Name: FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 학습하세요 FDA 승인 Vero 세포를 이용한 재조합 아레나바이러스 생성 프로토콜로 백신 개발을 위한 바이러스 구출 및 면역형광법 확인 방법을 탐색하세요.

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우리는 arenavirus 역 유전학 기술과 플라스미드의 개발 및 개선을위한 JCT 및 LM-S 실험실에서 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. 우리는 또한 기술 지원 Snezhana Dimitrova 감사합니다. JUNV NP (SA02-BG12)로 지정 단클론 항체는 BEI 자원 (NIAID의 바이오 디펜스 및 신흥 감염증 연구 자료 저장소)로부터 얻은 것입니다. BYHC는 기관 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상에서 허가 번호 GM068411에 의해 지원되었다. EO-R은 Fullbright-Conicyt (BIO 2008)와 로체스터 백신 원정대 (2012)받는 사람이다. EO-R 현재 지원은 로체스터 대학의 교수 개발 및 다양성 사무실에서 다양성과 학문적 우수성에 대한 박사 원정대에 의해 제공됩니다. LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 센터 (HHSN266200700008C)에 의해 재정 지원, 그리고바이오 디펜스 면역 모델링 (HHSN272201000055C)를위한 로체스터 센터의 대학. JCT 실험실에서 연구 보조금 RO1 AI047140, NIH에서 RO1 AI077719, 및 RO1 AI079665에 의해 지원되었다.

1. Arenavirus 구조 형질 우리의 구조 시스템은 핵 단백질 (NP)와 RNA 의존적-RNA 중합 효소 (L), RNA 복제 및 arenavirus 게놈의 유전자 발현에 필요한 바이러스 횡단 행동 요소를 인코딩 중합 효소 II의 단백질 발현 플라스미드 모두의 사용을 기반으로 한 7, 19, 및 세포 S의 RNA 중합 효소 I (POL-I) 및 L antigenome RNA 종 7을 통해 세포 내 합성을 지시 할 수있는 플라스미드. 우리의 연구에서 우리는 내가 발기인 및 쥐 종결 서열 (그림 2) 인간의 효소를 사용 pCAGGs 단백질 닭 β-액틴 프로모터 및 polyadenylanation (PA) 신호 시퀀스를 사용하여 플라스미드 표현하고, 인간의 폴-I 플라스미드를 사용 . S와 L RNA 세그먼트는 HPOL-I에 의한 전사에 따라 게놈 RNA 세그먼트의 생성을 허용 할 antigenomic 방향 HPOL-I 플라스미드에 복제됩니다. 야생 타이의 구조에 대한PE 재조합 LCMV (rLCMV)와 몰래 # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP 각 바이러스의 L은 각각의 인간의 폴-I S와 L RNA 세그먼트 (그림 3)와 함께 공동 형질 전환 하였다. 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 # 1 (# 1 r3Candid) 몰래의 생성은 유​​사한 프로토콜을 따랐지만 S 세그먼트는 두 개의 서로 다른 폴-I S 플라스미드, 각 인코딩 특유의 리포터 유전자로 분할되었다 : 하나, NP 개방 판독 프레임 (ORF)은 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 유전자 (HPOL-I S GFP / GP)와, 다른에서, 바이러스 당 단백질 전구체 (GPC)를 ORF가 Gaussia 루시 페라 제 (Gluc) 리포터 유전자로 대체됩니다로 대체되었습니다 (HPOL-I S NP / Gluc). 프로토콜의 개략도는 그림 4에 나와 있습니다. 다음과 같은 형질 감염 프로토콜은 6 잘 플레이트 설립되었습니다. <ol><li> OptiMEM-lipofectamine과 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 매체 250 μl를 준비하고, 따라의 바이러스 구조, 10 - 형질 당 LPF2000 12 μg (1 ㎍ / ㎕의) (표 1). DNA의 μg 당 2.5 μg LPF2000의 비율이 권장됩니다. RT에서 10 분 - 5 알을 품다. 한편, 별도의 microcentrifuge 관 (단계 1.2)에서 플라스미드의 transfection 혼합물을 준비합니다. </li><li> 플라스미드 DNA의 형질 전환 혼합물 : 각 바이러스 구조에 대한 권장 금액 (표 1 참조)를 사용 microcentrifuge 관에서 플라스미드 형질 칵테일을 준비합니다. OptiMEM 50 μL의 최종 볼륨을 가져와. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물 : 플라스미드 DNA의 형질 혼합물 (단계 1.2)에 OptiMEM-LPF2000 혼합물 (단계 1.1) 250 μl를 추가합니다. RT에서 30 분 - 20이 혼합물을 품어. 한편 준비하고 형질 반응 당 1 × 10 6 베로 세포를 계산합니다. 베로 세포 현탁액에 형질 전환됩니다. </li><li> 베로 세포의 준비 : 베로 CELLS 100 밀리미터 접시에서 배양된다. 시작하기 전에 37 ° C.에 1X PBS, DMEM 10 % FBS 1 % PS 미디어, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 혼합물을 가지고 <ol><li> 1X PBS의 10 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML로 세포를 Trypsinize 세포 분리 (약 5 분) 때까지 기다립니다. 부드러운 어쩌면 완전히 요리에서 세포를 분리하는 데 필요한 탭핑. </li><li> 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을. </li><li> 원심 분리기에서 1,000 rpm으로 5 분 동안 세포를 원심 분리기. </li><li> DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을하고 혈구를 사용하여 셀을 계산 1 × 10 6 세포 / ㎖로 농도를 조정합니다. 1 × 10 형질 당 6 베로 세포가 최상의 결과를 생산 - 그것은 0.5 관찰되었다. </li></ol></li><li> LPF2000/DNA 세포를 혼합 : 20 후 - 30 분 실온 배양 (단계 1.3)로 베로 세포를 1 ㎖ (1 × 10 6) (단계 1.4)을 추가상온에서 5 분 OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물을 품어. </li><li> 6 잘 접시에 씨앗 LPF2000/DNA-cell 믹스 : 6 잘 플레이트의 우물에 DNA-LPF2000 - 베로 혼합물 (단계 1.5)를 추가합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트를 흔들 37 배양기에서 형질 부화 하룻밤하자 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 형질 매체 변경 : 약 16-24 시간의 포스트 형질을, 형질 미디어를 제거 감염 매체 2 ML을 추가하고 추가로 48 시간 동안 형질 전환 세포를 품어. </li><li> 세포 통로 : 감염 미디어에서 배양 48 시간 후 조직 배양 상층 액 (TCS)를 제거하고 100mm 접시에 형질 전환 세포를 전달합니다. 형질 세포가 바이러스 입자를 생성하기 위해 추가 배양이 필요하기 때문에 TCS는 거의 전염성 바이러스를 포함하지 않습니다. 세포의 통과를 위해 : <ol><li> 1X PBS 2 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포에게 승 Trypsinize<html> i 번째 0.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 ML과 세포가 분리 될 때까지 기다립니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 1 ML에있는 세포를 resuspend을. </li><li> 5,000 rpm에서 5 분, 4 ° C의 microcentrifuge에 대한 세포를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 감염 미디어 1 ML에있는 세포를 resuspend을하고 100mm 접시에 세포를 전송합니다. 8 ml의 바이러스를 농축 세포의 건조 등을 방지하기 위해 충분한 볼륨으로, 전염성 미디어, 접시에 전체 볼륨을 가져와. </li></ol></li><li> 부드럽게 37 100 밀리미터 접시를 흔들어 인큐베이터 베로 세포 배양을 계속 ° C와 5 % 72 시간 동안 CO 2. </li><li> TCS의 컬렉션을 : 72 시간 배양 후, 15 ML의 원심 분리기 튜브 TCS를 수집합니다. 원심 분리기에서 2,500 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 전염성 arenavirus는 TCS에서 발견되기 때문에 세포 파편 펠릿에서 제거하고 -80 TCS를 저장 ° C. </li></ol>재조합 Arenavirus 구조 르 &quot;&gt; 2. 확인 rLCMV 및 rCandid # 1의 성공적인 구조의 발견은 초점을 형성 단위 (FFU) 면역 분석 (IFA)를 통해 얻을 수 있습니다. 야생 형 바이러스 구조를 위해 우리는 바이러스 NP에 대한 특정 항체를 사용합니다. r3LCMV 및 r3Candid 중 1 따라서 형광 현미경 (GFP) 및 / 또는 발광 (Gluc)에 의한 항체의 필요없이 바이러스 탐지 및 적정 수 있도록 두 기자 유전자 (GFP 및 Gluc) 인코딩합니다. <ol><li> 야생형 재조합 arenavirus 구조 확인 : 적정 전날, PBS로 두 번 베로 세포를 씻어 trypsinize 80에 도달하는 96 - 웰 플레이트를 준비 - 90 % 합류 다음날 (4 × 10 4 세포 /도). 부드럽게 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 손으로 판을 흔들어. 문화 세포 하룻밤, 37 ° C 배양기 5 % CO 2. 감염을 진행하기 전에, 단층을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인 <ol><li> 순차적으로 희석 (10 배 희석) 바이러스가 포함 TCS는 OptiMEM에서 100 밀리미터 접시 (단계 1.10)에 형질 전환 세포에서 발견. </li><li> 시드 베로 세포에서 용지를 제거 1X PBS의 50 μL로 두 번 세척하고, 순차적으로 희석 바이러스 (단계 2.1) 50 μL와 세포를 감염. 37 1.5 시간 동안 세포를 감염 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 감염 후, 바이러스 접종을 제거 100 감염 미디어 μL / 잘을 추가하고 16를위한 세포를 배양 - 18 시간. 바이러스 다시 감염 바이러스 역가의 과다 추정 될 수있는, 18 시간 배양 한 후 발생할 수 있습니다. </li><li> 16시 - 18 시간 게시물 감염, 각 우물에서 TCS를 제거하고 RT에서 15 분, 1X PBS에 희석 4 % 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 다음으로, 고정 용액을 제거하고 세포를 permeabilize로 0.1 % 트리톤 X-100 실내 온도에서 10 분 동안, 1X PBS에 희석. </li><li> permeabilization 솔루션을 대기음 후, 세포에게 3 회 위스콘신 세척일 1X PBS. </li><li> RT에서 1 시간 1X PBS (차단 솔루션)에서 2.5 % 알부민 소 혈청 (BSA)로 세포를 차단합니다. 또한, 세포는 4 ° C에서 하룻밤 차단 항체 배양 다음날을 계속 할 수 있습니다. </li><li> 한편 일차 항체를 준비합니다. 솔루션을 차단에 LCMV와 몰래 # 1 특정 기본 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 / 차단 솔루션 항체를 원심 분리기. BEI 자원 (1:500 희석)에서 단클론 항-LCMV NP 항체 클론 1.1.3 (1시 반 희석) 16 단클론 항-JUNV NP 항체 SA02-BG12는 rLCMV의 탐지 및 rCandid # 1 사용할 수 있습니다 각각. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 차단 솔루션을 기음과 세포 일차 항체의 50 μl를 추가하고 37 1 시간 동안 품어 ° C. </li><li> 이 시간에 솔루션을 차단에 차 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 항체 / 차단 솔루션을 원심 분리기. 폴리기본 단클론 항체의 검출을위한 클론 토끼 항 마우스 IgG의 FITC 차 항체는 그림 5에서 관찰 된 이미지를 얻기 위해 사용되었다. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 일차 항체를 대기음 1X PBS로 3 회 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 차 항체를 추가 ° C. </li><li> 30 분 부화 후, 차 항체를 대기음하고 1X PBS로 3 회 세척한다. 세포는 두 ML (FFU / ㎖) 당 단위를 형성 초점을 계산하여 바이러스 구조 및 적정의 성공을 결정하는 형광 현미경을 사용하여 현재 관찰 할 준비가 된 것입니다. </li></ol></li><li> r3LCMV 및 # 1 r3Candid 바이러스의 구조 :이 바이러스는 두 기자 유전자를 표현하기 때문에, 그들의 GFP 식 또는 TCS의 Gluc 표현을 감지하는 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다 구출. 구조는 TCS의 Gluc의 발현에 의해 확인 할 수 있습니다. trisegmented 바이러스를 적정하기 위해, 우리는 2.1.4 단계 2.1를 수행하지만 세포가 B 할 필요가 없습니다전자 때문에 GFP 발현을 성공적으로 바이러스 구조를 결정하는 고정. 바이러스의 적정은 FFU / ㎖를 계산하여 결정됩니다. Gluc 표현, TCS에서 Gluc 식으로 성공적인 바이러스 성 구조를 확인하려면 Gluc 분석 키트 (Biolux Gaussia 루시 페라 제 분석 키트, 뉴 잉글랜드 Biolabs 사)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이를 위해 : <ol><li> 96 - 웰 하얀 접시 (평면 바닥의 microtiter 접시, 피셔 과학)에 피펫 TCS의 100 μl를. </li><li> luminometer (LumiCount, 팩커드 생명 과학)을 설정합니다. </li><li> 각 샘플에 100 μL Gluc 분석 실험 용액 (제조업체가 권장)와 luminometer로 Gluc 리포터 유전자 발현을 측정 - 50를 추가합니다. 대조군으로, 야생형 바이러스에 감염된 세포에서 TCS의 Gluc 발현을 측정 하였다. </li></ol></li></ol> 3. 조직 배양 상층 액의 통과 바이러스 구조가 형질 전환 효율에 따라 달라집니다. 베로 세포가 표시되어다른 세포 라인 14보다 낮은 형질 전환 효율을 가지고 있습니다. TCS의 바이러스 역가가 낮은 경우, 바이러스를 증폭하는 72 시간 동안 0.01 (LCMV) 또는 0.1 (# 1 몰래)의 감염의 다중성 (MOI)에서 신선한 베로 세포를 감염.

<ol><li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li>
<li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+a+neglected+central+nervous+system+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+an+official+publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).</li>
<li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).</li>
<li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arenavirus+reverse+genetics%3A+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li>
<li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li>
<li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li>
<li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I%2FII-driven+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li>
<li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lassa+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+clinical+laboratory+sciences%22%5BJournal%5D)">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li>
<li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li>
<li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li>
<li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li>
<li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li>
<li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li>
<li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus%3A+its+application+for+H5N1+vaccine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li>
<li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li>
<li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li>
<li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li>
<li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li>
<li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 생성은 arenavirus 생물학의 여러 가지 측면의 조사를 위해 널리 사용되는 방법이되고있다. 여기에 우리가 arenavirus를 수행하여 현재 시스템에 중요한 개선을 문서화하는 것은 다른 전염성 질병에 대한 arenaviruses 백신 벡터에 대한 FDA의 승인 백신 후보의 잠재적 인 발생을 허용, 베로 세포에서 구출. 관련 실험 절차는 잘 설립 된 일반에 상당한 장애물을 제기하지 않아야합니다. 신중하게 일관된 성공을 보장하기 위해 모니터링해야 여러 가지 요인이, 그러나있다. 베로 세포의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 성 구조 매우 중요합니다. 또한, 재조합 arenavirus를 (적절한 세포 유지 보수 및 플라스미드 준비를위한 프로토콜 참조)를 생성하는 좋은 플라스미드 준비가 필수적이다. rLCMV 및 rCandi의 구조에 대한D # 1 야생형이나 베로 세포가 쉽게 <su...

Arenaviruses는 Arenaviridae 제품군에 속하는 bisegmented, 음의 가닥 RNA 게놈 3 싸여 바이러스입니다. arenavirus 게놈은 두 개의 분리 된 바이러스 세그먼트 3에서 ambisense 패션 개의 단백질을 인코딩합니다. 대형 (L) 부분은 RNA 의존 RNA 중합 효소 (L) 및 바이러스 신진의 주요 원동력 역할을하는 작은 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 손가락 단백질 (Z) 인코딩합니다. 소 (S) 부분은 바이러스 핵 단백질 (NP)와 표면 당단백 (GP) (그림 1)를 인코딩합니다. Arenaviridae 가족의 몇몇 일원은 인간 3 치명적인 출혈열 (HF)에 대한 책임이 있습니다. 원칙적으로 문제의 입원 환자 8, 9에서 높은 사망률을 일으키는 것으로 알려져 있습니다 라사 바이러스 (LASV)와 후닌 바이러스 (JUNV가) 있습니다. 이 바이러스는 각각 서부 아프리카와 농촌 아르헨티나에 발병하지만은,증가 여행 10에 의한 비 발병 지역에 LASV 및 JUNV의 수입 증가 우려가 있습니다. 일반적으로 인간의 심각한 질병과 관련이없는 있지만 또한, 프로토 타입 arenavirus 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV)는 면역 환자 6, 15 치명적인 감염 사례가되었습니다로 무시 병원균으로 간주하고 선천적 결함과 자연 유산에 대한 책임이 있습니다 임신 2, 십삼인치 현재이 없습니다 미국 arenaviruses 및 치료에 대한 백신은 부분적으로 만 효과가 종종 상당한 부작용과 관련된 클레오 아날로그 리바비린으로 제한됩니다 FDA 승인.에게 플라스미드 기반의 역 유전학 4 재조합 arenaviruses 7, 19 세대의 도입은 크게 arenavirus 연구 분야를 전진했다. 현재, 설치류 세포 (예 : BHK-21 등) GENER에 사용되는S와 L 세그먼트의 초기 전사를 지시 종의 특정 쥐 RNA 중합 효소 I (POL-I) 발기인에 의한 재조합 arenaviruses의 ATION. BHK-21 세포에서 그러나 바이러스 구조는 잠재적 인 백신 시드 후보로 재조합 arenaviruses의 생성에 대한 승인 방법 없습니다. 여기에서 우리는 프로토 타입 올드 월드 (OW) LCMV와 새로운 세계 (NW) 베로 세포에서 JUNV 몰래 # 1 균주의 효율적인 구조에 대한 인간의 POL-I 프로모터의 사용을 문서화합니다. 유사한 방법론을 사용하여, 우리는 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 몰래 # 1 (r3Candid # 1) 두 개의 서로 다른 S RNA 세그먼트 5로 인코딩 된 두 개의 추가 외부 유전자를 포함 arenaviruses를 생성합니다. 이 새로운 시스템은 높은 재현성과 간단한 프로토콜을 따르고 있지만, 바로 잠재적 인 백신 또는 백신 벡터 씨와 같은 재조합 arenaviruses의 생성에 구현 될 수뿐만 아니라.

<table><tbody><tr><td colspan="4">재료 및 방법</td></tr><tr><td colspan="4"> 세포주 Vero E6 (아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포)는 37 &deg로 유지됩니다. C 인큐베이터, DMEM 10 % FBS 1 % PS 내에서 5 % CO2 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586)에서 구할 수 있습니다. Plasmids hpol-I L을 제외한 모든 플라스미드는 37°C에서 성장할 수 있습니다. C, 16-18 시간 동안. 우리는 hpol-I L의 배양액을 30 &deg에서 재배하는 것이 좋습니다. C 24시간 플라스미드는 제조업체의 권장 사항에 따라 플라스미드 맥시 키트(EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek)를 사용하여 제조하고 -20°C에서 보관합니다. 정제된 DNA 플라스미드의 농도는 260 nm에서 분광 광도법으로 측정되며, 순도는 260:280 nm 비율을 사용하여 추정됩니다. 1.8-2.0 260:280 nm 비율의 제제는 바이러스 구조 목적에 적합한 것으로 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도 및 순도는 아가로스 겔 전기영동으로 확인해야 합니다. Viruses rLCMV(Armstrong 53b) 및 rCandid#1을 구하기 위해 설명된 프로토콜은 생물 안전성 수준(BSL) 2 조건에서 실행할 수 있습니다. TCS 및 세포를 포함한 오염된 물질은 폐기 전에 멸균해야 합니다. 다른 아레나 바이러스를 구하려면 더 높은 BSL 시설이 필요할 수 있으므로 적절한 안전/보안 조치를 따라야 합니다. 조직 배양 배지 및 솔루션 DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 소 태아 혈청(FBS) 50ml, 100X 페니실린/스트렙토마이신(PS) 5ml. 4 &deg;C에 보관하십시오. 이 배지는 Vero 세포의 유지 관리에 사용됩니다. Infectious Media: OptiMEM과 DMEM 10 %FBS 1 %PS의 2:1 혼합물. 4°C에 보관하십시오. 이 배지는 바이러스 감염 중에 사용됩니다. 10X 인산염 완충 식염수(PBS): NaCl 80g, KCl 2g, Na<>sub2HPO4.7H2O, KH2PO4 2g. ddH2O를 최대 1리터까지 추가합니다. pH를 7.3으로 조정합니다. 오토클레이브로 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오 . 1X PBS : < / 강한> ddH 2 O로 10X PBS 1:10을 희석하십시오. 오토 클레이브로 살균하고 실온에서 보관하십시오 . < >2.5 % BSA< / 강> : 1X PBS의 97.5 ml에 BSA 2.5g. 4 &deg;C에 보관하십시오. 이것은 IFA의 차단 솔루션으로 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

fda 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 arenavirus의 생성

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

arenavirus 역 유전학의 개발 및 구현 arenavirus 필드 4에있는 중요한 돌파구를 나타냅니다. 자신의 게놈 소정의 돌연변이와 재조합 전염성 arenaviruses를 생성하는 기능과 함께 셀 기반 arenavirus의 minigenome 시스템의 사용은 arenavirus 라이프 사이클의 다른 단계 바이러스 성 결정 요인의 기여에 대한 조사뿐만 아니라, 바이러스 호스트를 촉진했다 상호 작용과 arenavirus 병인 1, 3, 11의 메커니즘. 또한, trisegmented arenaviruses의 개발은 따라서 arenavirus 기반의 백신 벡터 애플리케이션 5의 가능성을 열어, 그 밖의 외국 유전자를 표현하는 arenavirus 게놈의 사용을 허용하고있다. 마찬가지로, 표현 리포터 유전자 할 수있는 단일 사이클 전염성 arenaviruses의 개발 highl 관련된 연구의 안전을 개선하기 위해 새로운 실험 도구를 제공합니다Y 병원성 인간 arenaviruses 16. 플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 세대는 지금까지 식품 의약품 안전청의 개발 (FDA) 허가 백신 또는 백신 벡터에 대한 몇 가지 장벽을 포즈 7,19 설치류 세포주의 사용에 의존하고있다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 FDA의 승인을 베로 세포에서 재조합 arenaviruses의 효율적인 세대는 여기에 대해 설명합니다.

재조합 야생형 arenavirus의 성공적인 구조는 IFA (그림 5)를 사용하여 바이러스 항원의 존재에 의해 확인됩니다. 재조합 trisegmented 바이러스의 경우, 성공적인 바이러스 성 구조는 형광 현미경 (그림 6A)에서 GFP 발현을 관찰하여 평가 될 수있다. 성공적인 구조는 더욱 Gluc 표현 (그림 6B)를 평가하여 확인됩니다. 야생 유형과 trisegmented arenavirus의 성공적인 구조를 보여주는 대표적인 결과는 위에 표시된 프로토콜을 사용 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig1.jpg" /> 그림 1. Arenavirus 게놈 조직과 virion의 구조. Arenaviruses는 bis...

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

이 절차의 전반적인 목표는 잠재적인 백신 또는 백신 벡터 시드 개발을 위해 FDA가 승인한 Vero 세포에서 재조합 아레나 바이러스 생성을 위한 간단하고 재현성이 높은 프로토콜을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 플라스미드 DNA transfection 혼합물을 조심스럽게 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 plasmid DNA transfection 혼합물로 Vero 세포를 transfection하는 것입니다.다음으로, 형질 주입된 세포를 100mm 접시로 확장해야 합니다. 최종적으로 마지막 단계는 야생형 바이러스 또는 바이형광 현미경을 이용한 면역형광과 트리스 분절 바이러스를 이용한 GIA 루시퍼라아제 발현을 통해 구조 및 린세포주와 같은 기존 방법과 비교하여 성공적인 바이러스 구제를 확인하는 것입니다. 이 프로토콜은 Vero 세포에서 신장 바이러스를 생성하며, 이는 FDA의 백신 개발 승인을 받았습니다.잠재적인 백신 시드 생성 외에도, 보고된 tri segmented 바이러스를 발현하는 유전자는 바이러스 검출을 위한 2차 분석 없이 헤드 스루풋 스크리닝에서 VIR에 대한 항바이러스제를 식별하는 데 적용할 수 있습니다. 먼저 250마이크로리터의 최적 배지를 준비하고 바이러스에 따라 실온에서 5-10분 동안 형질주입 배양당 10-12마이크로그램의 lipo 2000을 구출합니다. 이 시간 동안 각 바이러스 구출에 권장되는 양을 사용하여 별도의 마이크로 원심분리 튜브에서 플라즈마 형질 주입 혼합물을 준비합니다.최종 부피를 최적으로 50마이크로리터로 가져옵니다. 다음으로, 250마이크로리터의 최적 리포 혼합물을 혈장 DNA 형질주입 혼합물에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. Vero 세포를 먼저 평형화하기 위해 P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS 배지 및 트립신 EDTA 혼합물을 섭씨 37도까지 준비하여 세포국을 수확하고 5ml의 PBS로 배양액을 두 번 세척합니다.그런 다음 필요한 경우 세포 분리를 위해 1ml의 트립신 EDTA를 추가하고 부드럽게 두드려 세포를 완전히 분리합니다. 이제 15ml 원심분리 튜브에 10ml의 완전한 DMEM에 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1000RPM에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 10ml의 완전한 DMEM에 세포를 현탁시킵니다.세포를 세고 농도를 밀리리터당 6개의 세포에 1 곱하기 10으로 조정합니다. 실온에서 20-30분 배양한 후 최적의 레민, D

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고...

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

이 비디오는 한랭 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 만드는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 인간 세포를 양방향 플라스미드로 형질주입한 후 저온 배양에서 배양하여 백신 생산에 적합한 바이러스를 생성하며, 따뜻한 조건에서 복제가 감소하는 것이 특징입니다.

백신을 위한 재조합 생독감 인플루엔자 바이러스 생성

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

칠면조 (HVT)의 herpesvirus 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대에 대 한 벡터 플랫폼으로 널리 사용 됩니다. 이 문서는 통합된 NHEJ-CRISPR/Cas9 및 Cre Lox 시스템을 사용 하 여 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 세대에 대 한 간단 하 고 빠른 접근을 설명 합니다.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.

리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성

본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

여기에서 우리는 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산, 정제 및 정량화를 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt; 6 × 10,9 플라크 형성 단위 / mL를 산출하여 생체 내 동물 연구에 적합한 바이러스 양을 제공합니다. 생체내 안전성을 보장하기 위한 추가의 품질 관리 분석법이 기재되어 있다.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

학습하세요 FDA 승인 Vero 세포를 이용한 재조합 아레나바이러스 생성 프로토콜로 백신 개발을 위한 바이러스 구출 및 면역형광법 확인 방법을 탐색하세요.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

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