항체 염색법에 C. 엘레 "동결 크래킹 사용"

이 절차의 전반적인 목표는 C 엘레강스에 항체 염색을 수행하는 것입니다. 이를 위해 선충을 헹구어 슬라이드에 펴고 두 개의 접착 슬라이드 사이에서 조심스럽게 압축한 다음 드라이 아이스에서 얼립니다. 다음으로, 슬라이드를 분리하여 선충을 균열하고 즉시 고정제에 넣습니다.

그런 다음 표준 항체 염색 기법을 사용하여 형광 현미경 검사법을 사용하여 선충을 염색하면 반온전한 선충의 성공적인 항체 염색이 밝혀집니다. 온전한 선충의 고정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 샘플의 화학적 처리를 최소화한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 슬라이드와 선충을 준비하는 것이 시연하기가 다소 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

절차는 저와 제 연구실의 대학원생인 RTO Basu가 담당할 것입니다: 염색을 위해 선충 플레이트를 준비하려면 먼저 드라이아이스에 평평한 금속 조각을 올려 증류수와 유리 피펫 헹굼을 사용하여 냉각시키는 것으로 시작합니다. 하나의 60mm NGM 플레이트에서 박테리아와 함께 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브로 자란 벌레. 웜은 동기화되거나 혼합 된 연령 일 수 있지만, 균열이 어려운 다우어가 많거나 웜이 굶주린 플레이트를 사용하면 동일한 유리 피펫을 사용하여자가 형광이 증가합니다.

지렁이를 증류수로 3-4회 헹구어 박테리아를 제거합니다. 그런 다음 대부분 성인을 모으기 위해 3-5분 동안 벤치에 앉혀 두십시오. 벌레가 튜브 바닥에 가라앉은 후 튜브에서 대부분의 물을 제거하고 벌레 부피의 약 두 배의 물을 남기지만 총 부피는 최소 25마이크로리터입니다.

폴리리신 슬라이드의 젖빛 면에 지울 수 없는 잉크로 라벨을 붙이고 드라이아이스 라벨 면이 위로 향하게 하여 용기 옆의 벤치탑에 슬라이드를 놓습니다. 이것은 하단 슬라이드 역할을 합니다. 동일한 수의 깨끗한 비 폴리리신 처리하십시오.

상단 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 다음으로 물에 담긴 약 25마이크로리터의 웜을 바닥 접착 슬라이드에 피펫하고 피펫 팁 측면을 사용하여 웜을 슬라이드 중앙에 펴 놓습니다. 30초에서 2분 동안 그대로 두십시오.

웜의 끝은 슬라이드에 닿을 때 달라붙습니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 다음 몇 단계를 수행할 때 웜이 너무 왜곡되지 않도록 하는 것입니다. 이를 수행하는 가장 좋은 방법은 인내심을 갖고, 모든 것을 준비하고, 카페인을 너무 많이 마시지 않도록 하여 손이 편안하고 안정된 상태를 유지하는 것입니다.

하단 슬라이드를 한 손으로 잡고 상단 슬라이드를 그 위에 올려 젖빛 부분을 제외한 모든 부분이 겹치도록 합니다. 액체는 지렁이가 여전히 약간의 이동성을 가질 수 있도록 슬라이드를 약간 떨어뜨려야 합니다. 슬라이드가 서로 미끄러져 벌레가 뒤틀리지 않도록 하십시오.

다음으로, 각 손의 엄지와 검지를 사용하여 상단 슬라이드를 조심스럽게 똑바로 누릅니다.적절한 압력으로 가장 큰 자웅동체 중 몇 개가 슬라이드 가장자리에서 파열됩니다. 대부분의 성충과 유충은 각 슬라이드에 접촉하지만 슬라이드가 미끄러지지 않도록 즉각적이고 조심스럽게 손상되지 않은 상태로 유지되지만 드라이 아이스의 금속 조각에 올려 놓습니다. 1분 이내에 슬라이드가 멈춘 것처럼 보이지만 완전히 얼었는지 확인하기 위해 5분 동안 그대로 두십시오.

이제 슬라이드를 고정할 준비가 되었습니다. 진행하지 않으면 즉시 라벨이 붙은 상자에 슬라이드를 넣어 섭씨 영하 80도의 온도에 며칠 동안 보관하십시오. 만든 후 일주일 이내에 사용해야 합니다.

장기간 보관 후 슬라이드를 사용하지 마십시오. 개별 선충은 이전에 표시된 것과 유사한 방법으로 슬라이드에 준비할 수도 있습니다. 드라이아이스 위에 평평한 금속 조각을 올려 식힙니다.

다음으로, 지렁이 송곳(worm pick)을 사용하여 개별 선충을 NGM 플레이트의 물 한 방울로 옮겨 박테리아로부터 제거합니다. 선충은 자가형광을 줄이기 위해 잘 먹여야 합니다. 가능하면 벌레에 박테리아가 없어질 때까지 필요에 따라 새로운 물 지점으로 옮기는 것을 반복하십시오.

다음으로, 이전과 같이 상단 및 하단 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 현미경으로 관찰하면서 하단 슬라이드의 폴리리신 처리 부위에 5-10마이크로리터의 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 웜 픽을 사용하여 최대 20개의 웜을 물방울로 옮깁니다.

벌레는 끈적한 슬라이드 표면에 닿기 위해 아래로 가라앉아야 합니다. 그런 다음 이전과 같이 상단 슬라이드를 배치하되 슬라이드가 즉시 미끄러지지 않도록 하면서 압축하지 마십시오. 드라이 아이스에 금속에 슬라이드를 놓습니다.

드라이아이스에 5분에서 30분 동안 보관하고 즉시 고정을 진행하십시오. 이러한 슬라이드는 나중에 사용하기 위해 저장할 수 없습니다. 벌레를 가볍게 고치려면 먼저 고정 용액이 들어있는 염색 항아리를 얼음 위에 올려 놓고 10 분 동안 식히십시오.

필요한 용액은 100% 메탄올, 100% 아세톤 및 인산염 완충 식염수입니다. 드라이 아이스에서 한 쌍의 하단 및 상단 슬라이드를 가져 와서 빠르게 비틀어 분리 한 다음 즉시 하단 슬라이드를 얼음처럼 차가운 메탄올에 2 분 동안 담그고 상단 슬라이드를 버립니다. 다음으로, 슬라이드를 메탄올에서 얼음처럼 차가운 아세톤으로 4분 동안 옮깁니다.

슬라이드에 웜이 많으면 잘 준비된 슬라이드가 있어도 대부분이 고정제에서 떨어집니다. 단일 웜 슬라이드가 적절하게 준비된 경우 웜은 부착 상태를 유지해야 합니다. 마지막으로, 정착제를 헹구려면 PBS를 사용하여 슬라이드를 항아리에 담그십시오.

이제 슬라이드는 포름알데히드 또는 글루타르알데히드를 사용하여 하드 수정을 수행하기 위해 염색할 준비가 되었습니다. 먼저 PBS에서 시약 등급의 포름알데히드 또는 글루타르알데히드 용액을 0.5-4%의 최종 농도로 희석하여 부분 표본을 영하 20도에서 영하 30도에서 저장하고 필요에 따라 해동할 수 있습니다. 포름알데히드와 글루타르알데히드는 항상 독성이 매우 강하므로 장갑을 끼고 흄 후드에서 작업해야 합니다.

드라이 아이스에서 한 쌍의 하단 및 상단 슬라이드를 가져 와서 즉시 신속하게 비틀어 분리하십시오. 벌레가 있는 하단 슬라이드를 뚜껑이 있는 평평한 접시에 놓고 상단 슬라이드를 슬라이드 영역 중앙에 고정제 200마이크로리터 피펫으로 즉시 버립니다. 웜을 사용하면 고정제가 그 자리에서 부분적으로 얼어붙은 다음 녹아서 슬라이드의 더 넓은 영역을 덮습니다.

벌레가 고정제로 완전히 덮이지 않은 경우 즉시 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 고정제를 더 추가하십시오. 고정제가 슬라이드 가장자리 위로 흐르지 않도록 하십시오. 접힌 젖은 보푸라기가 없는 물티슈를 접시에 추가하여 가습 상태를 유지하십시오.

물티슈가 슬라이드에 닿지 않도록 하십시오. 그런 다음 접시를 뚜껑으로 덮고 고정이 완료된 후 실온에서 10 분에서 하룻밤 동안 그대로 둔 후 피펫을 사용하여 느슨한 벌레가있는 고정제를 1.5 밀리리터 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 PBS가 들어 있는 염색 용기에 슬라이드를 담그십시오.

벌레가 들어있는 튜브를 30초 동안 고속으로 돌려 펠릿으로 만듭니다. PBS로 벌레를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드의 벌레와 병렬로 염색을 진행하십시오.

항체 염색 프로토콜은 슬라이드의 모든 조직에 대한 표준 프로토콜과 유사하며 첨부 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 염색 후 슬라이드를 PBS로 옮기고 장착할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 그대로 둡니다. 슬라이드를 장착하려면 PBS에서 슬라이드를 제거합니다.

보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 뒷면을 말린 다음 종이 타월에 빠르게 간단히 올려 놓습니다. 웜 위에 약 20마이크로리터의 장착 매체를 배치하여 매체와 PBS가 거의 동일한 부분이 되도록 합니다. 슬라이드에서.

슬라이드를 부드럽게 기울여 두 솔루션을 혼합합니다. 주의: 장착 매체는 독성이 있습니다. 서리로 덥은 가장자리를 잡고 있습니다.

용액이 프로스팅 근처에 모이도록 슬라이드를 기울입니다. 그런 다음 24 x 60mm 커버 슬립의 한쪽 가장자리를 용액에 올려 놓아 표백을 증가시키고 시청을 방해하는 기포를 최소화합니다. 커버 슬립을 부드럽게 내립니다.

기포가 형성되면 커버 슬립의 가장자리를 천천히 들어 올리십시오. 그런 다음 웜을 가로질러 미끄러지지 않고 다시 내립니다. 기포를 제거하기 위해 필요한 경우 PBS를 더 추가합니다.

보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 덮개의 가장자리를 누르고 미끄러진 다음 조심스럽게 밀어 가장자리를 말리십시오. 슬라이드의 가장자리는 커버 슬립의 가장자리 전체에서 볼 수 있어야 하며 너무 젖지 않아야 합니다. 커버 슬립을 밀봉하고 가장자리에 매니큐어를 2-3겹 바르십시오.

슬라이드가 잘 밀봉되고 건조되면 커버 슬립과 슬라이드 뒷면을 청소하고 슬라이드 홀더 웰에 넣습니다. 밀봉된 슬라이드는 며칠 동안 섭씨 4도에서 보관하거나 몇 주 동안 섭씨 영하 20도에서 장기간 보관할 수 있습니다. DNA의 단정한 염색과 대부분의 녹색 염료는 특히 오일 이멀젼 렌즈를 사용한 후 필요에 따라 더 많은 매니큐어로 커버 슬립을 다시 밀봉합니다.

다음의 대표적인 이미지는 세포생물학 실험 과정에서 학부생들의 첫 번째 항체 염색 시도 중에 만들어진 슬라이드를 사용하여 수집된 것입니다. 이 이미지는 적절하게 압축되고 금이 가고 메탄올 아세톤으로 가볍게 고정된 두 성인 자웅동체의 머리의 예를 보여줍니다. 그들은 여러 항체와 염료로 표지되었습니다.

이 경우 거의 모든 웜이 항체에 접근할 수 있습니다. 염색여기서 DPI 염색으로 표시된 핵의 위치는 벌레의 어느 부분이 손상되지 않았는지를 나타냅니다. 기생충이 포름알데히드와 같은 더 단단한 고정제를 투여하면 기생충의 형태가 왜곡될 수 있습니다.

이것은 이 이미지에서 빨간색으로 표시된 근육의 물결 모양으로 볼 수 있습니다. 더 단단한 고정제의 사용과 관련된 또 다른 일반적인 문제는 특정 조직의 불균일한 고정 또는 침투입니다. 이것은 빨간색으로 표시된 근육이 벌레의 일부에서만 염색된 곳에서 볼 수 있습니다.

여기서, 파란색으로 표시된 DNA를 포함한 다른 염색의 존재는 신체의 적어도 일부가 존재했음을 나타냅니다. 그 결과로 발생하는 부분적 염색 패턴은 연습을 통해 쉽게 식별할 수 있으므로 단일 벌레가 고르지 않은 염색을 보이더라도 염색의 전체 분포를 결정할 수 있습니다. 고정 조건을 사용할 때 동결 균열에서 발생하는 일반적인 문제가 여기에 설명되어 있습니다.

가장 일반적인 문제는 두 슬라이드의 상대적 움직임으로 인한 샘플의 비틀림입니다. 압박 중 여기에서 염색된 조직의 형태는 기생충의 몸체가 인두 바로 뒤쪽으로 뒤틀려 있음을 나타냅니다. 이 이미지는 또한 슬라이드를 코팅하는 폴리리신에 항체가 달라붙어 배경 염색 문제를 보여줍니다.

이는 컨포칼 현미경을 사용하여 방지할 수 있습니다. 연습을 하더라도 많은 개별 웜이 손실되거나 여기에 표시된 몇 가지 문제가 표시됩니다. 일단 숙달되면 준비 및 고정은 한 시간 안에 완료할 수 있으며 염색은 하루 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라, 주어진 항체 및 조직에 대한 염색을 최적화하기 위해 다양한 고정 방법을 수행할 수 있습니다.