Name: 항체 염색법에 C. 엘레 동결 크래킹 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 C. elegans 항체 염색을 위한 동결 크래킹 기법을 활용한 단백질 국소화 연구 방법입니다. 이 기술은 화학적 처리를 최소화하여 효과적인 항체 염색을 가능하게 합니다.

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자금은 NSF CCLI 번호 0,633,618 및 오하이오 대학에 의해 제공되었다. 일부 변종은 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 대학원생 Reetobrata 바수는 비디오에 나타납니다.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
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<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
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<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

저자는 그녀가 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

동결 균열 프로토콜 C. 항체 염색을위한 여러 가지 방법 중 하나입니다 엘레. 그것은 벌레를 염색 할 수있는 비교적 간단한 방법을 제공하지만, 특정 시약을 필요로하고 최적의 결과를 위해 연습 않습니다. (그림 1에 나와있는) 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 슬라이드 준비 () 3 단계 참조 (2 단계와 3 단계) 빠른 고정을 참조하십시오 (1 단계와 선충의 2) 수동 압축을 참조하십시오. 첫째, 슬라이드에 선충의 밀착성을 최대화하기 위해, 대신 상업적으로 제조 된 슬라이드에 의존하는 고 분자량 (긴 중합체) 폴리 리신으로 슬라이드를 준비하는 것이 최상이다. 동결 균열 슬라이드는 전체 선충의 표피에 충실하도록 설계하는 동안 상용 슬라이드는 세포가 준수 할 수 있도록 폴리 라이신으로 코팅되어 있습니다. 둘째, 냉동 전에 슬라이드 사이에 벌레의 정확한 압축하는 절차는 매우 중요하다. 그것은 정확한 양을 사용하여 함께 슬라이드를 눌러 꾸준한 손과 연습이 필요개인 벌...

단백질의 세포 및 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 과학자들은 전통적으로 구체적으로 특정 단백질 1을 인식하는 선택 항체와 조직을 표시했다. C와 같은 일부 모델 생물에서 엘레, 항체 염색은 종종 더 빠르게 결과를 얻을 분자 유전 학적 기술에 의해 대체되었습니다. 이들은 발기인 및 관심과 녹색 형광 단백질의 유전자의 코딩 영역 사이의 유전자의 융합으로 이루어진 구조로 변형 생물체 (가) 있습니다. 그러나, 분자 기술은 진정한 프로와 높은 사본 번호 (C. elegans의에서 통상의 기술) 2,3에서 구조의 발현의 변화를 알 수있는 문제를 포함하여 유물의 숫자로 될 수 있습니다. 따라서 항체 염색은 생체 내에서 단백질 기능을 연구 많은 과학자의 골이 남아있다. 항체와 조직을 염색하는 것은 어려울 수 있기 때문에tibodies는 특정 형태 1에서 자신의 항원을 인식 할 수 있습니다. 예를 들어, 항체는 특정 방식으로 고정 만 변성 또는 손상 항원을 인식 할 수 있으며, 현장에서 항원을 인식하지 못할 수 있습니다. 선충의 항체 염색의 문제는 선충의 표피 조직에 대한 항체의 액세스를 차단, 상대적으로 불 침투성 장벽을 형성한다는 사실에 의해 악화된다. C. 항체 염색에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다 엘레 (우리의 이전 작업에서 검토 4). 그대로 얼룩이 &#39;웜&#39;방법은 동결 상대적으로 하드 정착 (포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드)에 해동하기 위해 개발되었습니다, 동결 해동 사이클은 정착 5의 빠른 침투를 허용하는 표피를 해독하는 데 도움이됩니다. 방법은 제, 콜라게나 제, 또는 둘 모두를 감소 5-7 치료를 포함; 고정 후, 표피는 항체의 침투를 허용하기 permeabilized 하였다. 이 treatments는 형태를 유지하지만, 종종 항체 인식을 감소 시키거나 파괴. 다른 방법은 항체의 침투를 허용하는 해부 8 있습니다. &quot;동결 균열은&quot;항체가 9-10 염색 할 수 있도록 반 그대로 웜의 내부에 액세스 할 수있는 한 가지 방법입니다. 콜라게나 제 및 환원 처리를 회피하면서 동결 크래킹 정착 다양한 조건으로 행할 수있다. 선충은 두 접착제 슬라이드 사이에 냉동 한 다음 슬라이드가 분리되어, 하단 슬라이드에 선충의 대부분 상단 슬라이드에 표피의 대부분을 떠나고있다. 바닥 슬라이드 정착액에 배치 될 수 있고 부착 선충과 전체 슬라이드는 항체 염색 절차를 통해 전송된다. 이 방법은 현재 두 가지 어려움을한다. 첫째, 그들을 심각하게 변형없이 선충을 분리하는 데 필요한 압력의 정확한 금액을 적용하기가 어렵습니다. 둘째, 웜의 많은의하지 않습니다하나의 슬라이드에 진드기 및 정착 또는 헹굼에 손실됩니다. 그러나, 적절한 슬라이드 및 연습, 방법은 급속 고정 제와 항체의 다양한 함께 사용할 수있는 적당한 형태로 선충을 수득한다. 방법은 실험의 목표에 따라 다소 변할 수있다. 단일 선충의 염색이 (예를 들어, 하나의 형질 전환 항체 염색을 변경했는지 여부를 확인하기 위해) 필요한 경우, 최대 접착력과 슬라이드 (그러나 높은 배경 염색) (아래 참조)와 같은 별도의 폴리 라이신 실험실 준비된 슬라이드로 사용할 수 있습니다. 선충이 고착 후 폴리 라이신을 더 가난하게 준수하기 때문에 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 고정 용, 높은 접착 슬라이드 (실험실에서 제조 된 폴리 라이신 슬라이드), 사용되어야한다. 야생형 선충은 메탄올 및 / 또는 아세톤으로 고정되는 경우, 낮은 밀착성 슬라이드 및 하부 배경 염색 표기 (상업적 또는 L) 슬라이드를 aboratory - 준비. 항체 및 고정 제의 다양한 실험실에서 사용중인 경우, 슬라이드의 선택은 미리 제조 될 수 있고, 필요할 때까지 저장된다. 선충 조직에 대한 액세스가 획득 한 후, 항체 염색 절차는 (더 이상 조직의 특성 배양보다는 세포 1,11으로) 표준 방법을 따릅니다.

<table><tbody><tr><td>폴리 -L- 라이신 슬라이드 (ESCO 브랜드)</td> <td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>시그마 브랜드 슬라이드도 적합한</td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신 하이드로 브로마이드</td><td>시그마</td><td>P1524</td><td>IMPORTANT: 폴리리신 임계</td></tr><tr><td>단일 젖빛 가장자리 슬라이드</td>의 브랜드 및 고분자량 <td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>다른 브랜드는</td></tr><tr><td>적합한 아지드 나트륨</td><td>시그마</td><td>입니다.S2002-25G</td><td>TOXIC, 장갑과 마스크를 착용하고 분말의 무게를 달아 10%의 재고를 만드십시오. 원액</td></tr><tr><td>코플린 염색 항아리</td>를 배관할 때 장갑을 착용하십시오 <td>VWR</td><td>47751-792</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>5-슬라이드 메일러</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71549-01</td> 파라포름알데히드 VWR 염색<td>에 적합한 다양한 브랜드의 소형 슬라이드 홀더 중 하나</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MK262159</td><td>IMPORTANT: 일반 포르말린 용액(37% 포름알데히드)은 적합하지 않습니다. 1) 크라이사틀린 파라포름알데히드를 인산염 완충액에 용해시키고 냉동 상태로 작은 부분 표본에 보관합니다. 또는 2) 분취량에서 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드를 구입하십시오. 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.</td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드 용액, 물 시</td><td>그마</td><td>G 5882</td> <td>< 강> 중 25 % 중요 : < / 강> 앰플에서 전자 현미경 등급 글루 타르 알데히드 구매; 독성 - 장갑을 착용하십시오. 여분의 다운 싱크는 물과 함께 버리십시오.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>피셔</td><td>ICN820451</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>당나귀 혈청, 동결 건조</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>다른 브랜드가 적합합니다</td></tr><tr><td>Cy3 당나귀 안티 마우스 IgG 다중 라벨링</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>이 회사는 고품질 다중 라벨(affinity depleted) 항체에 권장됩니다. 적절한 염료와 항원(1차 항체를 형성하는 데 사용되는 동물)을 선택합니다. </td></tr><tr><td>n-프로필 갈레이트</td><td>피셔</td><td>ICN10274750</td><td>다른 브랜드로는</td></tr><tr><td>적합한 DAPI, 4',6'-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>D 9542</td> 독성이 있습니다<td>. 장갑을 착용하고 작은 분취량에 분배하고 노출을 최소화하기 위해 피즈</td></tr><tr><td>하십시오. Whatman #1 15cm 직경 필터</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 직사각형 24 x 60mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 두께는 광학적으로 가장 좋습니다</td></tr><tr><td>. 현미경 슬라이드 폴더</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>다른 브랜드가 적합합니다.</td></tr></tbody></table>

항체 염색법에<em&gt; c. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

C. 얼룩하려면 항체 엘레은 상대적으로 스며 들지 표피는 화학 물질 또는 기계적인 방법으로 우회해야합니다. &quot;동결 균열은&quot;물리적으로 두 개의 부착 슬라이드 사이에 선충을 압축을 동결하고, 떨어져 슬라이드를 당겨 선충에서 표피를 당겨하는 데 사용하는 한 가지 방법입니다. 동결 크래킹 화학적 처리없이 조직에 접근 할 수있는 간단하고 신속한 방법을 제공하고, 고정 제의 종류와 사용될 수있다. 그러나, 시편의 많은 손실로 연결하고 필요한 압축 기계적 샘플을 왜곡. 연습은 좋은 형태로 샘플의 회복을 극대화하기 위해 필요합니다. 동결 균열은 특정 고정 조건, 샘플의 복구, 또는 낮은 비특이적 염색에 최적화 된,하지만 모든 매개 변수에 대해 한 번에 할 수있다. 열심히 고정 조건을 필요로하고 화학적으로 표피를 투과하는 데 필요한 화학적 처리, treatmen를 허용 항체솔루션에 그대로 선충의 t는 바람직 할 수있다. 항체는 점화기 수정을 필요로하거나 최적 정착 조건이 알려지지 않은 경우에, 동결 크래킹 급속 항체을 검정하고 그 항원에 대한 특정 세포 내 및 세포 지역화 정보를 얻을 수있는 매우 유용한 방법을 제공하는 경우.

웜이 제대로 압축 금, 가볍게 고정하는 경우, 사실상 전체 웜 (그림 2 참조) 항체 염색법에 액세스 할 수 있습니다. DAPI 염색에 의해 표시된 바와 같이 핵의 위치는 웜의 일부 웜은 포름 알데히드 등 어렵게 정착액을 거치게 될 때의 부자연 물결 모양으로 된 것과 같이, 웜의 형태학 (그러질 그대로 나타냅니다 도 3A-D에있는 근육). 또 다른 일반적인 문제는 고르지 고정 또는 특정 조직의 침투이다. 이것의 예는 근육이 DNA 염색을 포함한 다른 염색의 존재는, (본체의 적어도 일부가 존재하는 것을 의미한다는 사실에도 불구하고, 오직 웜의 일부에 더러워도 3E-H에 도시된다 즉,) 동결 균열 중에 제거되지. 부분 얼룩의 발생 패턴은 쉽게 연습을 식별 할 수 있도록 전체 분배 블록염색에 단일 웜이 고르지 못한 염색을 표시도 확인할 수 있습니다. 동결 균열 어떤 고정 상...

&quot;동결 균열&quot;선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 C. elegans에 대해 항체 염색을 수행하는 것입니다. 이를 위해 선충을 세척하고 슬라이드 위에 펼친 후, 두 개의 접착 슬라이드 사이에서 조심스럽게 압착하고 이를 드라이아이스 위에서 급속 냉동시킵니다. 그 다음, 슬라이드를 분리하여 선충의 외피를 터뜨린 후 즉시 고정액에 넣습니다.그 후 표준 항체 염색 기법을 사용하여 선충을 염색하며, 형광 현미경 분석을 통해 반쯤 손상되지 않은 선충의 항체 염색이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있습니다. 온전한 선충을 고정하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기법의 주요 장점은 시료의 화학적 처리를 최소화한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 슬라이드와 선충을 준비하는 과정이 다소 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.실험 절차는 본인과 본인 연구실의 대학원생인 RTO Basu가 진행합니다. 염색을 위한 선충 플레이트를 준비하려면, 먼저 평평한 금속판을 드라이아이스 위에 올려 냉각시킵니다. 증류수와 유리 피펫을 사용하여 헹굽니다. 박테리아와 함께 60mm NGM 플레이트 한 개에서 배양한 선충을 1.5mL 마이크로 튜브에 옮깁니다. 선충은 동기화되었거나 다양한 연령대가 섞여 있어도 무관하지만, 깨뜨리기 어려운 다우어(dauers)가 많거나 자가형광이 증가하는 굶주린 선충이 포함된 플레이트는 사용하지 마십시오. 동일한 유리 피펫을 사용합니다.박테리아를 제거하기 위해 증류수로 벌레를 3~4회 헹굽니다. 그런 다음 주로 성체를 수집하기 위해 벤치 위에 3~5분 동안 그대로 둡니다. 벌레가 튜브 바닥에 가라앉으면, 튜브에서 물의 대부분을 제거하여 물의 부피가 벌레 부피의 약 2배 정도가 되게 하되, 전체 부피는 최소 25 microliters가 되도록 합니다.폴리리신 슬라이드의 불투명한 면에 지워지지 않는 잉크로 라벨을 부착하고, 라벨 면이 위로 향하게 하여 드라이아이스 용기 옆 벤치탑 위에 놓습니다. 이것이 바닥 슬라이드가 됩니다. 깨끗한 비처리 슬라이드도 동일한 수량으로 준비합니다.상단 슬라이드를 준비합니다. 다음으로 팁을 사용하여 약 25 µL의 벌레 현탁액을 바닥 접착 슬라이드 위에 분주하고, 피펫 팁의 측면을 이용해 벌레를 슬라이드 중앙에 넓게 펴줍니다. 벌레가 가라앉을 때까지 30초에서 2분 정도 기다립니다.슬라이드에 닿으면 벌레의 끝부분이 달라붙게 됩니다. 이 과정에서 가장 어려운 점은 다음 몇 단계를 수행하는 동안 벌레의 형태가 너무 많이 변형되지 않도록 유지하는 것입니다. 이를 위한 가장 좋은 방법은 인내심을 갖고 모든 준비물을 미리 챙겨두는 것이며, 손이 충분히 안정적일 수 있도록 카페인을 너무 많이 섭취하지 않는 것입니다.한 손으로 아래쪽 슬라이드를 잡고, 그 위에 위쪽 슬라이드를 얹어 서리 낀 부분(frosted parts)을 제외한 모든 부분이 겹치게 합니다. 이때 액체로 인해 슬라이드 사이에 약간의 간격이 유지되어 벌레들이 어느 정도 움직일 수 있어야 합니다. 슬라이드가 서로 밀려나가지 않도록 주의하십시오. 슬라이드가 밀리면 벌레들의 몸이 뒤틀릴 수 있습니다.다음으로, 양손의 엄지와 검지를 사용하여 상단 슬라이드를 조심스럽게 수직으로 누릅니다. 적절한 압력을 가하면 가장 큰 자웅동체 몇 마리가 슬라이드 가장자리에서 파열될 것입니다. 대부분의 성체와 유충은 각 슬라이드에 접촉하지만 파손되지 않은 상태로 유지됩니다. 슬라이드가 미끄러지지 않도록 즉시 주의하며 드라이아이스 위의 금속판에 올려둡니다. 1분 이내에 슬라이드가 얼어붙은 것처럼 보이겠지만, 완전히 동결될 수 있도록 5분 동안 그대로 둡니다.이제 슬라이드를 고정할 준비가 되었습니다. 즉시 진행하지 않을 경우, 라벨이 부착된 박스에 넣어 -80 °C에서 며칠 동안 보관하십시오. 슬라이드는 제작 후 일주일 이내에 사용하는 것이 좋습니다.장기간 보관한 슬라이드는 사용하지 마십시오. 개별 선충 또한 앞서 보여드린 것과 유사한 방법으로 슬라이드에 준비할 수 있습니다. 평평한 금속 조각을 드라이아이스 위에 올려 냉각시킵니다.다음으로, 웜 픽(worm pick)을 사용하여 개별 nematode를 NGM 플레이트 위의 물 한 방울로 옮겨 박테리아로부터 분리합니다. 자가형광을 줄이기 위해 nematode가 충분히 먹이를 섭취한 상태여야 합니다. 가능하면, nematode에서 박테리아가 완전히 제거될 때까지 필요에 따라 새로운 물방울로 옮기는 과정을 반복하십시오.다음으로, 이전과 동일하게 상단 및 하단 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 현미경으로 관찰하면서 하단 슬라이드의 polylysine 처리 영역에 5~10 µL의 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 웜 픽(worm pick)을 사용하여 최대 20마리의 웜을 물방울로 옮깁니다.벌레들이 가라앉아 점착성 슬라이드 표면에 닿아야 합니다. 그런 다음 이전과 같이 상단 슬라이드를 덮되, 슬라이드가 즉시 미끄러지지 않도록 주의하면서 압착하지는 마십시오. 슬라이드를 드라이아이스 위의 금속판에 놓으십시오.드라이아이스에 5분에서 30분 동안 보관한 후 즉시 고정 단계를 진행하십시오. 이 슬라이드들은 나중에 사용하기 위해 보관할 수 없습니다. 벌레를 가볍게 고정하려면, 고정액이 들어 있는 염색병을 얼음에 배치하여 10분 동안 냉각시키는 것으로 시작하십시오.필요한 용액은 100% methanol, 100% acetone 및 phosphate buffered saline입니다. 드라이아이스에서 하단 및 상단 슬라이드 한 쌍을 빠르게 꺼내어 서로 비틀어 분리한 후, 즉시 하단 슬라이드를 얼음처럼 차가운 methanol에 2분 동안 담그고 상단 슬라이드는 폐기합니다. 그다음, 슬라이드를 methanol에서 얼음처럼 차가운 acetone로 옮겨 4분 동안 담급니다.슬라이드에 벌레가 많았던 경우, 슬라이드를 잘 준비했더라도 대부분의 벌레가 고정액에서 떨어져 나갈 것입니다. 단일 벌레 슬라이드가 적절하게 준비되었다면 벌레는 계속 부착되어 있어야 합니다. 마지막으로, 고정액을 씻어내기 위해 PBS가 담긴 용기에 슬라이드를 담급니다.이제 슬라이드는 formaldehyde 또는 glutaraldehyde를 이용한 하드 고정을 위한 염색 준비가 완료되었습니다. 먼저 시약 등급의 formaldehyde 또는 glutaraldehyde 용액을 PBS로 희석하여 최종 농도가 0.5~4%가 되도록 합니다. 분주한 용액은 -20~-30°C에서 보관하며 필요 시 해동하여 사용하십시오. formaldehyde와 glutaraldehyde는 독성이 매우 강하므로, 항상 장갑을 착용하고 흄 후드 내에서 작업해야 함을 유의하십시오.드라이아이스에서 하단 및 상단 슬라이드 한 쌍을 꺼내 즉시 빠르게 비틀어 분리하십시오. 벌레가 들어 있는 하단 슬라이드를 뚜껑이 있는 평평한 접시에 놓고, 상단 슬라이드는 즉시 폐기하십시오. 슬라이드 중앙 부위에 고정액 200 µL를 피펫으로 분주하십시오. 벌레가 있는 부위에서 고정액은 부분적으로 얼어붙었다가, 이후 녹으면서 슬라이드의 더 넓은 영역을 덮게 됩니다.벌레가 즉시 그리고 조심스럽게 고정액으로 완전히 덮이지 않은 경우, 마이크로 피펫을 사용하여 고정액을 더 추가하십시오. 고정액이 슬라이드 가장자리 너머로 흘러넘치지 않도록 하십시오. 습도를 유지하기 위해 접은 젖은 보풀 없는 와이프를 디시에 넣으십시오.와이프가 슬라이드에 닿지 않도록 주의하십시오. 그 다음 디쉬에 뚜껑을 덮고 실온에서 10분에서 하룻밤 동안 방치하십시오. 고정이 완료되면 파이펫을 사용하여 벌레가 포함된 고정액을 1.5 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 그 후 슬라이드를 PBS가 담긴 염색병에 담그십시오.벌레가 들어 있는 튜브를 고속으로 30초 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 벌레를 PBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드 위의 벌레와 병행하여 염색을 진행합니다.항체 염색 프로토콜은 슬라이드에 고정된 모든 조직에 적용되는 표준 프로토콜과 유사하며, 첨부 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 염색 후, 슬라이드를 PBS로 옮겨 마운팅 준비가 될 때까지 4°C에서 최대 12시간 동안 보관하십시오. 슬라이드를 마운팅하려면 PBS에서 슬라이드를 꺼냅니다.보풀 없는 와이프로 뒷면을 닦아 말린 후, 거름종이 위에 빠르게 잠시 올려둡니다. 슬라이드 글라스 위의 벌레 위로 마운팅 매질 약 20 µL를 떨어뜨려 매질과 PBS의 비율이 거의 동일하게 맞춥니다.슬라이드를 천천히 기울여 두 용액을 혼합합니다. 마운팅 용액은 독성이 있으므로 주의하십시오. 프로스티드 엣지 부분을 잡고 진행합니다.슬라이드를 기울여 용액이 프로스팅(frosting) 근처에 모이게 합니다. 그 다음, 24 by 60 밀리미터 커버 슬립의 한쪽 끝을 용액 위에 올려놓아, 표백을 증가시키고 관찰을 방해하는 기포를 최소화합니다. 커버 슬립을 천천히 내립니다.기포가 형성된 경우, 커버 슬립의 가장자리를 천천히 들어 올립니다. 그 다음 벌레 위에서 슬립이 미끄러지지 않도록 주의하며 다시 내립니다. 기포를 제거하기 위해 필요한 경우 PBS를 더 추가합니다.보풀 없는 와이프로 커버 슬립과 슬라이드의 가장자리를 가볍게 눌러 가장자리의 물기를 조심스럽게 닦아냅니다. 커버 슬립의 가장자리 바깥쪽으로 슬라이드의 테두리가 모두 보여야 하며, 너무 젖어 있어서는 안 됩니다. 커버 슬립을 밀봉하고 가장자리에 매니큐어를 2~3겹 바릅니다.슬라이드가 잘 밀봉되어 건조되면, 커버 슬립과 슬라이드 뒷면을 세척하고 슬라이드 홀더 웰에 넣습니다. 밀봉된 슬라이드는 4 °C에서 며칠 동안, 또는 더 긴 기간 동안 -20 °C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. DNA의 DAPI 염색과 대부분의 녹색 형광 염료는 시간이 지나면 퇴색되므로, 필요한 경우, 특히 유침 렌즈를 사용한 후에는 매니큐어를 더 사용하여 커버 슬립을 다시 밀봉하십시오.다음의 대표 이미지들은 세포생물학 실험 과정 중 학부생들이 수행한 1차 항체 염색 시도 중에 제작된 슬라이드를 사용하여 수집되었습니다. 이 이미지는 적절하게 압착되고, 균열이 생겼으며, 메탄올 아세톤으로 가볍게 고정된 성체 자웅동체 두 마리의 머리 부분을 보여주는 예시입니다. 이들은 여러 종류의 항체와 염료로 라벨링되었습니다.이 경우, 벌레의 거의 전체 영역에 항체가 접근할 수 있습니다. 여기서 DPI 염색으로 나타낸 핵의 위치는 벌레의 어느 부분이 온전한지를 보여줍니다. 벌레를 포름알데히드와 같은 더 강력한 고정제로 처리하면 벌레의 형태가 왜곡될 수 있습니다.이는 빨간색으로 표시된 근육이 물결 모양으로 나타나는 이미지에서 확인할 수 있습니다. 더 강한 고정액을 사용할 때 발생하는 또 다른 일반적인 문제는 특정 조직의 고정이 불균일하거나 침투가 제대로 이루어지지 않는 것입니다. 이는 빨간색으로 표시된 근육이 벌레의 일부 영역에만 염색된 여기 이미지에서 확인할 수 있습니다.여기에서 파란색으로 표시된 DNA를 포함한 다른 염색의 존재는 신체의 최소 일부가 존재했음을 나타냅니다. 결과적으로 나타나는 부분 염색 패턴은 연습을 통해 쉽게 식별할 수 있으므로, 개별 벌레가 불균일하게 염색되었더라도 전체 염색 분포를 결정할 수 있습니다. 모든 고정 조건에서 동결 균열(freeze cracking) 시 발생하는 일반적인 문제들이 여기에 예시되어 있습니다.가장 흔하게 발생하는 문제는 두 슬라이드의 상대적인 움직임으로 인해 시료가 뒤틀리는 것입니다. 압착 과정 중, 여기에서 염색된 조직의 형태를 보면 벌레의 몸통이 인두 바로 뒤쪽에서 뒤틀려 있음을 알 수 있습니다. 또한 이 이미지는 항체가 슬라이드의 폴리리신 코팅에 부착되어 발생하는 배경 염색 문제를 보여줍니다.공초점 현미경을 사용하면 이를 방지할 수 있습니다. 숙련된 후에도 많은 개별 벌레들이 손실되거나 여기서 보여준 몇 가지 문제들이 나타날 수 있음에 유의하십시오. 숙달되면 전처리와 고정은 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 염색은 하루 만에 완료할 수 있습니다.본 절차에 따라, 주어진 항체 및 조직에 대한 염색을 최적화하기 위해 다양한 고정 방법을 수행할 수 있습니다.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

연구

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