Name: 항체 염색법에 C. 엘레 동결 크래킹 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 C. elegans 항체 염색을 위한 동결 크래킹 기법을 활용한 단백질 국소화 연구 방법입니다. 이 기술은 화학적 처리를 최소화하여 효과적인 항체 염색을 가능하게 합니다.

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자금은 NSF CCLI 번호 0,633,618 및 오하이오 대학에 의해 제공되었다. 일부 변종은 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 대학원생 Reetobrata 바수는 비디오에 나타납니다.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
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</ol>

저자는 그녀가 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

동결 균열 프로토콜 C. 항체 염색을위한 여러 가지 방법 중 하나입니다 엘레. 그것은 벌레를 염색 할 수있는 비교적 간단한 방법을 제공하지만, 특정 시약을 필요로하고 최적의 결과를 위해 연습 않습니다. (그림 1에 나와있는) 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 슬라이드 준비 () 3 단계 참조 (2 단계와 3 단계) 빠른 고정을 참조하십시오 (1 단계와 선충의 2) 수동 압축을 참조하십시오. 첫째, 슬라이드에 선충의 밀착성을 최대화하기 위해, 대신 상업적으로 제조 된 슬라이드에 의존하는 고 분자량 (긴 중합체) 폴리 리신으로 슬라이드를 준비하는 것이 최상이다. 동결 균열 슬라이드는 전체 선충의 표피에 충실하도록 설계하는 동안 상용 슬라이드는 세포가 준수 할 수 있도록 폴리 라이신으로 코팅되어 있습니다. 둘째, 냉동 전에 슬라이드 사이에 벌레의 정확한 압축하는 절차는 매우 중요하다. 그것은 정확한 양을 사용하여 함께 슬라이드를 눌러 꾸준한 손과 연습이 필요개인 벌...

단백질의 세포 및 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 과학자들은 전통적으로 구체적으로 특정 단백질 1을 인식하는 선택 항체와 조직을 표시했다. C와 같은 일부 모델 생물에서 엘레, 항체 염색은 종종 더 빠르게 결과를 얻을 분자 유전 학적 기술에 의해 대체되었습니다. 이들은 발기인 및 관심과 녹색 형광 단백질의 유전자의 코딩 영역 사이의 유전자의 융합으로 이루어진 구조로 변형 생물체 (가) 있습니다. 그러나, 분자 기술은 진정한 프로와 높은 사본 번호 (C. elegans의에서 통상의 기술) 2,3에서 구조의 발현의 변화를 알 수있는 문제를 포함하여 유물의 숫자로 될 수 있습니다. 따라서 항체 염색은 생체 내에서 단백질 기능을 연구 많은 과학자의 골이 남아있다. 항체와 조직을 염색하는 것은 어려울 수 있기 때문에tibodies는 특정 형태 1에서 자신의 항원을 인식 할 수 있습니다. 예를 들어, 항체는 특정 방식으로 고정 만 변성 또는 손상 항원을 인식 할 수 있으며, 현장에서 항원을 인식하지 못할 수 있습니다. 선충의 항체 염색의 문제는 선충의 표피 조직에 대한 항체의 액세스를 차단, 상대적으로 불 침투성 장벽을 형성한다는 사실에 의해 악화된다. C. 항체 염색에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다 엘레 (우리의 이전 작업에서 검토 4). 그대로 얼룩이 &#39;웜&#39;방법은 동결 상대적으로 하드 정착 (포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드)에 해동하기 위해 개발되었습니다, 동결 해동 사이클은 정착 5의 빠른 침투를 허용하는 표피를 해독하는 데 도움이됩니다. 방법은 제, 콜라게나 제, 또는 둘 모두를 감소 5-7 치료를 포함; 고정 후, 표피는 항체의 침투를 허용하기 permeabilized 하였다. 이 treatments는 형태를 유지하지만, 종종 항체 인식을 감소 시키거나 파괴. 다른 방법은 항체의 침투를 허용하는 해부 8 있습니다. &quot;동결 균열은&quot;항체가 9-10 염색 할 수 있도록 반 그대로 웜의 내부에 액세스 할 수있는 한 가지 방법입니다. 콜라게나 제 및 환원 처리를 회피하면서 동결 크래킹 정착 다양한 조건으로 행할 수있다. 선충은 두 접착제 슬라이드 사이에 냉동 한 다음 슬라이드가 분리되어, 하단 슬라이드에 선충의 대부분 상단 슬라이드에 표피의 대부분을 떠나고있다. 바닥 슬라이드 정착액에 배치 될 수 있고 부착 선충과 전체 슬라이드는 항체 염색 절차를 통해 전송된다. 이 방법은 현재 두 가지 어려움을한다. 첫째, 그들을 심각하게 변형없이 선충을 분리하는 데 필요한 압력의 정확한 금액을 적용하기가 어렵습니다. 둘째, 웜의 많은의하지 않습니다하나의 슬라이드에 진드기 및 정착 또는 헹굼에 손실됩니다. 그러나, 적절한 슬라이드 및 연습, 방법은 급속 고정 제와 항체의 다양한 함께 사용할 수있는 적당한 형태로 선충을 수득한다. 방법은 실험의 목표에 따라 다소 변할 수있다. 단일 선충의 염색이 (예를 들어, 하나의 형질 전환 항체 염색을 변경했는지 여부를 확인하기 위해) 필요한 경우, 최대 접착력과 슬라이드 (그러나 높은 배경 염색) (아래 참조)와 같은 별도의 폴리 라이신 실험실 준비된 슬라이드로 사용할 수 있습니다. 선충이 고착 후 폴리 라이신을 더 가난하게 준수하기 때문에 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 고정 용, 높은 접착 슬라이드 (실험실에서 제조 된 폴리 라이신 슬라이드), 사용되어야한다. 야생형 선충은 메탄올 및 / 또는 아세톤으로 고정되는 경우, 낮은 밀착성 슬라이드 및 하부 배경 염색 표기 (상업적 또는 L) 슬라이드를 aboratory - 준비. 항체 및 고정 제의 다양한 실험실에서 사용중인 경우, 슬라이드의 선택은 미리 제조 될 수 있고, 필요할 때까지 저장된다. 선충 조직에 대한 액세스가 획득 한 후, 항체 염색 절차는 (더 이상 조직의 특성 배양보다는 세포 1,11으로) 표준 방법을 따릅니다.

<table><tbody><tr><td>폴리 -L- 라이신 슬라이드 (ESCO 브랜드)</td> <td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>시그마 브랜드 슬라이드도 적합한</td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신 하이드로 브로마이드</td><td>시그마</td><td>P1524</td><td>IMPORTANT: 폴리리신 임계</td></tr><tr><td>단일 젖빛 가장자리 슬라이드</td>의 브랜드 및 고분자량 <td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>다른 브랜드는</td></tr><tr><td>적합한 아지드 나트륨</td><td>시그마</td><td>입니다.S2002-25G</td><td>TOXIC, 장갑과 마스크를 착용하고 분말의 무게를 달아 10%의 재고를 만드십시오. 원액</td></tr><tr><td>코플린 염색 항아리</td>를 배관할 때 장갑을 착용하십시오 <td>VWR</td><td>47751-792</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>5-슬라이드 메일러</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71549-01</td> 파라포름알데히드 VWR 염색<td>에 적합한 다양한 브랜드의 소형 슬라이드 홀더 중 하나</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MK262159</td><td>IMPORTANT: 일반 포르말린 용액(37% 포름알데히드)은 적합하지 않습니다. 1) 크라이사틀린 파라포름알데히드를 인산염 완충액에 용해시키고 냉동 상태로 작은 부분 표본에 보관합니다. 또는 2) 분취량에서 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드를 구입하십시오. 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.</td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드 용액, 물 시</td><td>그마</td><td>G 5882</td> <td>< 강> 중 25 % 중요 : < / 강> 앰플에서 전자 현미경 등급 글루 타르 알데히드 구매; 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>피셔</td><td>ICN820451</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>당나귀 혈청, 동결 건조</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>Cy3 당나귀 안티 마우스 IgG 다중 라벨링</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>이 회사는 고품질 다중 라벨(affinity depleted) 항체에 권장됩니다. 적절한 염료와 항원(1차 항체를 형성하는 데 사용되는 동물)을 선택합니다. </td></tr><tr><td>n-프로필 갈레이트</td><td>피셔</td><td>ICN10274750</td><td>다른 브랜드로는</td></tr><tr><td>적합한 DAPI, 4',6'-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>D 9542</td> 독성이 있습니다<td>. 장갑을 착용하고 작은 분취량에 분배하고 노출을 최소화하기 위해 피즈</td></tr><tr><td>하십시오. Whatman #1 15cm 직경 필터</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 직사각형 24 x 60mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 두께는 광학적으로 가장 좋습니다</td></tr><tr><td>. 현미경 슬라이드 폴더</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>다른 브랜드가 적합합니다.</td></tr></tbody></table>

항체 염색법에<em&gt; c. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

C. 얼룩하려면 항체 엘레은 상대적으로 스며 들지 표피는 화학 물질 또는 기계적인 방법으로 우회해야합니다. &quot;동결 균열은&quot;물리적으로 두 개의 부착 슬라이드 사이에 선충을 압축을 동결하고, 떨어져 슬라이드를 당겨 선충에서 표피를 당겨하는 데 사용하는 한 가지 방법입니다. 동결 크래킹 화학적 처리없이 조직에 접근 할 수있는 간단하고 신속한 방법을 제공하고, 고정 제의 종류와 사용될 수있다. 그러나, 시편의 많은 손실로 연결하고 필요한 압축 기계적 샘플을 왜곡. 연습은 좋은 형태로 샘플의 회복을 극대화하기 위해 필요합니다. 동결 균열은 특정 고정 조건, 샘플의 복구, 또는 낮은 비특이적 염색에 최적화 된,하지만 모든 매개 변수에 대해 한 번에 할 수있다. 열심히 고정 조건을 필요로하고 화학적으로 표피를 투과하는 데 필요한 화학적 처리, treatmen를 허용 항체솔루션에 그대로 선충의 t는 바람직 할 수있다. 항체는 점화기 수정을 필요로하거나 최적 정착 조건이 알려지지 않은 경우에, 동결 크래킹 급속 항체을 검정하고 그 항원에 대한 특정 세포 내 및 세포 지역화 정보를 얻을 수있는 매우 유용한 방법을 제공하는 경우.

웜이 제대로 압축 금, 가볍게 고정하는 경우, 사실상 전체 웜 (그림 2 참조) 항체 염색법에 액세스 할 수 있습니다. DAPI 염색에 의해 표시된 바와 같이 핵의 위치는 웜의 일부 웜은 포름 알데히드 등 어렵게 정착액을 거치게 될 때의 부자연 물결 모양으로 된 것과 같이, 웜의 형태학 (그러질 그대로 나타냅니다 도 3A-D에있는 근육). 또 다른 일반적인 문제는 고르지 고정 또는 특정 조직의 침투이다. 이것의 예는 근육이 DNA 염색을 포함한 다른 염색의 존재는, (본체의 적어도 일부가 존재하는 것을 의미한다는 사실에도 불구하고, 오직 웜의 일부에 더러워도 3E-H에 도시된다 즉,) 동결 균열 중에 제거되지. 부분 얼룩의 발생 패턴은 쉽게 연습을 식별 할 수 있도록 전체 분배 블록염색에 단일 웜이 고르지 못한 염색을 표시도 확인할 수 있습니다. 동결 균열 어떤 고정 상...

&quot;동결 균열&quot;선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 C. elegans에 대해 항체 염색을 수행하는 것입니다. 이를 위해 선충을 세척하고 슬라이드 위에 펼친 후, 두 개의 접착 슬라이드 사이에서 조심스럽게 압착하고 이를 드라이아이스 위에서 급속 냉동시킵니다. 그 다음, 슬라이드를 분리하여 선충의 외피를 터뜨린 후 즉시 고정액에 넣습니다.그 후 표준 항체 염색 기법을 사용하여 선충을 염색하며, 형광 현미경 분석을 통해 반쯤 손상되지 않은 선충의 항체 염색이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있습니다. 온전한 선충을 고정하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기법의 주요 장점은 시료의 화학적 처리를 최소화한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 슬라이드와 선충을 준비하는 과정이 다소 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.실험 절차는 본인과 본인 연구실의 대학원생인 RTO Basu가 진행합니다. 염색을 위한 선충 플레이트를 준비하려면, 먼저 평평한 금속판을 드라이아이스 위에 올려 냉각시킵니다. 증류수와 유리 피펫을 사용하여 헹굽니다. 박테리아와 함께 60mm NGM 플레이트 한 개에서 배양한 선충을 1.5mL 마이크로 튜브에 옮깁니다. 선충은 동기화되었거나 다양한 연령대가 섞여 있어도 무관하지만, 깨뜨리기 어려운 다우어(dauers)가 많거나 자가형광이 증가하는 굶주린 선충이 포함된 플레이트는 사용하지 마십시오. 동일한 유리 피펫을 사용합니다.박테리아를 제거하기 위해 증류수로 벌레를 3~4회 헹굽니다. 그런 다음 주로 성체를 수집하기 위해 벤치 위에 3~5분 동안 그대로 둡니다. 벌레가 튜브 바닥에 가라앉으면, 튜브에서 물의 대부분을 제거하여 물의 부피가 벌레 부피의 약 2배 정도가 되게 하되, 전체 부피는 최소 25 microliters가 되도록 합니다.폴리리신 슬라이드의 불투명한 면에 지워지지 않는 잉크로 라벨을 부착하고, 라벨 면이 위로 향하게 하여 드라이아이스 용기 옆 벤치탑 위에 놓습니다. 이것이 바닥 슬라이드가 됩니다. 깨끗한 비처리 슬라이드도 동일한 수량으로 준비합니다.상단 슬라이드를 준비합니다. 다음으로 팁을 사용하여 약 25 µL의 벌레 현탁액을 바닥 접착 슬라이드 위에 분주하고, 피펫 팁의 측면을 이용해 벌레를 슬라이드 중앙에 넓게 펴줍니다. 벌레가 가라앉을 때까지 30초에서 2분 정도 기다립니다.슬라이드에 닿으면 벌레의 끝부분이 달라붙게 됩니다. 이 과정에서 가장 어려운 점은 다음 몇 단계를 수행하는

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

이 동영상은 큐티클을 파괴하여 예쁜꼬마선충 조직이 항체 염색에 접근할 수 있도록 하는 방법인 동결 균열에 대해 설명합니다.

선충의 동결 균열: 염색을 위해 내부 벌레 조직을 노출시키는 방법

우리는 반복적인 염기서열을 관찰하고 정량화하기 위해 예쁜꼬마선충의 생식선과 배아에서 형광 현장 교잡화(FISH)의 간결한 절차를 보고합니다. 우리는 두 가지 다른 반복 서열, 즉 텔로미어 반복과 텔로미어의 대체 연장(TALT) 템플릿을 성공적으로 관찰하고 정량화했습니다.

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

우리는 해부 C.에서 활동 ERK의 공간과 시간 현지화에 대한 면역 형광 이미징 기반의 방법을 제시한다 간스의 생식선. 여기에 설명 된 프로토콜 C. 어떤 시그널링 시각화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 적절한 항체 시약을 사용할 제공했다.

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이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

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배우세요 C. elegans 항체 염색을 위한 동결 크래킹 기법을 활용한 단백질 국소화 연구 방법입니다. 이 기술은 화학적 처리를 최소화하여 효과적인 항체 염색을 가능하게 합니다.

항체 염색법에

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