제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 형광을 사용하여 호흡 파열 반응을 정량화하는 것입니다. 먼저, 제브라피시 배아를 96 웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 그런 다음 형광 기질을 추가하고 화학 약품으로 호흡 파열을 활성화합니다.

그런 다음 형광계를 사용하여 상대 형광을 정량화합니다. 궁극적으로 형광은 호흡기 파열 가능성을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 실험적 조작이 전반적인 선천성 면역 건강에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에서 우리는 이를 사용하여 제브라피시 배아의 호흡 폭발에 대한 통찰력을 제공하지만 성체 제브라피시, 신장 세포 및 다른 어종의 세포 제제와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 원하는 발달 단계가 될 때까지 섭씨 28도의 달걀 물에 깊은 페트리 접시에서 배아를 성장시킵니다. 매일 죽은 배아를 제거하십시오.

오래된 달걀 물을 조심스럽게 디캔팅하고 매일 새 달걀 물을 보충하십시오. 실험 당일, 호일로 감싼 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브에 환원된 플루오레세인 작업 용액을 만듭니다. 또한 PMA 최종 농도 밀리리터당 20마이크로그램의 작업 용액을 준비합니다.

그런 다음 함께 제공된 텍스트에 설명된 대로 15ml 원뿔형 튜브에 각 투여 용액을 5ml씩 만듭니다. 투여 용액을 얼음 위에 두고, 먼저 Microplate 리더의 전원을 켜고, 광원을 예열하여 형광을 측정합니다. 여기 및 방출 파장, 광학 위치 감도를 자세히 설명하는 프로그램을 설정하고 5초 쉐이킹 단계도 포함합니다.

갈대가 나오기 전에, 코팅된 배아가 있는 접시의 실험용 공급품을 준비합니다. 검은색 96웰 마이크로플레이트, P 200 피펫터, 얼음 양동이에 플루오레세인 함유 시약이 들어 있습니다. 멀티채널 P 200 파이펫터, 2개의 멸균 저장용기, 알루미늄 호일 및 가위.

이제 배아 또는 신장이 구멍을 통해 들어갈 수 있도록 피펫 끝을 자릅니다. P 200 피펫터를 100마이크로리터로 설정하고 난수와 함께 하나의 배아를 원하는 만큼 검은색 96웰 마이크로플레이트의 웰로 옮깁니다. 이제 다채널 P 200 파이펫터를 사용하여 투여 용액을 멸균 25ml 용기에 붓습니다.

100마이크로리터의 H 2D CFDA 투여 용액을 96개 중 한 열에 추가합니다. 음, 대조 배아 샘플의 절반과 실험적으로 조작된 배아 샘플의 절반에 대해 마이크로플레이트를 반복합니다. PMA가 함유된 투여 용액을 새로운 멸균 25ml 용기에 붓습니다.

그런 다음 이 투여 용액을 96 Well 마이크로플레이트의 나머지 컬럼으로 분취합니다. 마이크로플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 셰이커에 약 20초 동안 올려 놓습니다. 150RPM에서 Microplate를 읽지 않을 때 섭씨 28도에서 배양합니다.

PMA를 추가한 후 마이크로플레이트를 판독합니다. 원하는 시간 간격 동안 몇 분마다 측정을 계속하거나 고정된 시점까지 호일로 감싼 마이크로플레이트를 섭씨 28도에서 배양합니다. 다음으로, 우물에서 배아를 회수하고 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜에 따라 배아를 안락사시킵니다.

또한 마이크로플레이트 및 기타 일회용 물질을 생물학적 유해 폐기물 페인터에 폐기하십시오. 형광을 비교하고자 하는 시점을 결정하십시오. 개별 PMA 유도 대조군의 독감 형광 값에서 평균 un induced control group의 형광 값을 뺍니다.

PMA가 있는 그룹과 없는 그룹에 대해 이 작업을 반복합니다. 그런 다음 이러한 정규화된 형광 값을 대조군 및 PMA 그룹 및 실험 및 PMA 그룹 컬럼에 저장합니다. 다음으로, 대조군과 PMA 그룹 및 실험군과 PMA 그룹의 정규화된 형광 값에 대한 평균과 표준 편차를 계산합니다.

통계적 유의성을 결정하기 위해 짝을 이루지 않은 T-검정을 사용하여 정규화된 형광 값을 비교합니다. 이제 적절한 표준 편차를 반영하는 오차 막대가 있는 대조군 및 PMA 그룹 및 실험 및 PMA 그룹의 평균을 그래프로 표시하면 그래프와 그림 범례에 유의 수준을 기록합니다. 이 실험은 수정 후 48시간과 72시간에 AB 배경의 야생형 제브라피시 배아의 호흡 파열 반응을 비교합니다.

원시 형광은 PMA 유도 그룹에서 PMA를 첨가한 후 4시간 후에 측정되었습니다. 원시 형광 값은 72 HPF 집단에서 더 높았습니다. 계산된 평균에서 알 수 있듯이, 형광 값은 형광 배경 수준의 변동성을 설명하기 위해 정규화된 값입니다.

이 호흡 파열 분석 결과, 72개의 HPF 제브라피시 배아가 훨씬 더 많은 반응성 산소 종을 생산할 수 있으므로 PMA로 유도된 후 48개의 HPF 배아보다 더 강력한 호흡 파열 반응을 일으킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광을 사용하여 제브라피시 배아의 호흡 파열 가능성을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. PMA 분말로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 PMA 분말의 무게를 잴 때 안면 마스크를 착용하는 등의 예방 조치를 취하십시오.