제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

본 절차의 전체적인 목표는 형광을 이용하여 호흡 버스트 반응을 정량화하는 것입니다. 먼저, 제브라피시 배아를 96-웰 플레이트의 웰에 분주합니다. 그런 다음 형광 기질을 첨가하고 화학 약제로 호흡 버스트를 활성화합니다.

그런 다음 형광 광도계를 사용하여 상대적 형광 강도를 정량화합니다. 최종적으로, 이 형광 값은 호흡성 burst 잠재력을 나타내는 데 사용됩니다. 이 방법은 실험적 조작이 전반적인 선천 면역 건강에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

본 연구에서는 이를 통해 제브라피쉬 배아의 호흡 버스트(respiratory burst)에 대한 통찰을 제공하지만, 성체 제브라피쉬, 신장 세포 및 다른 어류 종의 세포 표본과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 egg water가 담긴 깊은 페트리 접시에서 28 °C로 배양하십시오. 매일 죽은 배아를 제거하십시오.

기존의 egg water를 조심스럽게 따라내고 매일 새로운 egg water로 보충하십시오. 실험 당일에는 알루미늄 호일로 감싼 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 환원 플루오레세인(reduced fluorescein) 작업 용액을 조제하십시오. 또한 최종 농도가 20 micrograms per milliliter가 되도록 PMA 작업 용액을 준비하십시오.

그 다음, 함께 제공된 텍스트에 설명된 대로 15 mL 원뿔형 튜브에 각 투여 용액을 5 mL씩 조제합니다. 투여 용액은 얼음 위에 보관하십시오. 먼저 마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 형광 측정을 위해 광원을 예열합니다. 들뜸 및 방출 파장, 광학 위치 감도를 상세히 설정한 프로그램을 구성하고, 5초간의 흔들기 단계를 포함시키십시오.

실험 시작 전, 코팅된 배아가 담긴 배양 접시를 포함하여 다음의 실험 도구들을 준비하십시오. 검은색 96-웰 마이크로플레이트, P 200 피펫 및 팁, 플루오레세인 함유 시약이 들어 있는 아이스 버킷, 멀티채널 P 200 피펫, 멸균 리저보어 2개, 알루미늄 호일 및 가위가 필요합니다.

이제 배아나 신장이 통과할 수 있도록 피펫 팁의 끝을 자릅니다. P 200 피펫을 100 µL로 설정하고, 난자 배양액과 함께 배아 한 개를 검정색 96-well 마이크로플레이트의 원하는 수의 웰에 옮겨 담습니다. 그다음, 멀티채널 P 200 피펫을 사용하여 멸균된 25 mL 리저버에 투여 용액을 붓습니다.

96-웰 마이크로플레이트의 한 컬럼에 100 µL의 H 2D CFDA 투여 용액을 넣습니다. 대조군 배아 샘플의 절반과 실험적으로 조작된 배아 샘플의 절반에 대해 이 과정을 반복합니다. PMA가 포함된 투여 용액을 새로운 멸균 25 mL 리저버에 붓습니다.

그런 다음 이 투여 용액을 96웰 마이크로플레이트의 나머지 컬럼에 분주합니다. 마이크로플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 셰이커에 올려 약 20초 동안 흔들어 줍니다. 판독하지 않는 동안에는 마이크로플레이트를 150 RPM, 28 °C에서 배양합니다.

PMA를 첨가한 후 마이크로플레이트를 판독합니다. 원하는 시간 간격 동안 몇 분마다 측정을 계속하거나, 호일로 감싼 마이크로플레이트를 28 °C에서 정해진 시점까지 배양합니다. 다음으로, 웰에서 배아를 회수한 후 기관의 동물 관리 및 사용 프로토콜에 따라 배아를 안락사시킵니다.

또한, 마이크로플레이트와 기타 일회용 소모품은 생물학적 위험 폐기물 용기에 폐기하십시오. 형광을 비교할 시점을 결정하십시오. PMA 유도 대조군의 개별 형광 값에서 유도되지 않은 대조군의 평균 형광 값을 뺍니다.

PMA를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 실험군에 대해 이 과정을 반복하십시오. 그런 다음, 정규화된 형광 값을 대조군+PMA 그룹과 실험군+PMA 그룹의 열에 각각 저장하십시오. 다음으로, 대조군+PMA 그룹과 실험군+PMA 그룹의 정규화된 형광 값에 대한 평균과 표준 편차를 계산하십시오.

비쌍결합 T-검정(unpaired T-test)을 사용하여 정규화된 형광 값을 비교하고 통계적 유의성을 결정합니다. 이제 PMA가 첨가된 대조군과 PMA가 첨가된 실험군의 평균값을 그래프로 나타내고, 적절한 표준 편차를 반영하는 오차 막대를 표시하십시오. 유의 수준을 그래프와 그림 설명에 기록합니다. 이 실험은 수정 후 48시간 및 72시간 된 AB 배경의 야생형 제브라피시 배아에서 호흡성 버스트 반응을 비교합니다.

PMA 유도군에서는 PMA 첨가 4시간 후에 가공되지 않은 형광 강도를 측정하였습니다. 72 HPF 군의 가공되지 않은 형광 수치가 더 높게 나타났습니다. 계산된 평균 형광 수치에서 알 수 있듯이, 배경 형광 수준의 변동성을 고려하여 수치를 정규화하였습니다.

본 호흡 활성(respiratory burst) 분석 결과, 72 HPF 제브라피쉬 배아는 PMA로 유도했을 때 48 HPF 배아보다 유의미하게 더 많은 활성 산소를 생성하며, 따라서 더 강력한 호흡 활성 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광을 이용하여 제브라피쉬 배아의 호흡 활성 잠재력을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. PMA 분말을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, PMA 분말을 칭량할 때 안면 마스크를 착용하는 등의 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.