Name: 배아 배양하는 방법 C. 엘레 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 C. elegans 배아 세포 대규모 배양 프로토콜을 통해 키티나아제 처리 및 수동 분리로 세포 특이적 유전자 발현을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1 1. 재질 설정 <ol><li> 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다. </li></ol> 8P 접시 조리법 : 3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4, 30g의 KH 2 PO 4, 산도 6.00) 25 ㎖. 10cm 배양 접시 (25 ㎖ / 플레이트)에 액체 한천 배지를 붓는다. <ol start="2"><li> 다음날 NA22 E. 1 ㎖로 농축 각 펩톤 한천 판의 표면 전체에 확산 2XYT 미디어 (16g 트립 톤, 10g의 효모 추출물, 멸균, 산도 7.0의 1 L에 5g의 NaCl) 37 ° C에서의 대장균 밤새 배양 이러한 박테리아는 임신하는 인원수 다량의 성장을지지하는 두꺼운 층을 형성 할 것이다 풍부한 음식 소스를 구성한다. 박테리아의 성장을 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 시드 판을 둡니다. 이 과정은 4 ~ 5 시간 동안 37 ° C에서 배양에 의해 가속 될 수있다. </li><li> 시드 8P 접시에 굶주린 동물을 전송합니다. 5-6 M9 버퍼 또는 ㎖의 물을 사용하여 굶주린 NGM 플레이트를 동물을 씻어 각 8P 판에 현탁액의 1-2 ML을 추가합니다. </li><li> 동물의 성장과 증식이 UNT 허용일리노이 플레이트를 임신하는 성인에 의해 합류에 채워집니다. </li><li> C.의 제조에 필요한 달걀을 분리 용해 액의 5-6 ML을 사용하여 임신하는 성인의 배아 세포를, 엘레. </li></ol> 용해 액 레시피 신선한 표백제의 5 ㎖, 10 N NaOH를 1.25 ㎖의 멸균 H 2 O의 18.5 ML 이 혼합물을 사용하기 전에 매번 신선한 준비해야합니다. <ol start="6"><li> 계란 버퍼를 사용하여 임신하는 성인으로부터 격리 계란을 세척 : </li></ol> 계란 버퍼 레시피 118 밀리미터의 NaCl, 48 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를, 25 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 삼투압이 340 mOsm. <ol start="7"><li> 키틴으로 처리하여 계란을 둘러싼 껍질을 제거합니다. 키티 나제는 산성 pH 25에서 가장 높은 활성을 가진 효소이다. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 달걀 버퍼 pH를 6.5로 키티 나제 (시그마, 카탈로그 없음. C6137)을 녹인다. 키티 나제 주식을 저장멸균 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 분량 씩 -20 ° C에서 솔루션을 제공합니다. 분취 량은 몇 개월 -20 ° C의 최대 저장할 수 있습니다. </li><li> C. 성장한다 땅콩 렉틴으로 덮여 멸균 커버 슬립 (12mm 직경)에 elegans의 배양 세포. 멸균 (0.5 ㎎ / ㎖)에 땅콩 렉틴을 녹입니다. 땅콩 렉틴 용액을 여과 또는 멸균 할 수 없습니다. 또한 UV 광으로 처리 될 필요가 없다. 최대 6 개월 -20 ° C에서 보관 2 ㎖ 씩 분주. </li><li> 완전한 세포 배양 배지 (500 ml)을 깁코, 50 ㎖ 태아 혈청 (열 불 활성화), 19.5 g의 수 크로스 (45 mOsm), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg 5 ㎖ /부터 500 ㎖ L-15 배지가 포함 ml의 스트렙토 마이신 (2 %). 완전 배지는 다음 0.20 μm의 기공 필터를 사용하여 필터링된다. </li></ol> 계란 버퍼와 배지를 각각 340의 삼투압이 345 mOsm을 가지고 있습니다. 실제로, 포유 동물 세포에 반대, C. 엘레 세포는 비교적 높은 삼투압을 가지고즉, 세포의 세포막과 직접 접촉 할 수있는 솔루션을 준비 할 때 카운트 고려 될 필요가있다. 이러한 시약의 조리법 osmometer 하나를 사용하여 측정 하였다 원하는 삼투압에 도달하도록 조절 하였다. 이들 레시피를 정확히 따르는 손질 이들 시약의 제조에 사용되는 경우 osmometer를 사용할 필요가 없다. 다른 솔루션은 그 조리법 여기에보고되지 않습니다 또는 C를 사용하는 게시의 경우에, 준비해야하는 경우, 하나는 osmoter를 사용한다 배양 된 세포 엘레 간스. 2. 계란 격리 <ol><li> 그것은 (24 - 웰 플레이트에서) 배양 된 세포의 12 우물에 충분한 계란을 수집하기 위해 적어도 네 8P 플레이트로 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 절차를 시작하기 전에 땅콩 렉틴 원액 한 튜브를 해동. 24 웰 플레이트의 우물의 바닥에 멸균 커버 슬립을 놓고 커버 슬립에 땅콩 렉틴의 200 μl를 추가합니다. 1 시간 또는 u 품다그리로 갈때 세포는 도금 될 준비가 된 것입니다. 완전히 땅콩 렉틴을 제거하고 멸균 멸균 물 1 ㎖로 한 우물을 씻어. 커버 슬립의 땅콩 렉틴의 완전한 제거는 세포의 응집을 방지하는 데 필수적이다. </li><li> 멸균 멸균 물을 사용하여 한천 플레이트 떨어져 임신하는 성인을 씻으십시오. 두 멸균 원뿔 50 ML 튜브로 현탁액을 수집합니다. 튜브 (*)의 하단에있는 벌레의 강수량을 할 수 있도록 최대 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 전송 플라스틱 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 멸균 물을 교체합니다. 200 XG 10 분 (~ 1,200 RPM) (*)에서 테이블 탑 원심 분리하여 웜 펠렛. 적어도 3이 마지막 단계를 반복합니다. </li><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 웜을 전송하고 200 XG에 10 분 동안 (~ 1,200 RPM) (*)에 그들을 펠렛. 뿐만 아니라 튜브의 하단에있는 박테리아를 수집하지 않도록하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 사용하지 마십시오. 때로는 centrifugations 후 벌레가 완전히 펠렛되지 않습니다. AF터 각 세척 및 제거하기 전에 상층 액을 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓습니다. 식힌 물 웜 튜브 바닥에 침전. </li><li> 물을 제거하고 용해 액의 5 ~ 6 mL를 넣고 (재료가 설정 참조). 5 ~ 10 분 동안 부드럽게 정지 록하고 매 2-3 분 실체 현미경을 이용하여 웜 용해 모니터링을 시작합니다. 현탁액의 방울은 쉽게 검사 용 커버 슬립 상에 배치 될 수있다. 배양 시간은 표백제의 신선도에 따라 달라집니다, 표백제의 작은 병을 구입하고 매월 새로운 병을 엽니 다. </li><li> ~ 웜 70 ~ 80 %의 (배양 시작부터 10 분)를 용해하는 경우, (재료가 설정 참조) 계란 버퍼 산도 7.3의 9 ML을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 10 분 동안 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 현탁액을 원심 분리기. 계란 (*)의 재 오염을 방지하기 위해 벤치에 분젠 버너를 가지고이 시점에서. </li><li> 조심스럽게 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고 펠렛 3-4 씻어용액을 명확 X 달걀 완충액까지. 각 세척하는 동안 알 버퍼에 펠릿 잘 혼합해야합니다. </li><li> 계란 30 % 수크로오스 용액을 사용하여 동물 사체로부터 분리된다. 살균 계란 버퍼의 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁 2 ML 60 % 자당 용액 (살균 계란 버퍼의 주식을)를 추가합니다. 잘 섞어 200 XG (~ 1,200 RPM) (*)에서 20 분 동안 원심 분리. </li><li> 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 계란은 솔루션의 상단에 떠있다. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용, 신선한 멸균 15의 ML 원뿔 튜브에 모든 달걀을 전송합니다. </li><li> 10 분 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 튜브와 원심 분리기에 살균 계란 버퍼 10 ML을 추가합니다. 세척 3 X를 반복합니다. 계란이 완전히 각 세척하는 동안 알 완충액되어 있는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 배아 세포 해리 층류 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 과정의 다음 단계를 실시한다. 동물은 있지만모든 박테리아하지 않을 경우 대부분 제거해야 세균 플레이트, 세척 및 표백제가 포함 된 용해 용액으로 처리에 가운. 따라서 과정의이 시점에서 층류 후드를 사용하는 달걀 현탁액의 새로운 오염을 방지한다. <ol><li> 2 ㎎ / ㎖ 키티 나제 (계란 버퍼의 pH 6.5 (*) 재고) 1 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 새로운 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 배양 시간은 효소와 실내 온도의 신선도에 따라 변화하고, 따라서 각각의 제조에 대해 결정되어야한다. 그것은 배양 10 분 후 반전 된 세포 배양 현미경으로 계란을 모니터링을 시작하는 것이 좋습니다. 참고 : 우리의 경험에서, 낮은 pH는 키티 나제 효소의 활동을 증가시킨다. 이러한 이유로 우리는 키티 나제 (pH를 수산화 나트륨을 사용하여 6.5로 조정 위에서보고 레시피를) 용해 pH가 6.5에 달걀 버퍼를 사용합니다. </li><li> ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 될 때키티 나제 치료 (그림 1 AB)는 900 XG 3 분 (~ 2,500 RPM) (*)에서 원심 분리하여 계란 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거하고 L-15 배지 3 ㎖ (*)를 추가합니다. </li><li> 6cm 직경 플레이트에 달걀을 전송하고 부드럽게 18 G 바늘을 구비 한 10 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 세포를 해리. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 드롭을 배치하고 현미경으로 보면 해리도를 모니터한다. 손상 세포를 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡인하지 마십시오. 세포의 80 %가 분해됩니다 ~까지 해리를 계속합니다. </li><li> 살균 5 μm의 밀리 포아 필터를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란과 부화 유충을 제거하기 위해 필터링해야합니다. 모든 세포를 복구하기 위해 필터를 통해 신선한 L-15 미디어의 추가 4 ~ 5 ㎖의 필터. DA을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오필터 및 / 또는 세포를 maging. </li></ol> 4. 세포를 배양 <ol><li> 3 분 (*) 900 XG (~ 2,500 RPM)에서 원심 분리하여 해리 세포 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여주의 깊게 뜨는을 제거합니다. 전체 L-15 중간 플레이트 1 ML / 잘 펠렛 세포를 Resuspend. 첨가 매체의 사용량은 8P 플레이트의 개수, 접시에 웜의 합류 및 셀에 대해 수행 될 실험의 유형에 따라 달라진다. 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 측정 할 수있다. ~ 230,000 셀 / ㎠가 최적의 밀도를 도금 패치 클램프 녹음하십시오. </li><li> 배양액의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월을 함유 플라스틱 섬유 복합 재질 용기에서 24 웰 플레이트를 유지한다. 20 ° C와 주위 공기에 가습 인큐베이터에서 컨테이너를 저장합니다. </li><li> 세포는 보통 24 시간 이내에 실험을위한 준비가되었을 때 형태 학적 분화와 표현GFP 마커의 이온이 완료됩니다. 세포는 최대 2 주 동안 문화 유지 될 수 있지만, 도금 후 보통 7-9일까지 대부분의 건강. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위해 하루에 한 번 교체해야. </li></ol>

C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세스, 또는 특정 세포 유형의 분리를 요구하는 방법의 적용을 제한하는 가압 표피 내에 갇혀있다. C. elegans의 세포 배양 방법은 본 모델 생물의 많은 한계에 대한 해결책이다. 이 논문에서 우리는 배아 C.를 분리 및 배양에 대한 업데이트 방법을 설명 엘레 대규모의 세포는 크리에 의해 초기 작품을 기반으로 동료 1. 우리 ALSO C.의 생리 학적 과정과 유전 적 요구 ...

예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (&gt; 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 </EM&gt; 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). 많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다. 배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스. 초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24. 결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco 한천 과립</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 트립톤</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이세스 Griseus</td><td>시그마</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peanut Lectin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glucose</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amin&#8211; 틸에테르), N,N,N',N'- 사산(EGTA)</td><td>시그마</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td> <td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO><4</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고압증기멸균 증류 H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>101-1000 &mu; l 블루 그래디에이티드 피펫 팁</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 멸균 피펫 개별 포장</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu; l) 팁 이젝터가 있는 피펫터</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 피펫 에이드, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>전송 플라스틱 피펫 멸균</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브 </td><td>미국 Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>멸균 18 게이지 바늘</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305196</tr><tr><td>멸균 10ml 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305482</tr><tr><td>플라스틱 주사기 필터 Corning 0,20 &mu; m 기공 크기 </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25mm 주사기 필터 w/5 &mu; m versapor 멤브레인</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15mm 페트리 접시 멸균</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15mm 페트리 접시 멸균</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12mm 직경 유리 커버 슬립</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>투명 세포 배양 플레이트, 24웰 플랫 바닥(뚜껑 포함</td>) <td>Thomas Scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- 미세 집게 </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경(x10 대물렌즈</td><td></td><td></td><td></td></tr> 포함)<tr><td>주변 공기 가습 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

배아 배양하는 방법<em&gt; c. 엘레</em&gt; 셀

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 ​​초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.

C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레 크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의&gt; 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 실패하고 그들이 살아 있는지 명확하지 않다 세포. 세포의 분화 도금 후 2 ~ 3 시간을 시작 ~ 24 시간 동안 계속된다. 24 시간 내, 세포는 특정 형태학에 걸릴. 따라서, 신경이 과정 1,18-20을 보내, 근육 세포는 루멘 (17)을 형성 생체 내 1, 운하 세포에서 볼 수있는 것과 비슷한 손가락 같은 긴 구조를...

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 배아 단계의 sea elegant 세포를 분리하여 인비트로(in vitro)에서 배양하는 것입니다. 이를 위해 먼저 다량의 성체 동물을 사육합니다. 그다음 성체로부터 알을 분리합니다.그 다음, 알껍질을 용해하기 위해 키티나아제(chitinase)로 알을 처리합니다. 마지막으로, 세포를 수동으로 분리하여 배양을 위해 플레이트에 분주합니다. 궁극적으로 면역형광법, 현미경 관찰, 전기생리학 및 칼슘 이미징 기술을 통해 세포 특이적 마커의 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.해당 절차는 포스닥 연구원이 실험실에서 시연할 예정입니다. 최소 4개의 sea elegance 플레이트를 성체 단계까지 배양하고, 텍스트 프로토콜에 따라 배지와 용액을 준비하십시오. 먼저 미리 준비한 피넛 렉틴 스톡 용액 튜브를 준비하여 난자 분리를 시작합니다.오토클레이브 처리된 커버슬립을 24웰 플레이트의 각 웰에 배치하고, 각 커버슬립에 200 µL의 땅콩 렉틴을 첨가한 후 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 용액을 흡입하여 제거하고 멸균수로 웰을 세척합니다. 이는 세포 응집을 방지하기 위해 땅콩 렉틴의 모든 흔적을 제거하기 위함입니다.그다음 멸균 오토클레이브 멸균수를 사용하여 한천 배지에서 성체 GR을 씻어내고, 현탁액을 두 개의 멸균 50 milliliter 원심 분리 튜브에 수집합니다. 벌레들이 바닥에 가라앉을 수 있도록 튜브를 얼음에 최대 5분 동안 둡니다. 전송 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 오토클레이브 멸균수로 교체합니다. 벌레를 200 G에서 10분 동안 원심 분리합니다.마지막 세척 후, 벌레를 신선한 멸균수에 재현탁하고 멸균된 15 milliliter 원심분리관에 옮긴 뒤 200 G에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 벌레가 완전히 펠렛화되지 않은 경우, 튜브를 얼음에 5분 동안 둡니다. 벌레가 완전히 가라앉으면 물을 제거하고 5~6 milliliter의 용해액을 추가합니다.그 후 현탁액을 5~10분 동안 부드럽게 흔들어 섞으며, 2~3분마다 현탁액 한 방울을 커버 슬립에 떨어뜨려 실체 현미경으로 용해 여부를 확인합니다. 벌레의 72~80%가 용해되면, 9 mL의 egg buffer를 첨가하여 용해 반응을 중단시킵니다. 이후 원심 분리 단계부터는 알의 재오염을 방지하기 위해 분젠 버너에 불을 붙여 계속 켜 둡니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 용액이 맑아질 때까지 egg buffer를 사용하여 펠렛을 3~4회 충분히 세척합니다. 다음으로, 알을 동물 사체로부터 분리하기 위해 마지막 상층액을 제거한 후, 펠렛을 2 mL의 멸균 egg buffer에 현탁시키고 egg buffer에 녹인 60% sucrose 2 mL를 첨가합니다.원심분리를 하기 전 용액 내의 알들을 잘 섞어줍니다. 200 G에서 20분 동안 원심분리한 후, 튜브를 원심분리기에서 조심스럽게 꺼냅니다. 알들은 용액의 상단에 떠 있을 것입니다.따라서 피펫과 멸균된 1 mL 팁을 사용하여 알을 새 멸균 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 라미나 플로우 후드 내에서 멸균된 egg buffer를 사용하여 알을 3회 세척합니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해, 펠렛 형태의 알을 2 mg/mL kinase 1 mL에 재현탁한 후 새 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.효소의 활성도에 따라, 난각의 약 80%가 소화될 때까지 상온에서 튜브를 10분에서 30분 동안 흔들어 줍니다. 난자를 900 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, L 15 배지 3 mL를 첨가하고, 난자를 직경 6 cm 플레이트로 옮긴 뒤 18게이지 바늘이 장착된 10 mL 멸균 시린지를 사용하여 수동 해리를 시작합니다.해리 정도를 모니터링하려면, 현탁액 한 방울을 새 Petri dish에 넣고 현미경으로 관찰하십시오. 세포의 약 80%가 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다. 세포 덩어리, 소화되지 않은 난자 및 부화한 유충을 제거하려면, 현탁액을 5 µm 필터로 부드럽게 여과하고 L 15 배지 4~5 mL를 추가로 통과시켜 배양할 세포를 회수하십시오.여과액을 900 G에서 3분 동안 원심분리한 후, 웰당 1 mL의 완전 L 15 배지를 사용하여 세포를 다시 현탁하고, 플레이트를 밀봉된 습윤 챔버에 넣어 20 °C의 주변 공기 조건에서 보관합니다. 분리된 배아 세포가 분화하려면 기질에 부착되어야 합니다. 분화 과정은 플레이팅 후 약 2~3시간 후에 시작되어 약 24시간 동안 지속됩니다.인비트로(in vitro)에서의 형태학적 특징은 인비보(in vivo)에서의 특징과 매우 유사합니다. 예를 들어, 여기에서 보여주듯이, LM 및 PLM 촉각 뉴런은 인비보에서와 마찬가지로 하나가 다른 하나보다 더 긴 두 개의 뉴런 돌기만을 발달시킵니다. 이는 elegan 세포의 분화를 유도하는 분자적 기전 중 적어도 일부는 세포 자율적이며, 따라서 재현될 수 있음을 시사합니다.세포 특이적인 인비트로(in vitro) 단백질 마커와 번역 후 변형 또한 인비트로에서 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서 보여주듯 alpha tubulin의 acetylated 형태는 바다 달팽이의 touch neuron에서만 나타나며, touch neuron의 인비트로 돌기들은 acetylated alpha tubulin에 대해 생성된 항체로 염색됩니다. 또한, 이 패널에서 볼 수 있듯이, 배양된 touch neuron은 실제 인비보(in vivo)에서 touch neuron의 사멸을 유발하는 독성 돌연변이 채널인 MEC four D를 발현합니다.MEC four DPE 4G FP 균주로부터 준비된 GFP 발현 뉴런이 처음에 배양액에 존재하지만, 이후 퇴행합니다. 그러나 여기서 보여주는 것과 같이, in vivo에서와 마찬가지로 IDE와 dantrolene 처리를 통해 세포의 사멸을 막을 수 있습니다. sea elgan 배양 세포에서 칼륨 이온, 비선택적 이온 및 도파민 운반체 의존적 채널을 연구하기 위해 패치 클램프 기술이 사용됩니다.세포의 크기가 매우 작기 때문에 유리 피펫은 팁 부분이 작아야 하며, 증가된 입력 저항을 상쇄하기 위해 원추형 부분이 넓어야 합니다. 또한, 흡입을 통해 세포 전체 접근(whole cell access)을 시도하는 것은 세포에 손상을 줄 수 있으므로, 피펫 팁 아래의 막 패치에 고전압 펄스를 인가하는 방식이 더 높은 성공률을 보입니다. 이 그림에서는 전압 개폐성 칼슘 채널의 역할을 연구하기 위해, ION 4를 사용하여 막을 투과성 있게 만들고, 칼슘의 존재 또는 부재 하에서 칼슘 이미징을 위해 chameleon YC 2.12를 발현하는 촉각 뉴런을 교정합니다.또한, 촉각 뉴런의 평균 유리 칼슘 농도는 200나노몰(nM)인 것으로 결정되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 C. elegans 배아 세포를 체외에서 분리 및 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

이 동영상은 in vitro에서 배아 예쁜꼬마선충 세포를 분리하고 불임 배양하는 방법을 소개합니다.

효소 분해 및 수동 해리: 세포 배양을 위해 예쁜꼬마선충 배아를 준비하는 방법

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.

배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

배우세요 C. elegans 배아 세포 대규모 배양 프로토콜을 통해 키티나아제 처리 및 수동 분리로 세포 특이적 유전자 발현을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에 활용됩니다.

배아 배양하는 방법

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