한 매체의 양을 계산, 1 ㎖ 당 추가 완료 기본 중간 PneumaCult : 10 μL의 PneumaCult의 100 배 유지 보수 보충 2 μL (2 ㎎ / ㎖의 원액) 헤파린 (96 μL / ㎖의 원액) 5 μL 하이드로 코티손. </li><li> 모든 미디어를 제거하고 기저 측면 만 (혀끝의 측면에없는 매체)에 700 ㎕의 PneumaCult-ALI 유지 보수 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> ALI에서 4 주 동안 세포 배양 유지 : <ol><li> 미디어에게 (수요일, 금요일 일정이 우리를 위해 잘 작동 월요일) 매일을 변경합니다. </li><li> ALI에서 일주일이 지난 뒤, 주 (수요일) 일단 혀끝의 표면이 세척되어 조심스럽게 대기음, 인큐베이터에 10 분을 유지, 꼭대기면에 200 ㎕의 HBSS를 추가HBSS는 (HBSS를 흡입하는 피펫의 팁에 200 ㎕의 팁을 사용, 생물 안전 캐비닛의 진공 트랩에 부착 된 유리 피펫에 9를 사용한다.) </li></ol></li></ol> 참고 : 변경 판 사이의 팁뿐만 아니라 기저 대 혀끝의 표면에서 갈 때 팁을 변경합니다. ALI에서 약 2 주 후, 세포를 구별하기 시작하고 속눈썹이 나타납니다. 세포 배양은 ALI에서 약 4 주 후에 전체의 분화에 도달합니다.

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<li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Attenuated+Influenza+Virus+%28LAIV%29+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li>
<li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102(2011).</li>
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</ol>

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호흡의 EC는 외생 적 자극 (20)로부터 인체를 보호뿐만 아니라 수용성 매개체 또는 직접 수용체 리간드 세포 - 세포 상호 작용의 분비를 통해 시작하고 호흡기 면역 방어 반응 1-3을 조절하는 스위치 역할을하는 물리적 장벽뿐만 아니라를 제공합니다. 또한, 면역 반응의 EC의 역할을 연구하는 질병 개체군에서 내피 간의 전위차를 검사하거나, 내피에 외인성 스트레스의 효과를 연구하기 위해, 생체 내 상황 요점을 되풀이하는 것이 중요하다. 인간의기도는 섬모 세포, 술잔 세포와 기저 세포 (20)와 같은 다른 상피 세포를 포함하여 40 개 이상의 서로 다른 세포 유형 (20)를 포함한다. 우리의 프로토콜은 피상적 인 코 부스러기 생검은 크게 생체 내에서 비강 상피 세포를 모방하는 NEC의 문화를 산출, 다시 분화를 받아야 확대 배양 할 수 NECs을 산출하기 위해 처리 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. </...

기술의 목표 기도의 상피 세포 (내피)은 직접적 병원균, 알레르기 또는 대기 오염 물질로 흡입 환경 스트레스에 노출되는 최초의 사이트 중입니다. 내피는 구조적인 장벽보다 더 : 그들은 수용성 매개체 4-6 자신의 계면 7-9 리간드 / 수용체의 발현의 출시를 통해 호흡기 면역 반응 1-3을 시작하고 조절하는 스위치 역할을합니다. 불멸화 세포주가 시험 관내에서 내피 호흡을 연구 모델로서 사용될 수 있지만, 이들은 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 편광 섬모 점액 생산 세포로 구성된 이종 세포 집단으로 분화하는 데 실패한다. 생체 내에서 관찰 호흡기 상피의 중요한 특성을 다시 요약 차기도 EC에 사용할 수있다. 따라서, 우리의 목표는 비강되는 EC (NECs)를 이용하여 우리의 방법을 최적화 할 수 있었다 지원자로부터 얻어진. NECs은 생체 내에서 볼 수있는 비강 상피의 많은 기능을 모방 차별화 NECs의 세포 배양 모델을 산출, 체외에서 확장 배양된다. 이론적 해석 생체 내 상황을 흉내 낸 인간의 기본 내피와 체외 모델의 사용은 -이 연구에 설명 된대로 - 질병의 EC의 특정 차이기도 상피 세포와 관련된 생리 학적 매개 변수 또는 내피와 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하는 독특한 가능성을 제공합니다 이러한 수지상 세포 10 개, 자연 살해 세포 (11) 또는 대 식세포. 기존의 여러 방법이 bronchoscopies 동안 브러시 생검을 통해 침습적으로 얻을, 또는 그렇지 않으면 폐기 폐 조직 12-17에서 할 수있는 기관지 내피를 사용합니다. 또한, 완전히 차별화 된 인간기도 상피 세포 배양을 얻기 위해 상용 소스는 MatTek, 애쉬 랜드, MA, 클론 틱스에서 (EpiAirway 모델이 존재수사관이 다른 기증자를 선택할 수 있습니다 론자, 바젤, 스위스, Epithelix 사스에서 MucilAir, 스위스 제네바)에서. 그러나, 제한된 시판 상피 세포, 또는 파라미터의 소정 세트의 제한된 풀 중에서, 시판 차 인간기도되는 EC 획득과 관련된 비용 및 폐기 폐 조직 또는 갓 얻어진 인간 기관지 생검 조직에 제한된 액세스는 많은 연구자 금지 완전히 차별화 된 인간의기도 내피에서 연구를 수행하십시오. 따라서, 우리는 1) 비 침습적으로 얻을 인간 NECs을 이용 2) 차별화 된 인간기도 상피 세포의 문화를 산출하는 프로토콜을 제공하고, 3) 기존의 조직 문화 인프라와 대부분의 실험실 설정에서 재현 할 것이다 기술을 개발하기 위해 밖으로 설정합니다. 기존 기술 / 모델에 비해 장점 신선한 NECs을 획득, 기관지 또는 작은기도의 EC에 비해 훨씬 적게 침략, 개성적의 때 심각한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있고, 표면 코 부스러기 생검 그렇지 않으면 연구 관련 bronchoscopies 필요하지 것이다 병에 걸린 집단에 실시 할 수 있습니다. NECs을 얻기 침습 피상적 크레이프 생검 조사가 수행되는 연구 목적에 따라 등 연령, 성별, 질병 상태, 등, 도너 사양에게 선험적으로 설정하는 것을 허용한다. 조사 연구를 설계 할 때 따라서, 연구자는 상업 벤더, 또는 디자인 침략 기관지 연구에서 고가의 차별화 된 세포 배양 모델을 구입, 임상 적으로 사용 가능한 조직 / 상피 표본에 의해 제한되지 않습니다. 또, NECs를 얻기 쉽게 관찰 결과의 통계적 유효성을 강화하는 다른 공여자로부터 세포에서 실험을 수행 할 수있는 능력을 증가시킨다. 마지막으로, 코 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나이다. 따라서,에서의 Organotypic를 생성비강 상피를 흉내 체외 배양 시스템은 쉽게 세포 배양 시스템을 사용하여 달성 될 수있는 바이러스 입자, 오염 물질, 알레르겐, 또는 가스의 흡입을 연구하는데 유용하다.

<table><tbody><tr><td>비강 검경</td><td>Welch Allyn</td><td>모델 22009</td><td>9mm, 재사용 가능한 폴리프로필렌</td></tr><tr><td>작동 검이경</td><td>Welch Allyn</td><td>모델 21700</td><td></td></tr><tr><td>코뿔소 프로브 세포 큐벳</td><td>Arlington Scientific</td><td>SY-96-092</td><td>큐벳 머리를 조금 더 구부려</td></tr><tr><td>12웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 멤브레인 세포 배양 인서트</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 </td><td>Corning</td><td>430639 및 430641</td><td>T25 및 T75 벤트 플라스크</td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지(L-글루타민 포함)</td><td>Gibco</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>기관지/기관 상피 세포 성장 매체</td><td>세포 응용 분야</td><td>511-500</td><td></td></tr><tr><td>BEGM 기관지 상피 세포 성장 배지</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>이것은 미디엄 한 병과 보충제가 포함된 바이알 키트로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨 7.5% 용액</td><td>Gibco</td><td>25080</td><td>그대로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>누세럼</td><td>BD Biosciences</td><td>355104</td><td>그대로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>BAMBANKER 냉동 매체</td><td>BAMBANKER</td><td>302-14681</td><td>그대로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>CoolCell </td><td>Biocision</td><td>HTBCS-136</td><td>(CryoPrep 무알코올 세포 냉동 용기)</td></tr><tr><td>PureCol</td><td>AdvancedBioMatrix</td><td>5005-B</td><td>는 멸균수(대략 0.03mg/ml)로 1:100 희석(약 0.03mg/ml)500 &mu를 사용합니다. </td></tr><tr><td>Ca2 및 Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>100x 용액인 1.5mg/ml에서 용해된 12웰 플레이트 HBSS의 l/웰에 10 &mu를 추가합니다. l 매체</td></tr><tr><td>트립신의 각 ml에 0.25 %, 1x, 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>사용</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제 (SBTI)</td> <td>시그마</td><td>T6522</td><td>1 mg / ml의 농도에서 HBSS에 용해 사용</td></tr><tr><td>시</td><td>그마</td><td>R7632</td><td>100 &mu를 구성; M 원액 (아래 참조), 10 &mu로 희석; 절대 알코올을 가진 M, 5 &mu를 복용하십시오. 이것의 l을 1 ml BEGM 매체 (우리의 작업 솔루션) . All-trans 레티놀은 325 nm에서 에탄올에서 52,480의 흡광 계수를 갖는다. 25mg을 50ml 앱솔루트 에탄올에 녹입니다. 연속 희석을 할 필요가 있으며, 450ml 절대 에탄올에 50ml의 재고를 희석하고, 50ml를 취하고, 450ml 절대 에탄올에 희석하고, 이 중 50ml를 취하고, 450ml 절대 에탄올에 희석하고, 다시 50ml를 취하고, 450ml 절대 에탄올에 희석하고, 100ml를 취하고, 900ml 절대 에탄올에 희석하고, 325nm에서 분광 광도계에서 읽고, 그런 다음 이 숫자에 '를 곱합니다. 희석 계수를 52,480의 흡광 계수로 나누면 mM 단위의 숫자가 표시됩니다. 100mM 재고를 만드십시오(-20 &deg에 보관하십시오. C) 그리고 이 스톡으로부터 10 mM 분취액이 만들어지며, 필요한 일일 레티노산은 995 ml ALI 배지 중 이 10 mM 분취액 중 5 ml가 될 것이다. 예: 325nm 판독값은 1.15입니다. 1.15 x 10,000 (희석 계수) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, 이것으로 절대 에탄올로 100 mM 스톡을 만듭니다.</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당(1x), 액체, L-글루타민 및 피루브산 나트륨</td><td>함유 Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물</td><td>Gibco</td><td>13028-014</td><td>BEGM ALI 배지에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>니스타틴</td><td>시그마</td><td>N4014-50 mg</td><td>3.3 mg/ml의 용액을 구성합니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>milliQ 물에 10mg/ml 용액을 만듭니다.</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 배지</td><td>StemCell</td><td>5001</td><td>이것은 보충제가 포함된 배지 1병과 바이알 키트로 제공됩니다. 자세한 내용은 아래를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>하이드로 코르티손 </td><td>StemCell</td><td>7904</td><td>1ml ddH2O에 2.4mg 히드로 코르티손을 용해 (200x 하이드로 코르티손 원액을 만드는 데 사용)</td></tr> <tr><td>PBS의 헤파린 나트륨 염 (2mg / ml)</td><td>StemCell</td><td>7980</td><td>에서 사용하십시오. </td></tr><tr><td>필터 플라스크 (500 ml)</td> <td>코닝</td><td>431097</td><td>0.22 &mu; m 기공 크기</td></tr><tr><td>필터 튜브 (50 ml)</td> <td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Steriflip, 0.22 &mu; m 기공 크기</td></tr><tr><td>피펫 팁 - ART Barrier Tips</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 멸균, 15 ml 및 50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddH2O, 절대 에탄올, ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 (P2, P200, P1000), 9 in 유리 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>꽉 끼는 커프</td><td></td><td></td><td></td>스가 있는 실험실 코트</tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td>사용된 매체 및 솔루션:</td> <td>Recipe</td> <td>사용</td> </tr> <tr> <td colspan="3"> 비고: 항상 미디어를 실온으로 데우십시오</td> </tr> <tr> <td rowspan="2">BEGM media</td> <td><ul> <li> 500ml BEGM 세포 레티노산 분취 1개가 포함된 적용 매체</li></ul> </td> <td>(반으로 섞어 여과)</td> </tr> <> <td><ul><li> 단일 인용 보충제 1개 분취가 있는 500ml BEGM Lonza 매체 </li></ul></td> <td>< 생검의 ul><li> 소화</li></ul> </td> </tr> <tr> <td rowspan="3">BEGM+ media</td> <td><ul><li> 50 ml BEGM 배지 </li></ul></td> <td><ul><li> 유지 세포 플레이트의 플라스틱 (passage0) < / li>< / ul>< / td > < / tr> <tr > < td ><ul><li> 10 &mu; l 레티노산 (작동 용액) < / Li >< / Ul> < / TD > < TD >< UL >< Li > 플라스크 (통로 1, 부분적으로) < / Li>< / ul> < / td > < / TR > < > < TD >< / td > < td ><ul >< > 플라스크 < / li>< / ul>< / td의 세포를 유지합니다> </tr> <tr> <td rowspan="3">BEGM++ media</td> <td><ul><li> 50 ml Lonza' 보충제가 함유된 BEGM 미디어</li></ul> </td> <td><ul><li> 플라스틱</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 1ml BiCarb</li></ul> </td> <td><ul> <li> 플라스틱(passage0, 부분적으로만)의 플레이트에서 세포 유지</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td> <td><ul><li> 파종 세포(passage1, 부분적으로)</li></ul> </td> </ tr> <tr> <td rowspan="5">BEGM ALI media</td> <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td> <td rowspan="5"><ul><li> ALI</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 보충제를 포함한 250ml BEGM</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 소 뇌하수체 추출물 2ml(12.5mg/ml 용액)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul> <li> 1 ml 니스타틴 (3.3 mg/ml 용액)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 75 &m; l BSA (10 mg/ml 용액)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td rowspan="5">200X 하이드로코르티손 원액 (96 &mu; L/ml 용액)</td> <td><ul><li> 200 &mU; l 용해된 하이드로코르티손</li></ul> </td> <td rowspan="5"><ul><li> 플라스크에서 마지막 날 동안 PneumaCult-ALI Complete Base Medium에 보충</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 4250 &mu; l 용존 염화나트륨 < / Li>< / ul>< / td > < / tr > <> < td ><ul >< li> 540 &mu; l ddH2O</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 10 &mu; l 절대 에탄올 < / li>< / ul> < / td > < / tr> <tr > <td > 0.22 &mu를 통한 필터 용액; M 필터, 부분 표본 용액 및 -20°C에서 보관; C, 추가적인 동결/해동 주기를 피하십시오</td> </tr> <tr> <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td> <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td> <td><ul><li> 세 가지 PneumaCult-ALI 매체 모두에 대한 기본 매체 </ li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 50ml PneumaCult 10x 보충제 </li></ul></td> <td><ul><li> PneumaCult 매체는 빛에 민감하므로 항상 어두운 곳에 보관하십시오</li></ul> </td> </tr> <tr> < td>(이것은 2-8 &deg에서 2주 동안 안정적입니다. C 또는 -20 &deg에서 최대 6개월 동안; C)</td> <td></td> </tr> <tr> <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td> <td>PneumaCult-ALI Complete Base Medium 1 ml 당 추가:</td> <td rowspan="4">삽입물에 ALI 배양</td> </tr> <tr> <td><ul><리> 10 & l PneumaCult 100x Maintenance 보충 </li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 2 &mu; l 헤파린 (2 mg / ml 원액) < / li>< / ul>< / td > < / tr> <tr> <td ><ul >< li> 5 &mu; l 하이드로코르티손 (96 &mu; L/ml 원액) </Li></Ul></TD> </TR> </Tbody> </Table> </td></tr></tbody></table>

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

사용하여 시험 관내 모델에서 인간의 기본 상피 세포가 미생물 감염이나 흡입 제제의 맥락에서 호흡기 상피 세포의 주요 기능을 이해하는데 필수적이다. 병에 걸린 집단에서 얻은 세포의 직접 비교는 우리가 서로 다른 표현형을 특성화하고 상피 세포의 기능의 변화를 매개하는 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 인간 기관지 영역에서 상피 세포를 배양하는 것은 잘 설명 하였지만, 기관지 브러쉬 생검 획득과 관련된 인간 폐 조직 또는 침입의 가용성에 의해 제한된다. 비강 상피 세포가 훨씬 덜 침습적 피상적 인 코 부스러기 생검을 통해 얻은 및 과목은 유의 한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있습니다. 또한, 코 호흡 기계에 엔트리 포인트이고, 따라서 이러한 미생물 제제로서 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나, 오염 물질, 또는 알레르기. 간단히, 인간 지원자로부터 얻어진 비강 상피 세포를 코팅 조직 배양 플레이트 상에 전개 한 후 세포 배양 인서트 상에 전사된다. 포화 상태에 도달하면, 세포가 더 중요한 생리 학적 조건을 만들어 여러 주에 대해, 공기 - 액체 계면 (ALI) 배양 계속. ALI 배양 조건은 생산 섬모와 점액 양 세포와 인간의 비강 상피 세포와 유사한 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 차별화 된 상피 세포로 이어지는 정의 미디어를 사용합니다. 차별화 된 비강 상피 세포와 조직 문화 삽입은 연구 질문 (되는 약물 치료, 렌티 바이러스 벡터, 가스에 노출, 또는 미생물 제제와 감염 전달)에 따라 다양한 방법으로 조작 및 이르기까지 수많은 다른 엔드 포인트에 대해 분석 할 수 있습니다 세포 및 분자 경로, 기능 채널제스, 형태 등 차별화 된 인간의 비강 상피 세포의 체외 모델에서 크게 생체 내에서 비강 상피 세포를 모방하는의 Organotypic 실험 모델을 사용하여 새로운 중요한 연구 문제를 해결하기 위해 조사를 가능하게 할 것이다.

NECs는 여기에 설명 된 프로토콜은 생체 내 상황 (그림 1)를 나타내는 섬모와 비 섬모 세포로 구성되는 EC의 유형이 다른 층으로 다시 구분 다음 배양. 차별화 된 NECs 중 일부는 (AB / PAS, 그림 1B를 사용하여 파란색으로 염색 세포)를 생산하는 점액이다. 여기에 제시된 프로토콜 최적화 되더라도, 분화는 전체적인 세포 집단 (점액 생산 세포 : 섬모 세포 즉 상이한 비율 비 섬모 세포)의 배포와 관련하여 변화 할 수 또는 심지어 더 편평 상피를 얻었다. 이러한 변화가 기증자의 인구에 의존하기 때문에 우리가 이전에 흡연자 18에서 NECs를 사용하여 시연 등의 기저 질환 표현형의 발생 반복 설을 나타낼 수 있습니다. 2가 다른 프로토콜 및 미디어 공식을 사용하여 차선의 재 분화 NECs의 예를 보여줍니다. 세포는 편평하며입방이나 섬모와 pse...

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

이 절차의 전반적인 목표는 공기-액체 계면(air liquid interface)에서 미분화 비상피세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 인간 지원자로부터 표면 비상피세포를 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 조직 배양 플레이트에 세포를 파종한 다음 플라스크에서 세포를 확장하는 것입니다.다음으로, 증식된 세포를 트랜스웰(transwell)에 파종하고 완전한 단층(confluence)이 형성될 때까지 배양합니다. 마지막 단계로, 공기-액체 계면(air-liquid interface) 배양 조건을 설정하기 위해 트랜스웰 상단에 있는 세포 배양액을 제거합니다. 최종적으로, 공기-액체 계면에서 3~4주 동안 배양된 세포는 점액섬모 비상피세포 배양물로 재분화되어 생체 내 비상피의 표현형을 모사하게 됩니다.배양, 기관지 상피 세포 사용 또는 상업적으로 이용 가능한 호흡기 상피 세포 획득과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 연구자가 비강 상피 세포를 채취할 모집단을 사전에 설정할 수 있다는 점입니다. 비강 생검은 기관지 내시경 검사 중 수행하는 기관지 브러시 생검보다 훨씬 덜 침습적이므로, 중등도에서 중증의 질환을 가진 환자군을 유의미한 부작용 없이 샘플링할 수 있습니다. 이 기술이 흡입 제제가 정상 호흡기 상피에 미치는 영향을 연구하는 데 매우 유용하다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 동시에 이러한 샘플들이 각각 고유한 유전적 보충물을 가지고 있어 낭성 섬유증 및 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 유전 질환을 연구하는 데 중요한 자원이 된다는 점 또한 기억해야 합니다.시연은 저희 실험실의 기술자인 Missy Brighton이 진행하겠습니다. 비강 긁기 생검(nasal scrape biopsy)을 준비하기 위해, 피험자를 등받이가 곧은 의자에 똑바로 앉히고 머리를 약간 뒤로 젖히게 합니다. 비강 통로를 덮고 있는 표면 상피 세포는 스페큘럼이 장착된 수술용 오토스코프(auto scope)와 9mm 재사용 가능 폴리프로필렌 비경(nasal speculum)을 통해 직접 시야를 확보하여 채취합니다. 이 장치는 비강 통로에 대한 최적의 시각화와 유연한 움직임을 제공합니다.비경을 콧구멍에 삽입하고 조명을 통해 하비갑개를 시각화합니다. 멸균된 열가소성 큐렛을 비경을 통해 삽입하며, 하비갑개의 하단 표면에 부드럽게 압력을 가해 팁이 하비갑개 후방으로 원위향으로 확장되도록 합니다. 점막 표면을 따라 큐렛을 5회 긁어낸

culturing-of-human-nasal-epithelial-cells-at-the-air-liquid-interface

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

기-액 계면 배양된 인간 비강 상피 세포에서의 바이러스 성장

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

배우세요 인간 비강 상피 세포를 에어 리퀴드 인터페이스에서 배양하는 방법을. 이 기술은 섬모 및 비섬모 세포로 재분화되어 호흡 점막 연구에 활용됩니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

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