자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

이 절차의 전반적인 목표는 장 조직 공학을 위한 천연 무세포 골격을 만드는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 상장간막 동맥(superior mesenteric artery) 또는 SMA인 캐뉼러(cannuling)를 하고 혈관 접근과 함께 소장을 적출하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 내강내 파편이 씻겨 나가고 내강내 및 혈관 캐뉼러가 연동 펌프에 연결됩니다.

다음으로, 소장에 섭씨 4도에서 24시간 동안 탈이온수를 관류합니다. 마지막 단계에서는 소장에 소듐 데옥시, 코트, DNA를 실온에서 관류합니다. 궁극적으로, 소장의 완전한 탈세포화와 그 구조 및 구성 요소는 각각 조직학과 전자 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

우리는 현재 어린이와 성인 모두에게 영향을 미치는 파괴적인 상태인 장 부전이라는 임상적 문제에 직면해 있습니다. 부모의 영양 섭취와 기존의 이식은 완전한 치료를 제공하지 않습니다. 다음 비디오에서 볼 수 있듯이 3차원 혈관화된 장 골격의 생산은 부전 치료로 확장됩니다.

이 기술에서 주목할 만한 점은 부드러운 디지털화 화학 물질을 사용하면 전자 현미경 결과에서 알 수 있듯이 장내 미세 구조를 보존할 수 있다는 것입니다. 또한, 문명에 따른 계층적 혈관 네트워크의 유지는 숙주에 다시 연결될 수 있는 구조의 시딩을 가능하게 합니다. 혈액 공급 연동 펌프에 두 개의 튜브를 장착하는 것으로 시작한 다음 최대 속도로 15분 동안 연동 펌프의 튜브를 통해 70% 에탄올을 흘린 다음 새로 준비된 PBS AA를 다시 15분 동안 실행합니다.

펌프를 세척 한 후 스프레이를 뿌리고 70 % 에탄올로 안락사 된 250-350g spra dolly rat의 복부를 닦습니다. 그런 다음 오토클레이브 멸균 수술 기구를 사용하여 복부를 XO 치골 개복술 절개를 수행하여 70% 에탄올이 뿌려진 종이 타월 위에 동물의 오른쪽에 있는 소장을 절제하는 깨끗한 수술 영역을 확인합니다. 조직의 탈수와 세포외 기질의 변성을 방지하기 위해 P-B-S-A-A로 장을 지속적으로 적시도록 주의하십시오.

다음으로, 대동맥에서 장을 향해 90도 각도로 발생하는 SMA를 찾습니다. SMA 주위에 봉합사를 놓고 매듭을 준비합니다. 27 게이지 캐뉼라를 사용하여 대동맥에서 SMA로 들어간 다음 혈관 벽이 찢어지지 않도록 바늘을 빠르게 빼냅니다.

이제 캐뉼라의 플라스틱 튜브를 SMA로 전진시키고 Vicryl 5 oh 봉합사로 튜브를 고정한 다음 10ml의 P-B-S-A-A를 주입하여 캐뉼러를 확인합니다. 다음으로, 대장을 해부할 때 대변이 누출되지 않도록 가위를 사용하여 SMA의 근위부 및 원위부 대동맥을 절개하고 대변이 누출되지 않도록 대동맥을 절개하고 회장 접합부의 근위부 끝에 실크 5 봉합사 매듭 하나를 놓고 S자 결장의 원위 끝에 하나를 놓습니다. 그런 다음 두 매듭 사이의 말단 회장과 결장을 자르고 대장을 제거합니다.

이제 주노 십이지장 접합부에서 소장을 절단하고 장이 복부와 가질 수 있는 결합 조직 연결을 제거합니다. 소장을 PBS aa가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 플라스틱 후방 피펫을 사용하여 장의 근위부를 캐뉼링하고 봉합사로 제자리에 고정합니다.

마지막으로, 60ml 주사기의 루어 잠금 장치에 맞도록 피펫을 자른 다음 60ml의 P-B-S-A-A를 두 번 세척하여 장 내강을 세척하여 대변과 부스러기를 제거합니다.탈세포화 과정을 시작하기 전에 장 내강과 혈관 캐뉼라 내에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 3방향 스톱 콕을 혈관 캐뉼라에 연결하고 페트리 접시를 용기에 넣어 넘쳐나는 용액을 수집합니다. 다음으로, 마스터 플렉스 LS 가변 속도 롤러 펌프를 통해 시간당 0.6밀리리터의 속도로 탈이온수를 흐르기 시작합니다.

거품이 말단 끝에서 빠져나오도록 조직을 조심스럽게 다루십시오. 캐뉼러에서 모든 기포가 제거되면 장치를 냉장실로 옮깁니다. 그런 다음 처음 1시간 동안 시간당 0.6밀리리터씩 24시간 동안 흐르는 탈이온수로 장 내강과 혈관 나무를 모두 관류하여 탈세포화 과정을 시작합니다.

장치를 정기적으로 점검하여 모든 연결이 안전한지 확인하십시오. 누출이 최소화되고 장 내에 기포가 존재하지 않습니다. 24시간 후 탈세포화 장치를 다시 실온으로 옮깁니다.

장의 색은 흡입 후드 아래에서 밝은 분홍색으로 변경되어야 합니다. 탈이온수 300밀리리터에 4% 용액을 만들기 위해 충분한 나트륨 데옥시 코팅의 무게를 잰다. 와류를 사용하여 용액이 투명해질 때까지 혼합합니다.

이제 탈이온화 용액을 sodium deoxy collate로 교체하십시오. 연결을 확인하십시오. 거품을 제거하고 4시간 동안 시간당 0.6ml의 속도로 소장을 관류합니다.

sodium deoxy collate 단계 후 조직이 투명해집니다. 혈관 네트워크의 유지는 펌프에 PBS AA를 추가한 후에도 분명해집니다. 나트륨 deoxy, 코팅제 및 DNA 1 사이의 상호 작용을 피하기 위해 PBS AA로 장을 30회 세척합니다.

그런 다음 갓 준비한 DNA를 실온에서 시간당 0.6밀리리터의 속도로 조직에 관류합니다. 3 시간 후, 골격을 조직 배양 후드로 옮기고 정화조 기술을 사용하여 플레이트를 교체하십시오. 연동 펌프의 튜브를 에탄올을 통해 다시 살균합니다.

P-B-S-A-A로 마지막으로 장을 30분 동안 세척하여 탈세포화 용액의 잔여물이 모두 제거되었는지 확인합니다. 마지막으로, 스캐폴드를 UV 가교제로 옮기고 두 번의 멸균 주기를 실행합니다. 그런 다음 스캐폴드를 P-B-S-A-A에 저장합니다.

3일마다 솔루션을 변경합니다. 성공적인 탈세포화가 이루어지면 골격은 천연 창자와 유사한 거시적 외관을 가져야 하지만 반투명한 벽이 있어야 합니다. 거시적 건축의 보존은 또한 혈관 나무의 개통성에 의해 분명해져야 합니다.

염료가 SMA 캐뉼러를 통해 주입되면 골격 전체에 고르게 분포되어 모세관 나무에 도달해야 합니다. 골격에는 핵 및 세포질 물질이 없어야 하며, 이를 평가할 수 있어야 합니다. DNA 정량화 키트와 간단한 조직학적 분석을 사용하여 헤마틴 및 어오인 염색은 이 이미지에서 입증된 것처럼 소장층을 보존하면서 핵 및 세포질 물질이 없음을 입증해야 합니다.

특히, 내강 쪽의 융모와 크립의 유지는 주사 전자 현미경 검사 후에 분명해야 합니다. 콜라겐, 엘라스틴 및 글리코 아민 글리칸과 같은 세포외 기질 구성 요소의 추가 보존도 여기에 표시된 바와 같이 예상되어야 합니다. 예를 들어, Massen Tri CHRO 염색을 통해 골격의 온전한 결합 조직을 입증할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 천연 세포 장 골격을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.