September 21st, 2013
우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.
이 절차의 전반적인 목표는 시험관내, 배아, 바다의 우아한 세포를 해리하고 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 많은 양의 무덤 동물을 성장시킴으로써 달성됩니다. 다음으로 알은 성충과 분리됩니다.
그런 다음 난자를 키티나아제로 처리하여 난각을 녹입니다. 마지막으로, 세포는 배양을 위해 수동으로 해리되고 도금됩니다. 궁극적으로 면역형광, 현미경, 전기생리학 및 칼슘 이미징 기술을 통해 세포 특이적 마커의 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 실험실인 rel ti입니다. GR 성인 무대까지 최소 4개의 바다의 우아함을 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 미디어와 솔루션을 준비한 후. 먼저 미리 준비된 땅콩 렉틴 스톡 용액 튜브를 깎아 난자 분리를 시작합니다.
오토클레이브 커버 슬립을 24웰 플레이트의 웰에 놓고 각 커버 슬립에 200마이크로리터의 땅콩 렉틴을 추가하고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 용액을 흡입하고 멸균수를 사용하여 우물을 씻습니다. 일단 땅콩 렉틴의 모든 흔적을 제거하여 세포 응집을 방지합니다.
그런 다음 멸균 오토클레이브 물을 사용하여 한천 플레이트에서 GR 성인을 씻어내고 두 개의 멸균 원추형 50밀리리터 튜브에 현탁액을 수집합니다. 튜브를 얼음 위에 최대 5분 동안 올려 놓아 벌레가 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다.전사 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 오토클레이브 물 원심 분리기로 교체합니다. 200G에서 10분 동안
벌레를 굽습니다.최종 세척 후 신선한 멸균 물에 벌레를 매달아 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴 후 200G에서 10 분 동안 다시 회전시킵니다. 벌레가 완전히 펠릿화되지 않으면 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 벌레가 완전히 가라앉으면 물을 제거하고 5-6ml의 용해 용액을 추가합니다.
그런 다음 5-10분 동안 그리고 2-3분마다 서스펜션을 부드럽게 흔든 다음 커버 슬립에 서스펜션 한 방울을 떨어뜨리고 실체 현미경으로 용해를 확인합니다. 72 80%의 벌레가 용해되면 이 시점에서 앞으로 회전하기 전에 9ml의 계란 완충액을 추가하여 용해 반응을 중지하고 분젠 버너에 불을 붙이고 계란의 재오염을 방지하기 위해 계속 켜두고, 상등액을 조심스럽게 제거하고 계란 완충액을 사용하여 용액이 맑아질 때까지 펠릿을 3-4회 철저히 씻습니다. 다음으로, 동물 사체 수지에서 난자를 분리하기 위해 최종 상등액을 제거한 후, 펠릿을 2 밀리리터의 멸균 난자 완충액에 현탁시키고 2 밀리리터의 60 % 자당을 난자 완충액에 첨가한다.
20분 동안 원심분리하기 전에 계란을 용액에 잘 섞습니다. 200G에서 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 계란은 용액 상단에 떠 있을 것입니다.
따라서 피펫과 멸균 1밀리리터 팁을 사용하여 계란을 새로운 멸균 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 멸균 난자 완충액을 사용하여 층류 후드 아래에서 작업하는 동안 계란을 세 번 씻습니다. 박테리아 오염을 피하기 위해 펠릿화된 난자를 1밀리리터당 2밀리그램 키나아제에 현탁시키고 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
달걀 껍질의 약 80%가 소화되었을 때 효소의 신선도에 따라 실온에서 10-30분 동안 튜브를 흔듭니다. 달걀을 900G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후 L 15 배지 3ml를 넣고 난자를 직경 6cm의 플레이트에 옮긴 다음 18게이지 바늘이 있는 10ml 멸균 주사기를 사용하여 수동 해리를 시작합니다.
해리 정도를 모니터링하려면 현탁액 한 방울을 새 페트리 접시에 넣고 현미경으로 봅니다. 세포의 약 80%가 해리될 때까지 계속합니다. 세포 덩어리, 소화되지 않은 난자 및 부화한 유충을 제거하려면 5미크론 필터를 통해 현탁액을 부드럽게 여과하고 필터를 통해 추가로 4-5밀리리터의 L 15 배지를 실행하여 세포를 회수하여 세포를 배양합니다.
900G에서 여과액을 3분 동안 원심분리한 후, 리서스는 웰당 1밀리리터의 완전한 L 15 배지에 셀을 현탁시키고 플레이트를 주변 공기에서 섭씨 20도의 습하고 밀폐된 챔버에 보관합니다. 분리된 배아를 분화하기 위해서는 세포가 기질에 부착되어야 합니다. 차별화 공정은 도금 후 약 2-3시간 후에 시작되어 약 24시간 동안 계속됩니다.
in vitro의 형태학적 특징은 in vivo와 매우 유사합니다. 예를 들어, 여기에서 볼 수 있듯이 LM 및 PLM 터치 뉴런은 생체 내에서와 같이 한 개가 다른 것보다 더 긴 두 개의 뉴런 프로세스만 발달합니다. 이것은 엘레간 세포에서 분화를 주도하는 분자 메커니즘 중 적어도 일부는 세포 자율적이므로 다시 요약할 수 있음을 시사합니다.
세포 특이적인 In vitro 단백질 마커 및 번역 후 변형도 in vitro에서 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 알파 튜불린(alpha tubulin)은 솟은 알파 튜불린(sated alpha tubulin)에 대해 제기된 항체로 염색된 터치 뉴런의 체외 과정(in vitro process)에서 볼 수 있듯이 바다 엘간(sea elgan)의 접촉 뉴런에서만 포화된 뉴런입니다. 또한, 본 패널에서 볼 수 있듯이, 배양된 터치 뉴런은 실제로 생체 내에서 터치 뉴런의 사멸을 유발하는 독성 돌연변이 채널 MEC 4 D를 발현합니다.
MEC 4 개의 DPE 4G FP 균주에서 제조 된 뉴런을 발현하는 GFP는 처음에는 배양에 존재하지만 그 후에는 퇴화합니다. 그러나, in vivo와 마찬가지로, 세포는 여기에 나타난 바와 같이 IDE와 단트롤렌으로 처리함으로써 죽음으로부터 구출될 수 있다. 패치 클램프 기술은 sea elgan 배양 세포에서 칼륨 onic, onic, 비선택적 및 도파민 수송체 의존 채널을 연구하는 데 사용됩니다.
셀의 크기가 작기 때문에 유리 피펫은 증가된 입력 저항을 상쇄하기 위해 작은 팁과 넓은 원뿔을 가져야 합니다. 또한 세포를 손상시킬 수 있는 흡입을 통해 전체 세포에 접근하는 것보다 피펫 팁 아래의 멤브레인 패치에 고전압 임펄스를 가하면 더 큰 성공을 거둘 수 있습니다. 이 그림에서 전압 의존성 칼슘 채널의 역할을 연구하기 위해 ION 4는 칼슘의 부재 또는 존재 하에서 칼슘 이미징을 위해 막을 투과하고 카멜레온 YC 2 포인트 12를 발현하는 터치 뉴런을 보정하는 데 사용됩니다.
또한, 접촉 뉴런의 평균 유리 칼슘 농도는 200나노몰 어금니인 것으로 확인되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 체외 분리 및 배양 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우아함, 배아 세포를 보세요.
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이 기사는 배아 C. elegans 세포의 대규모 배양을 위한 수정된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 체외에서 이러한 세포의 분화를 가능하게 하여 세포 특이적 방식으로 유전자 발현 연구를 가능하게 합니다.
This method enables scalable isolation and culture of embryonic C. elegans cells, providing a genetically tractable system for early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobiology and developmental pathways. By supporting long-term in vitro survival and differentiation, it facilitates reproducible phenotypic screening and biomarker discovery using electrophysiology, imaging, and molecular profiling. The approach enhances predictive confidence in target engagement studies by recapitulating in vivo-like cellular behaviors and marker expression in a controlled, high-throughput compatible format.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling early biological de-risking before significant investment in lead optimization.