Name: 여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회? (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 학습하세요 Polymalic acid 기반 나노 약물을 이용한 개인 맞춤형 암 치료법. Physarum polycephalum에서 생산한 PMLA로 Her2 양성 유방암을 표적 치료하는 이 방법은 효과적인 종양 억제를 보여줍니다.

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우리는 NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, Cedars-Cedars Medical Center 신경외과 및 Arrogene Technology Inc.의 보조금에 대한 재정 지원에 크게 감사드립니다.

모든 실험은 생체 내에서 수행 IACUC 프로토콜을 전체에 따른다 수술 및 비수술 절차를 포함하여 공식 동물의 규정을 준수합니다. Polymalic 산 1. 생물 생산 <ol><li> 한천에 소 구체에서 시드 문화를 성장 보육 및 기초 배지 8,9 진술 열 25 ° C를 사용하여 100 ㎖의 배양 배지에 변형체를 전송할 수 있습니다. </li><li> 포자 형성을 방지하기 위해 빛의 배제하에 중력 포장 500 ㎖ 마이크로 변형체의 양을 생성한다. </li><li> 10 L 생물 반응기 용기에 8 L의 기초 배지에 현탁 80g의를 CaCO3를 준비합니다. 장착 된 반응 용기에 500 ㎖의 포장 마이크로 변형체를 전송하고 25 ° C, 여과 된 공기와 세그먼트 교반 150 rpm으로 교반의 10 L / min의 유량에서 75 시간 동안 생물 공정을 할 수 있습니다. </li><li> 배양액은 PMLA의 생산의 끝을 나타내는 pH가 4.8이 될 때 종료 및 T에 의하여 PMLA 함량을 측정그 / 철 (III) 분석법 히드. </li><li> 17 ° C로 국물을 냉각하고 세포가 중력에 의해 해결 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C로 냉각하고는, pH를 7.5로 조정 2 M NaOH를 사용합니다. (5 ° C에서 20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5와 평형을 거친 곡물 DEAE) 위쪽으로 방향을 바닥에 DEAE-셀룰로오스 1.5 L로 채워진 칼럼을 통해 상층 액을 펌프. </li><li> 위쪽에서 아래쪽으로 방향을 변경 한 후 0.3 M의 NaCl을 포함하는 버퍼의 3 열 세척하고 0.7 M 염화나트륨의 존재에 PMLA을 용출. </li><li> 0.1 M 염화칼슘 2로 조정하고 80 %의 얼음 냉 에탄올로 PMLA 칼슘을 침전. 50 kDa의 버퍼와 소금이없는 상태에서 물을 사용 - 300 kDa의 50 - - 80 kDa의, 10 (80)의 PMLA 칼슘에 세파 덱스 G25을 통해 분별. </li><li> 앰버 IR의 120H + 칼럼을 통해 각 부분을 통과하고, 즉시 동결 건조 용 액체 질소의 흐름을 통해 polymalic 산을 동결. </li><li> 건조 아세톤에 용해. 여과 후, 용매를 제거마이너스 20 ℃에서 건조 공기의 흐름, 냉동 건조 및 저장에 </li></ol> 2. Polymalic 산 기반의 나노 의약품의 합성 <ol><li> 무수 아세톤 1 ㎖를 2 ㎖의 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 1 밀리몰 N-히드 록시 숙신이 미드 및 1 밀리몰 디시 클로 헥실 카르 보디이 미드에서 PMLA-H의 116 mg의 (1 밀리몰 malyl 단위)를 혼합함으로써 PMLA (P)의 카르복실기를 활성화. 3 시간 동안 20 ℃에서 교반 하였다. 을 mPEG 5000-NH 2 0.05 밀리몰 트리 에틸 아민 (TEA) 다음에 1 ㎖의 DMF에 (malyl 단위 0.05 몰 %)의 0.05 밀리몰을 추가합니다. </li><li> 현명한 DMF 0.4 밀리몰 류신 에틸 에스테르 (LOEt) (malyl 단위의 40 몰 %)에 용해 드롭 추가 0.1 밀리몰 2 - 티올 일 - 에틸 아민 (2-MEA) (malyl 단위의 10 몰 %) 및 ​​0.5 밀리몰 TEA, 모든 DMF에 용해시켰다. 각 첨가 한 후, 1 시간을 허용하고 응답 (박층 크로마토 그래피, TLC) 닌히 드린 음으로 반응 완료를 확인합니다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 (30 분, 산도 6.8)와 자연 가수 분해에 의해 남은 NHS-에스테르를 제거 마십시오. PD를 통해 탈염-10 열, 동결 건조하여 백색 분말로서 &quot;preconjugate&quot;를 얻을 수 있습니다. 마이너스 20 ℃에서 보관 건조 </li><li> 100 MM의 인산 나트륨, 150 mM의 염화나트륨, pH를 5.5 4.5 ㎖에 30 밀리그램의 항체 (단클론 항체,의 IgG2a-κ)를 녹입니다. </li><li> 5 mM의 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 20 ° C에서 30 분 동안 포스 염산염과 이황화 결합을 줄이고 PD-10 칼럼을 통해 정화. </li><li> 같은 버퍼의 2 ml의 말-PEG 3400 - 말을 녹이고 10 ㎖의 최종 부피의 감소 단클론 항체를 추가하고 4 ℃에서 밤새 교반 Vivaspin 20, 30 kD의 배제에 2.5 ml로 농축하고, 세파 덱스 G75을 통해 정화. 초 HPLC를 통해 제품을 확인하고 photometrically 280 nm 파장에서 양을 측정합니다. </li><li> 말 - PEG - 말 - 단클론 항체를 연결 &quot;preconjugate&quot;P / PEG 5000 (5 %) / LOEt (40 %) / 단클론 항체 (0.2 %) / 2-MEA (10 %)를 획득 티올. 위의 버퍼의 pH 5.5에서 50 밀리그램 (P /을 mPEG 5000 / LOEt/2-MEA) 200 nmol의 단클론 항체-PEG 3400 - 말의 5 ㎖를 혼합하여이 작업을 수행 할 sulfhy의 농도를 조정2 mm로 dryl 3 시간 (수율 98 %) 20 ° C에서 알을 품다. </li><li> 용해 3&#39;-H 2 N-AON DMF / PBS에서 테스트 닌 하이 드린 (1:1 V / V) DMF / 메탄올 (에 (산도 7.2)과 반응 N-숙신 3 - (2 - 피리 딜) 프로 피오 네이트 (SPDP) ) 후, 물 및 냉동 건조에, 메탄올 세파 덱스-LH20에 AON-PDP를 정화. </li><li> 이황화 교환 반응이 종료 될 때까지 밤새 상기에서 제조 된 말-PEG 3400 - 말 - 단클론 항체 - preconjugate와 5.5 pH 완충 800 nmol의 활성화 AONs을 품어. </li><li> 통합 형광 알렉사 플 루어 680 - 말레이 미드 고분자-2-MEA-SH와 티오 형성한다. 3 - 피리 딜 - 프로 피오 네이트 (PDP)를 초과 sulfhydryls을 차단하고 세파 덱스 G75을 통해 정화. 4 ° C에서 저장 또는 추가로 사용할 때까지 -80 ° C에서 냉동 스냅. </li></ol> 3. 분석 실험 및 속성 <ol><li> 초 HPLC 분석에 의해 4 ° C와 37 ° C에서 순도와 안정성 PBS의 혈청에 대한 테스트를 수행합니다. molec 폴리스티렌 술폰산을 사용신경근 무게 기준. 나노 크기 분포 및 제타 전위를 측정한다. 상용 시스템을 사용합니다. </li><li> 320 μL의 시료에 10 %의 160 μL (w / v)의 히드 록실 암모늄 클로라이드 및 10 %의 160 μL의 NaOH (V / W)를 추가합니다. 15 분 후, (W / V) 철 (III) CL 3 12 %에서 5 %의 160 μL와 혼합 (V / V) 염산 및 히드 / 철의 540 읽기 (III). PMLA가 1 ㎎ / ㎖ PMLA 2.5 (540)에 해당하는 가정 계산합니다. </li><li> 110 ° C에서 2 M 염산 하룻밤 나노 약물을 가수 분해 및 샘플을 참조하여 역상 크로마토 그래피에 대한 분석 사과산은 사과산 표준 스파이크. 100 mM의 디티 오 트레이 톨로 나노 약물을 베기 및 모르 폴리 노 AON 표준에 대한 정량적 인 역상 HPLC에 의해 모르 폴리 노 - AON을 측정합니다. </li><li> 절단하지 않고 나노 약물을 가지고 단백질 분석 키트를 사용하여 항체를 측정합니다. 암모늄 ferrothiocyanate과의 반응을 허용하여 mpeg 및 정량화, 클로로포름으로 추출하여 510 nm 파장 (10)에서의 흡광도를 읽고 </SUP&gt;. </li><li> 잘 항체 활동 및 colligation 테스트 당 나노 약물 (1-10 μg의 단클론 항체)의 5 ㎕ 씩 ELISA를 수행합니다. 판 코팅 항원 및 과산화 효소 결합 차 항체로 각각 0.5 ㎍ / 잘 트랜스페린 수용체 및 HER2를 사용합니다. </li><li> (예보기 표 1 및 표 2 참조), 사과산 (100 %)에 관해서 AON, mpeg 및 단클론 항체에 대해 달성 %를 계산하고 설계된 의도 %와 비교한다. </li></ol> 4. 시험 관내 시험 <ol><li> (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -5 - - (3 - carboxymethoxyphenyl) -2 - (4 - 설포 페닐 옐로우 시약 [3을 줄이기 위해 자신의 활동에 의해 시간이 지남에 따라 세포 생존 배양 암세포와 메이저 나노 약물 부화 )-2H-테트라 졸, 내부 소금 (MTS) 청색 염료 및 광도계 상대 흡광도를 참조하십시오. 장비 공급 업체의 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 체외 또는 웨스턴 블롯에 대한 생체의 세포 추출물을 준비합니다. 얼음처럼 차가운 추출 B를 사용SDS 및 프로테아제 억제제 칵테일이 포함 uffer. SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 감소 시켜서 별도의 단백질. </li><li> 샘플 추출에 대한 관심의 단백질을 웨스턴 블로 팅 작업을 수행합니다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소에 접합 된 차 항체를 사용합니다. </li><li> 형광 라벨을 사용하여 세포의 이해와 나노 약물 폴리머 플랫폼, AON과 엔도 좀의 공동 현지화을 보여주기 위해 공 초점 현미경을 사용합니다. 형광 레이블로 AONs에 나노 복합 플랫폼과 리사 민 알렉사 플 루어 680을 연결합니다. 표지 된 분자의 분포를 시각화하는 현미경 5X 스펙트럼 스캐너와 살아있는 암세포를 사용 </li><li> 얼룩 엔도 좀의 스티 릴 빨간 형광 염료 막과 엔도 좀의 colocalization을하거나 릴리스를 보여줍니다. </li></ol> 5. 생체 내 테스트 <ol><li> 인간의 HER2-양성 유방암의 마우스 모델 (: 크롬 : (MCR) Foxnnm 누드 마우스 전술)을 준비합니다. 펠렛을 방출 0.72 밀리그램의 17β-에스트라 디올을 삽입 (90 일 발매)의ubcutaneously 각 마우스의 목. </li><li> 그런 피하 오른쪽 측면에 1 × 10 7 BT-474 종양 세포를 주입하고 종양이 성장하자. </li><li> 종양이 꼬리 정맥에 각 항체의 2.5 ㎎ / ㎏ AON 및 / 또는 4.5 ㎎ / ㎏을 함유하는 150 ㎕의 나노 복합체를 주입하여 크기가 120mm 3 때 치료를 시작합니다. 처리를 위해, 일주일에 두 번 완전히 여섯 번을 주입. </li><li> 두 번 약한 캘리퍼스와 종양의 크기를 측정하고 식 (길이 x 높이 x 폭) × (π / 6)를 사용하여 볼륨을 계산합니다. 2 주 마지막 주사 후 자궁 전위 다음 케타민과 Dexmedetomidine의 솔루션을 진정 후 동물을 안락사. </li><li> 형태 학적 평가를 위해 H &amp; E와 종양과 얼룩 부분을 분리합니다. </li><li> 동물 규모에 약물 분포를 평가, 형광 이미징 시스템을 사용한다. 24 및 48 시간에 알렉사 플 루어 680 레이블 나노 약물 및 이미지를 주입한다. </li><li> 동물을 안락사와 불소를 검출격리 및 관류 종양 및 장기에 escence. </li></ol>

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저자 줄리아 Y. Ljubimova, 키스 L. 블랙, 및 Eggehard 소리 쳐는 Arrogene 테크놀로지의 주주입니다

생분해 성 천연 고분자에서 나노 약물의 제조를위한 실험적 경로는 맞춤 의학의 합성에 사용될 수있는 제시된다. 설명은 나노 약물 합성을위한 다양한 플랫폼 polymalic 산의 제어 생산 및 정제로 시작합니다. 재현 가능한 기술을 이용하여, 중합체는 고 분자량 및 의약품 합성에 적합한 극단적 순도가 얻어진다. 합성은 효율적 HER2-양성 유방암을 치료하는 도시되어 나노 약물에 대해 설명한다. 설명은 암의 치료를위한 다른 대부분의 나노 의약품의 합성으로 번역 될 수있다. 타겟팅은 HER2 단백질 또는 효율적으로 내면화하는 다른 종양 표지자로 종양 특이 항원에 결합 등 허셉틴과 같은 항체를 포함한다. 나노 약물을 효율적으로 레에서 암의 성장을 억제합니다 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화학 요법의 선택을 제공합니다atment. 이 예에서, 허셉틴은 HER2와 함께 특정 안티센스 올리고 뉴클레오티드 어닐링에 결합 HER2 코딩의 mRNA는 HER2-신호 및 HER2-양성 유방암의 심각한 감소의 지속적인 차단의 결과. 종양 타겟팅 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드에 의한 유전자 발현 억제의 기본 원칙을 바탕으로 우리는 최신의 여러 가지 다른 나노 약물과 성공적으로 억제 전임상 인간 아교 모세포종과 트리플 부정적인 유방암 11,14-18을 합성했다. 합성 작업은 Physarum의 polycephalum ( &quot;점액 금형&quot;가족의 종)의 배양액에서 polymalic 산 고도로 정제 된 나노 약물 플랫폼의 준비를 시작한다. 제제는 수많은 항체, 펩티드, 올리고 뉴클레오티드 및 활성 약물 전달 및 종양 성장 억제에서 기능하는 다른 분자의 부착을 허용하는 원리에서, 중합체의 고 분자량을 강조한다. Followi제어 배양 및 정제를 겨, 예측 가능한 수익률 폴리머의 재현 품질이 생산되고 있습니다. 폴리머는 언제든지 편리한 조건에서 저장된다. 중합체 - 펜던트 카복실 레이트의 화학적 활성화로 시작 PMLA 나노 복합체의 합성은 몇 합성 단계에서 수행된다. 단계 사이에서, 합성 중간체는 선택적으로 임의의 양의 제제를 허용 보류 될 수 있고, 따라서 스케일링을하여 사용할 수있다. 합성의 진행은 TLC 및 HPLC 급 -​​ 뒤에되고, 나노 약물 조성물 및 활성 모두는 그룹 특정 화학 정량 분석​​법, ELISA, 물리적 다양한 측정에 의해 제어된다. 우리의 경험은 이러한 합성이 우수한 수율 및 순도 원활하고 재현성있게 진행되고 있다는 점이다. PE에 필요한 항체 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 특이성을 선택하여 나노 약물의 변형은 유리하게 합성약을 rsonalized. 인간 HER2-양성 유방암의 성공적인 치료의 양상은 마우스 암 모델의 제조, 나노 약물, 이미징 및 종양 성장 분석에의 응용에 유효 대표이다. 시험 관내 생존 시험의 결과는 세포주 및 동물 실험에 사용되는 주요 약물을 선택하는 데 유용하다. 생체 Xenogen 이미징 나노 약물이 실제로 종양에 전달되는 것을 검증한다. 웨스턴 블랏의 결과는 특정 단백질의 수준은 암 치료 동안 예측 된 방식으로 반응 여부를 보여준다. 종양의 크기를 측정, 즉 억제 후퇴 또는 회귀에 대한 치료의 성공에 대해 알려준다. 한 예는 예측, 재현성 및 주목할만한 독성이없는 높은 정도를 나타내는 다른 polymalic 산 기반의 나노 약물과 우리의 경험을 반영한다. 독성과 여러 t의 효능에 대한 최근 결과트리플 부정적인 유방암 치료를위한 argeted polymalic 산 복합체는이 개념 18의 강력한 지원에 있습니다. 종양의 중간에 넘쳐에 의한 내피 장벽, 엔도 좀의 흡수에 의한 종양 세포의 막과 류신 에틸 에스테르 또는 trileucine 그룹의 작용에 의해 엔도 좀 막 중단 : 주요 기능은 우리의 나노 약물 바이오 장벽을 통과 할 수 있다는 것입니다. 혈관 외 유출 및 엔도 좀 흡수를 확실 나노 약물에 부착 된 특정 항체에 의해 달성된다. 반대로 마우스 트랜스페린 수용체 항체는 수용체가 가장 종양 혈관에 과발현 아마 때문에, transcytosis에 의해 종양에 효과적인 유입을 중재한다. 다른 항체는 구체적받는 종양 세포에 나노 약물을 연출 같은 나노 복합체 분자의 기능에 부속. 두 항체의 존재는, transcytosis의 하나 엔도 좀의 이해에 대한 다른 하나는, 최적의 작동을 위해 필수적입니다. m의 정량 분석ALIC 산 항체가 높은 나노 약물의 최적의 구성을 제어하기 위해 권장합니다. 마지막으로이 모든 기능을 하나의 공유 결합 나노 약물이받는 사람의 종양 세포에 호스트 혈관을 통해가는 길 화학적으로 연결된 형태로 약을 제공하는 것을 주목해야한다. 그들이 대상 사이트의 나노 복합 플랫폼에서의 분열로 무료 약물로 재구성 될 때까지 화학 첨부 (전구 약물) 대부분의 약물이 비활성 상태로 렌더링합니다. 재 활성화 양상이 전달 및 부작용을 불러 일으킬 수있는 최소한의 기회 동안 고도의 안전을 제공하기 때문에 중요합니다. 다 기능성, 효능과 안전성이 좋은 맞춤 의학의 필수 속성입니다.

암의 게놈이 (생명 공학 및 암 게놈지도 책에 대한 국립 센터) 풀어되었을 때 포스트 게놈 시대에 암 미래의 치료는 종종 같은 종양 1-4에서 종양의 유전 적 다양성을 설명 할 것이다. 생물 정보학 및 비용, 빠른되지 DNA 시퀀싱 할 수있는 개인 수준 2,4,5에 악성 유전자 / 돌연변이의 인수. 유전자가 확인 된 후에, 환자는 악성 유전자 6의 발현을 수정하거나 침묵하는 맞춤 의학으로 취급됩니다. 암세포를 표적으로하고있는 세포로 약물을 전달하기 위해 필요 작용기 전달 시스템을 요구한다. 물론, 나노 약물은이 요구 사항 7을 충족 할 수 있습니다. 발견의 노도에서 나노 입자는 화학 요법 약물, 단백질 및 / 또는 암 세포에 유전자 활성 물질의 페이로드를 가지고 적당한 입증했다. 그러나 부작용은 광고로 남아옷을 입고있다. 생분해의 부재와 관련된 그 중 하나는 질병을 야기 할 수있는 가능성과 건강한 조직과 기관에 자료의 침착의 원인이 될 수 있습니다. 증착을 최소화하기 위해, 우리는 비 독성과 비 면역 원성 polymalic 미생물 유래입니다 산, 그리고 H 2 O와 CO 2 8 생분해을 소개했다. 우리는 나노 약물의 모든 기능을 하나의 공유 유형을 합성 폴리머를 사용합니다. 그런 테모 졸로 미드, 독소루비신, 또는 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 혈관 외 유출, 조직 타겟팅, endosomolytic 배달 서비스를 제공 작용기를 화학적으로 부착 된 화학 요법이 포함되어 있습니다. 그들은 따라서 자신의 모든 제약 활동을 재생, 표적 종양 세포에 도착했을 때 약물은 본질적으로 나노 플랫폼에서 절단됩니다. 우리는 고분자 나노 플랫폼의 미생물 생산 방법, 그 정화 및 암 트라 스투 주 마브 (허셉틴)을 포함 나노 약물의 화학 합성을 서술HER2의 과잉 생산의 억제에 대한 타겟팅 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드. 누드 마우스에 이종 인간 HER2가 양성 유방암에 나노 약물을 적용, 우리는 암 치료의 높은 효능을 보여줍니다. polymalic 산 나노 약물 여기 소개 종양 타겟팅 및 유전자 침묵의 원칙은 암의 다른 경우의 치료에 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토-1-에틸아민(시스테아민; 2MEA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>30078-25G</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90-Day release 17&beta;-estradiol pellet&nbsp;</td><td>미국의</td><td></td><td></td>혁신적인 연구</tr><tr><td>Alexa Fluor 680 C2 maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20344</td><td></td></tr><tr><td>Amberlite IR 120H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6428</td><td></td></tr><tr><td>소포제 Y-30 에멀젼</td><td>Sigam-Aldrich</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Anti-laminin-411 chain mAbs</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-59980</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pAkt mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>9271S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARB mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>556494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-von Willebrand Factor 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>Bacto, Dickinson/Sparks, MD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>베타-액틴</td><td>세포 신호</td><td>3700</td><td></td></tr><tr><td>BT-474&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 카보네이</td>트 <td>Alfa Aesar</td><td>36337</td><td></td></tr><tr><td>세포 증식 분석 키트</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>PR-G3580</td><td></td></tr><tr><td>Centriplus 100&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>4414</td><td></td></tr><tr><td>Dicyclohexylcarbodimide</td><td>Fluka</td><td>36650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-4</td><td></td></tr><tr><td>Galardin (MMP-inhibitors)&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-994</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>셀 신호&nbsp;</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-3</td><td></td></tr><tr><td>돼지의 헤민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>허셉틴</td><td>Genentech</td><td>15534</td><td></td></tr><tr><td>허셉틴(웨스턴 블로팅)</td><td>세포 신호</td><td>2165S</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a-kappa 쥐 악성 종</td>양 <td>시그마</td><td>M77695X5m</td><td></td></tr><tr><td>면역 별 AP 기판 팩</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>Immun-StarTM AP 기판 팩&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>LAL 시약 물&nbsp;</td><td>Lonza, MD</td><td>W50-1000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-411 mAbs</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leucine 에틸 에스테르 (LOEt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61850-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 테스트</td><td>Cambrex BioScience</td><td>N384</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin-Morpholino AON</td><td>유전자 도구</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>L-말산&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>말레이트 탈수소효소&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2634</td><td></td></tr><tr><td>Mal-PEG-Mal</td><td>Laysan</td><td>mal-PEG-mal-3400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>우유, 무지방 분말&nbsp;</td><td>프로테오믹스</td><td>M203-10G</td><td></td></tr><tr><td>모르폴리노 올리고뉴클레오티드&nbsp;</td><td>GeneTools</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>mPEG5000</td><td>Lysan</td><td>mPEG-NH2-5000</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시숙신미드(NHS)&nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>15727100</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Merck</td><td>1.06762.0100</td><td></td></tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 멤브레인 필터 종이 샌드위치</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 멤브레인 필터 종이 샌드위치, 0.45 &micro; 엠&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Novex &reg; Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>누드 마우스 [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]&nbsp;</td><td>Taconic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 10x</td><td>Gibco</td><td>10010-49</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 1x</td><td>Gibco</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851</td><td></td></tr><tr><td>Physarum polycephalum M3CVII</td><td>ATCC</td><td>204388</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>1.18362E+11</td><td></td></tr><tr><td>단백질 검출기 ELISA 키트</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 슈퍼파인</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0031</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex-LH20&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0090</td><td></td></tr><tr><td>SKBR-3&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SPDP</td><td>프로테오켐&nbsp;</td><td>C1116</td><td></td></tr><tr><td>Streamline-DEAE</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0994</td><td></td></tr><tr><td>스티릴 레드 FM 1-43&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>T-3163</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>TLC, 실리카 코팅 알루미늄 시트</td><td>Merck, Darmstadt, DE</td><td>60F254</td><td></td></tr><tr><td>Trileucine (LLL)</td><td>Bachem</td><td>H-3915</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>X114</td><td></td></tr><tr><td>트윈&reg; 20&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>비바스핀 20&nbsp;</td><td>VWR</td><td>14005-302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱스메데토미딘</td><td>화이자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아티파메졸</td><td>화이자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카프로펜</td><td>화이자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>베타딘</td><td>포스터 앤 스미스, 위스콘신</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

등급과 형태가 비슷한 종양은 분자 프로파일링의 차이로 인해 동일한 치료에 다르게 반응하는 경우가 많습니다. 이러한 다양성을 설명하기 위해 악성 종양 관련 유전자를 침묵시키기 위한 맞춤형 의학이 개발되었습니다. 나노 약물은 종양을 표적으로 하고 유전자를 침묵시키기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전달함으로써 이러한 요구에 부응합니다. 치료를 위한 약물이 반복적으로 투여되는 경우가 많기 때문에 독성이 없고 면역 반응이 무시할 수 있는 것이 바람직합니다. 여기에 제시된 예에서 나노 의약품은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 종양 표적 분자의 제어된 화학적 결찰에 의해 생분해성, 무독성 및 비면역원성 플랫폼 폴리말산에서 합성됩니다. 합성 및 치료는 실험용 마우스 모델을 사용하여 인간 Her2 양성 유방암에 대한 예시입니다. 이 사례는 다른 종양의 합성 및 치료로 해석될 수 있습니다.

polymalic 산계 나노 약물의 예는 암에 적용 가능하다 맞춤 의학의 합리적인 디자인으로 제시된다. 그것은 누드 마우스에 HER2가 긍정적 인간 유방암을 치료하는 나노 약물의 합성을 설명한다.

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

전체적인 목표는 특히 암과 같은 개인의 질병 유전적 특성에 기반하여 맞춤형 의약품을 합성하기 위한 범용 프로토콜이 가능한 나노 규모의 플랫폼을 구축하는 것입니다. 먼저 미생물 frum polycephalum으로부터 폴리 말산(poly malic acid)을 생산 및 정제합니다. 정제된 PMLA의 펜던트 카복실기(carboxylic groups)를 화학적으로 활성화합니다. 활성화된 그룹의 치환을 통해 작은 기능기들과 링커 MEA를 부착하고, 사용되지 않은 활성화 그룹은 가수분해를 통해 다시 카복실기로 되돌립니다.다음으로, 스페이서, MEA 및 캡의 설프히드릴(sulf hydro) 그룹을 통해 항체와 안티센스 분자를 첨가합니다. PDP와의 반응 후 사용되지 않은 스페이서를 통해 리드의 조성과 기능을 테스트합니다. 나노 약물 결과는 공격적인 인간암을 보유한 생쥐와 같은 동물 모델로부터 얻습니다.HER2 양성 유방암은 치료의 효능뿐만 아니라 치료 과정에서 원치 않는 부작용이 없는지 여부를 결정할 수 있습니다. 개환 중합과 같은 기존의 합성 방법보다 바이오 생산이 갖는 주요 장점은 바이오폴리머가 완전한 광학적 순도를 유지하며 부산물로 오염되지 않는다는 점입니다. 이러한 PolyPhen 나노 약물군은 특정 타겟팅을 기반으로 모든 세포 유형을 표적할 수 있으며 단백질 발현을 조절할 수 있습니다.일반적으로 PHE 나노 약물을 이용한 암 치료는 일차성 뇌암과 유방암을 포함한 여러 동물 모델에서 매우 효율적입니다. 저희는 먼저 이 방법을 통해 교모세포종 특이적 라민의 이소형 합성을 차단한다는 아이디어를 얻었으며, 이후 HER2 및 삼중 음성 유방암 단백질을 표적화하고 억제하여 종양 성장을 방지함을 입증했습니다. 이 기술의 응용 범위는 광학 및 자기 공명 영상을 이용한 암 진단까지 확장됩니다.폴리 나노 약물은 암 치료를 위한 약물 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 또한 감염성 질환, 통증 완화 및 신경계 질환과 같은 다른 병리적 상태에도 적용될 수 있습니다. 오거의 스파이럴로부터 시드 플라스모디움 배양물을 증식시킨 후, 100 milliliters의 기초 배양 배지에 접종하고 25 degrees Celsius에서 배양합니다.차광 조건 하에서 정온 배양기를 사용하여 중력 충전된 microplasm modia를 제조합니다. 10L 바이오리액터 용기 내에서 포자 형성을 방지하기 위해, 8L의 기초 배지에 80g의 탄산칼슘을 용해한 후, 충전된 microplasm modia를 장착된 반응 용기로 옮기고 바이오공정 시간을 75시간으로 설정합니다. 이때 온도는 25°C, 여과 공기 유량은 10L/min, 세그먼트 교반기를 이용한 교반 속도는 150RPM으로 유지합니다.배양액의 pH가 4.8이 되면, 배양을 중단하고 폴리말레산(poly maleic acid) 생산량을 측정합니다. 이제 배양액을 17 °C로 냉각하고 세포가 중력에 의해 가라앉도록 둔 다음, 반응기에서 배양 상층액을 제거합니다. pH를 7.5로 조절합니다.이제 5 °C에서 20 mM tris hydrochloride pH 7.5로 평형화된 1.5 L DEAE cellulose 컬럼 하단부로 상층액을 펌핑합니다. 그런 다음 0.3 M sodium chloride가 포함된 세척 버퍼 3 컬럼 분량을 컬럼 하단에서 상단 방향으로 통과시킨 후, 0.7 M sodium chloride 조건에서 PMLA를 용출합니다. 용출된 PMLA 분획을 0.1 M calcium chloride로 조절하고 80% ice cold ethanol을 첨가하여 PMLA calcium을 침전시킵니다. 다음으로 Sephadex G 25와 물을 사용하여 PMLA calcium을 크기 배제 크로마토그래피로 분획합니다.마지막으로 각 분획을 호박색 광컬럼(amber light column)에 통과시키고, 폴리말산(poly malic acid)이 포함된 유출액을 즉시 액체 질소로 급속 동결시킨 후 동결 건조하여 -20 °C에서 보관하십시오. PMLA의 카복실기를 활성화하려면, 1 mL의 무수 아세톤에 1 mmol의 PMLA-H 단위를 혼합하고, 2 mL의 디메틸포름아미드(dimethylformamide)에 각각 1 mmol의 hydroxy CIN aide와 cylo heyl carbo ide를 혼합한 후 20 °C에서 3시간 동안 교반하십시오. 그 다음, 1 mL의 DMF에 녹인 0.05 mmol의 methyl Pega mean을 첨가하고, 이어서 0.05 mmol의 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가하십시오.그 후 0.4 millimoles의 leucine ethyl ester를 한 방울씩 첨가하고, 1시간 뒤 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)에서 음성 hyn 반응을 통해 반응 완료 여부를 확인합니다. 마찬가지로 0.1 millimoles의 two me capto, one ethylamine 및 0.5 millimoles의 TEA를 첨가합니다. 잔류하는 NHS ester는 phosphate buffered saline을 이용한 자발적 가수분해로 제거합니다.PD 10 컬럼으로 탈염한 후 동결 건조하여 흰색 분말로 얻으며, 이 사전 접합물을 -20 °C에서 건조 상태로 보관하십시오. 다음으로, pH 5.5의 150 mM sodium chloride 및 100 mM sodium phosphate 4.5 mL에 항체 30 mg을 첨가합니다. 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride를 사용하여 이황화 결합을 환원시키고, PD 10 컬럼으로 정제합니다.이제 IDE PEG IDE를 pH 6.3로 조절한 상기 버퍼 2 mL에 녹입니다. 환원된 항체를 첨가하고 20 °C에서 1시간 동안 교반합니다. 30 kDa 분획 한계의 AVEVA spin 20을 사용하여 2.5 mL로 농축한 후, cidex G 75로 정제합니다.이제 SEC HPLC를 통해 생성물을 확인합니다. 280 nm에서 양을 측정하고, 다른 파장에서 불순물이 없는지도 확인하십시오. 다음으로, pH 6.3 완충액 5 mL에 프리 컨쥬게이트 50 mg과 항체 결합 PEG IDE 200 MLE를 혼합합니다.sulf hydro의 농도를 2mM로 조절하고 20°C에서 3시간 동안 배양합니다. 98%의 수율을 얻으려면, 3' amino antisense oligonucleotide를 1부피의 SPDP와 반응시키고, 메탄올 내에서 Sephadex LH-20으로 AON-PDP를 정제한 다음, 메탄올을 증발시키고 생성물을 물에 녹여 동결건조하십시오. 이제 활성화된 AO 800nM을 MEA SH에 PEG가 사전 결합된 항체와 함께 밤새 배양합니다. 이황화 결합 교환 반응이 종료되면, PDP로 과량의 sulf hydro를 차단하여 형광 염료 블록을 통합하고 Sephadex G-75로 정제하십시오.최종 폴리 말산 기반 나노 약물을 -20 °C에서 보관하십시오. 제조 과정 중 폴리 말산 함량을 측정하려면 다음과 같이 진행하십시오. 320 µL의 시료에 10% 하이드록실 암모늄 클로라이드 160 µL와 10% 수산화나트륨 160 µL를 첨가합니다. 10~15분 후, 5% 염화철 용액 160 µL와 혼합하고 540 nm에서 진한 보라색의 형성을 확인합니다. 다음으로, 밀봉된 앰플을 사용하여 2 M 염산 내에서 110 °C로 나노 약물을 하룻밤 동안 가수분해한 후, 역상 크로마토그래피로 말산을 분석하십시오.말레산(maleic acid) 표준물질을 스파이킹한 샘플을 사용합니다. 이제 100 millimolar dithiothreitol로 나노 약물을 절단하고, morpho antisense oligonucleotides를 morpho a ON 표준물질과 비교하여 정량 역상 HPLC로 측정합니다. 절단된 나노 약물을 사용하여 단백질 분석 키트로 항체 함량을 측정함으로써 Malik PEG 함량을 정량화합니다.먼저, 티오시안산 암모늄(ammonium OT thiocyanate)과 반응시킨 후, 클로로포름으로 추출하고 510 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 웰당 5 µL의 나노 약물과 플레이트에 코팅된 항원으로 웰당 0.5 µg의 her two를 사용하여 Eliza로 항체 활성 및 공동 결합(co ligation)을 테스트합니다. 마지막으로, 말레산(maleic acid)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), EG 및 항체의 달성 백분율을 계산합니다.약물 설계 시 의도한 백분율과 비교하십시오. 나노 약물에 대한 이 이봉형(bimodal) 전략적 접근법은 HER2 신호 전달 경로를 억제하기 위해 Herceptin을 사용하고, HER2 수용체의 전사를 차단하기 위해 HER2 특이적 antisense oligonucleotide(aON)를 사용하며, 항체는 종양 혈관의 내피 TFR을 통한 트랜스사이토시스를 촉진합니다. 나노 접합체 플랫폼인 poly maleic acid는 배양된 micro plasmo에 의해 생성되고 정제되었으며, PMLA 카르복실기의 활성화는 프리컨쥬게이트 스캐폴드의 합성을 용이하게 했습니다.마지막으로 리드 나노 접합체입니다. Eli SA 분석을 통해 나노 약물 합성 과정 전반에 걸쳐 활성 단클론 항체가 유지됨을 확인하였습니다. 두 항체가 동일한 폴리머 플랫폼에 조립된 상태에서, 형광 공초점 현미경을 사용하여 나노 약물의 세포 내 흡수를 추적하였습니다.0시간과 3시간의 중첩 이미지를 표지된 엔도솜과 함께 분석하였습니다. 공국소화(colocalization)에 대한 Pearson 상관계수는 엔도솜에서 세포질로의 나노 약물 방출과, 세포질 내 글루타티온 의존적 이황화 결합 절단을 통한 나노 약물로부터의 ON 해리를 나타냅니다. In vitro 실험에서, 리드 나노 약물은 HER2 과발현 세포주에서 성장을 가장 효과적으로 유의미하게 억제하였습니다.HER2를 과발현하는 인간 유방암 세포주 BT 474를 이식한 마우스 대상의 in vivo 실험 결과, Herceptin을 포함하는 선도 나노 약물에 의해 95% 이상의 성장 억제가 나타났습니다. 또한, HER2 특이적 항체를 이용한 ex vivo Western blotting 결과 HER2의 합성 및 인산화가 모두 억제되었음이 확인되었으며, PARP의 cleaved-K T 분절은 세포 사멸(apoptosis)이 일어났음을 나타냈습니다. 약물 처리에 따른 종양 퇴행은 조직학적 검사를 통한 종양 크기의 감소 및 종양 세포의 고갈로 입증되었습니다.이제 여러분은 부작용 없이 효과적인 개인 맞춤형 치료를 구현하기 위해 생체 적합성 나노 플랫폼을 사용하는 방법과, 제어된 조성 및 검증된 기능적 활성을 갖춘 나노 약물을 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 일단 숙달되면, 이러한 센서는 개발 후 높은 재현성으로 수행될 수 있습니다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적 전달을 위해 폴리아크릴산 나노 플랫폼을 사용하는 이 기술은, 개인 맞춤형 유전자 분석을 통해 확인된 특정 종양 분자 표적을 겨냥한 종양 치료를 탐구하려는 개인 맞춤형 나노 의학 분야 연구자들에게 길을 열어줄 것입니다. 약리학적으로 활성 제제와 세포는 매우 위험할 수 있습니다.본 절차를 수행하는 동안에는 항상 마스크와 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

쥐 전립선 암 모델에서 종양 침윤에 응고 된 혈장 단백질에 특정한 MRI 조영제를 대상으로 작은 펩티드와 암 MR 분자 이미징을 입증.

작은 분자 CLT1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 MR 분자 영상

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

이 프로토콜의 목표는 양친매성 블록 공중합체로 구성된 미셀 약물 전달 시스템에서 물리적으로 갇힌 수용성이 낮은 약물의 준비 및 특성화를 설명하는 것입니다.

준비 및 개인의 특성과 다중 약물은 물리적으로 고분자 미셀을 포획로드

이 작품은 가역적 첨가 단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 메티오닌 기능화된 생체 적합성 블록 공중합체(mBG)의 제조를 제시한다. 얻어진 mBG및 이들의 형질감염 효율의 플라스미드 DNA 복합성도 조사되었다. RAFT 방법은 특수 작용기 포함 단량체를 중합하는 데 매우 유용합니다.

표적 플라스미드 DNA 전달을 위한 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

이 기사는 GC-MS에 의한 검출을 위해 글리칸을 구성 연결 특이적 단당류로 화학적으로 분해하여 분획되지 않은 생체 유체에서 글리칸의 통합 조성 프로파일을 분석하도록 설계된 새로운 상향식 글리코믹스 기술의 향상된 형태를 제시합니다. 잠재적인 응용 분야에는 암 및 기타 글리칸 정동 장애의 조기 발견이 포함됩니다.

글리 칸 노드 분석 : 글리코 믹스에 대한 상향식 접근

매우 안정적인 목재 섬유 기반 털이 많은 나노 입자와 기능성 셀룰로오스 기반 생체 고분자를 제조하기 위한 합성 계획이 자세히 설명되어 있습니다.

매우 안정, 기능 털이 나노 입자와 목재 섬유에서 생체 고분자 : 지속 가능한 나노 기술쪽으로

학습하세요 Polymalic acid 기반 나노 약물을 이용한 개인 맞춤형 암 치료법. Physarum polycephalum에서 생산한 PMLA로 Her2 양성 유방암을 표적 치료하는 이 방법은 효과적인 종양 억제를 보여줍니다.

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

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