여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

전체적인 목표는 특히 암과 같은 개인의 질병 유전적 특성에 기반하여 맞춤형 의약품을 합성하기 위한 범용 프로토콜이 가능한 나노 규모의 플랫폼을 구축하는 것입니다. 먼저 미생물 frum polycephalum으로부터 폴리 말산(poly malic acid)을 생산 및 정제합니다. 정제된 PMLA의 펜던트 카복실기(carboxylic groups)를 화학적으로 활성화합니다. 활성화된 그룹의 치환을 통해 작은 기능기들과 링커 MEA를 부착하고, 사용되지 않은 활성화 그룹은 가수분해를 통해 다시 카복실기로 되돌립니다.

다음으로, 스페이서, MEA 및 캡의 설프히드릴(sulf hydro) 그룹을 통해 항체와 안티센스 분자를 첨가합니다. PDP와의 반응 후 사용되지 않은 스페이서를 통해 리드의 조성과 기능을 테스트합니다. 나노 약물 결과는 공격적인 인간암을 보유한 생쥐와 같은 동물 모델로부터 얻습니다.

HER2 양성 유방암은 치료의 효능뿐만 아니라 치료 과정에서 원치 않는 부작용이 없는지 여부를 결정할 수 있습니다. 개환 중합과 같은 기존의 합성 방법보다 바이오 생산이 갖는 주요 장점은 바이오폴리머가 완전한 광학적 순도를 유지하며 부산물로 오염되지 않는다는 점입니다. 이러한 PolyPhen 나노 약물군은 특정 타겟팅을 기반으로 모든 세포 유형을 표적할 수 있으며 단백질 발현을 조절할 수 있습니다.

일반적으로 PHE 나노 약물을 이용한 암 치료는 일차성 뇌암과 유방암을 포함한 여러 동물 모델에서 매우 효율적입니다. 저희는 먼저 이 방법을 통해 교모세포종 특이적 라민의 이소형 합성을 차단한다는 아이디어를 얻었으며, 이후 HER2 및 삼중 음성 유방암 단백질을 표적화하고 억제하여 종양 성장을 방지함을 입증했습니다. 이 기술의 응용 범위는 광학 및 자기 공명 영상을 이용한 암 진단까지 확장됩니다.

폴리 나노 약물은 암 치료를 위한 약물 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 또한 감염성 질환, 통증 완화 및 신경계 질환과 같은 다른 병리적 상태에도 적용될 수 있습니다. 오거의 스파이럴로부터 시드 플라스모디움 배양물을 증식시킨 후, 100 milliliters의 기초 배양 배지에 접종하고 25 degrees Celsius에서 배양합니다.

차광 조건 하에서 정온 배양기를 사용하여 중력 충전된 microplasm modia를 제조합니다. 10L 바이오리액터 용기 내에서 포자 형성을 방지하기 위해, 8L의 기초 배지에 80g의 탄산칼슘을 용해한 후, 충전된 microplasm modia를 장착된 반응 용기로 옮기고 바이오공정 시간을 75시간으로 설정합니다. 이때 온도는 25°C, 여과 공기 유량은 10L/min, 세그먼트 교반기를 이용한 교반 속도는 150RPM으로 유지합니다.

배양액의 pH가 4.8이 되면, 배양을 중단하고 폴리말레산(poly maleic acid) 생산량을 측정합니다. 이제 배양액을 17 °C로 냉각하고 세포가 중력에 의해 가라앉도록 둔 다음, 반응기에서 배양 상층액을 제거합니다. pH를 7.5로 조절합니다.

이제 5 °C에서 20 mM tris hydrochloride pH 7.5로 평형화된 1.5 L DEAE cellulose 컬럼 하단부로 상층액을 펌핑합니다. 그런 다음 0.3 M sodium chloride가 포함된 세척 버퍼 3 컬럼 분량을 컬럼 하단에서 상단 방향으로 통과시킨 후, 0.7 M sodium chloride 조건에서 PMLA를 용출합니다. 용출된 PMLA 분획을 0.1 M calcium chloride로 조절하고 80% ice cold ethanol을 첨가하여 PMLA calcium을 침전시킵니다. 다음으로 Sephadex G 25와 물을 사용하여 PMLA calcium을 크기 배제 크로마토그래피로 분획합니다.

마지막으로 각 분획을 호박색 광컬럼(amber light column)에 통과시키고, 폴리말산(poly malic acid)이 포함된 유출액을 즉시 액체 질소로 급속 동결시킨 후 동결 건조하여 -20 °C에서 보관하십시오. PMLA의 카복실기를 활성화하려면, 1 mL의 무수 아세톤에 1 mmol의 PMLA-H 단위를 혼합하고, 2 mL의 디메틸포름아미드(dimethylformamide)에 각각 1 mmol의 hydroxy CIN aide와 cylo heyl carbo ide를 혼합한 후 20 °C에서 3시간 동안 교반하십시오. 그 다음, 1 mL의 DMF에 녹인 0.05 mmol의 methyl Pega mean을 첨가하고, 이어서 0.05 mmol의 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가하십시오.

그 후 0.4 millimoles의 leucine ethyl ester를 한 방울씩 첨가하고, 1시간 뒤 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)에서 음성 hyn 반응을 통해 반응 완료 여부를 확인합니다. 마찬가지로 0.1 millimoles의 two me capto, one ethylamine 및 0.5 millimoles의 TEA를 첨가합니다. 잔류하는 NHS ester는 phosphate buffered saline을 이용한 자발적 가수분해로 제거합니다.

PD 10 컬럼으로 탈염한 후 동결 건조하여 흰색 분말로 얻으며, 이 사전 접합물을 -20 °C에서 건조 상태로 보관하십시오. 다음으로, pH 5.5의 150 mM sodium chloride 및 100 mM sodium phosphate 4.5 mL에 항체 30 mg을 첨가합니다. 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride를 사용하여 이황화 결합을 환원시키고, PD 10 컬럼으로 정제합니다.

이제 IDE PEG IDE를 pH 6.3로 조절한 상기 버퍼 2 mL에 녹입니다. 환원된 항체를 첨가하고 20 °C에서 1시간 동안 교반합니다. 30 kDa 분획 한계의 AVEVA spin 20을 사용하여 2.5 mL로 농축한 후, cidex G 75로 정제합니다.

이제 SEC HPLC를 통해 생성물을 확인합니다. 280 nm에서 양을 측정하고, 다른 파장에서 불순물이 없는지도 확인하십시오. 다음으로, pH 6.3 완충액 5 mL에 프리 컨쥬게이트 50 mg과 항체 결합 PEG IDE 200 MLE를 혼합합니다.

sulf hydro의 농도를 2mM로 조절하고 20°C에서 3시간 동안 배양합니다. 98%의 수율을 얻으려면, 3' amino antisense oligonucleotide를 1부피의 SPDP와 반응시키고, 메탄올 내에서 Sephadex LH-20으로 AON-PDP를 정제한 다음, 메탄올을 증발시키고 생성물을 물에 녹여 동결건조하십시오. 이제 활성화된 AO 800nM을 MEA SH에 PEG가 사전 결합된 항체와 함께 밤새 배양합니다. 이황화 결합 교환 반응이 종료되면, PDP로 과량의 sulf hydro를 차단하여 형광 염료 블록을 통합하고 Sephadex G-75로 정제하십시오.

최종 폴리 말산 기반 나노 약물을 -20 °C에서 보관하십시오. 제조 과정 중 폴리 말산 함량을 측정하려면 다음과 같이 진행하십시오. 320 µL의 시료에 10% 하이드록실 암모늄 클로라이드 160 µL와 10% 수산화나트륨 160 µL를 첨가합니다. 10~15분 후, 5% 염화철 용액 160 µL와 혼합하고 540 nm에서 진한 보라색의 형성을 확인합니다. 다음으로, 밀봉된 앰플을 사용하여 2 M 염산 내에서 110 °C로 나노 약물을 하룻밤 동안 가수분해한 후, 역상 크로마토그래피로 말산을 분석하십시오.

말레산(maleic acid) 표준물질을 스파이킹한 샘플을 사용합니다. 이제 100 millimolar dithiothreitol로 나노 약물을 절단하고, morpho antisense oligonucleotides를 morpho a ON 표준물질과 비교하여 정량 역상 HPLC로 측정합니다. 절단된 나노 약물을 사용하여 단백질 분석 키트로 항체 함량을 측정함으로써 Malik PEG 함량을 정량화합니다.

먼저, 티오시안산 암모늄(ammonium OT thiocyanate)과 반응시킨 후, 클로로포름으로 추출하고 510 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 웰당 5 µL의 나노 약물과 플레이트에 코팅된 항원으로 웰당 0.5 µg의 her two를 사용하여 Eliza로 항체 활성 및 공동 결합(co ligation)을 테스트합니다. 마지막으로, 말레산(maleic acid)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), EG 및 항체의 달성 백분율을 계산합니다.

약물 설계 시 의도한 백분율과 비교하십시오. 나노 약물에 대한 이 이봉형(bimodal) 전략적 접근법은 HER2 신호 전달 경로를 억제하기 위해 Herceptin을 사용하고, HER2 수용체의 전사를 차단하기 위해 HER2 특이적 antisense oligonucleotide(aON)를 사용하며, 항체는 종양 혈관의 내피 TFR을 통한 트랜스사이토시스를 촉진합니다. 나노 접합체 플랫폼인 poly maleic acid는 배양된 micro plasmo에 의해 생성되고 정제되었으며, PMLA 카르복실기의 활성화는 프리컨쥬게이트 스캐폴드의 합성을 용이하게 했습니다.

마지막으로 리드 나노 접합체입니다. Eli SA 분석을 통해 나노 약물 합성 과정 전반에 걸쳐 활성 단클론 항체가 유지됨을 확인하였습니다. 두 항체가 동일한 폴리머 플랫폼에 조립된 상태에서, 형광 공초점 현미경을 사용하여 나노 약물의 세포 내 흡수를 추적하였습니다.

0시간과 3시간의 중첩 이미지를 표지된 엔도솜과 함께 분석하였습니다. 공국소화(colocalization)에 대한 Pearson 상관계수는 엔도솜에서 세포질로의 나노 약물 방출과, 세포질 내 글루타티온 의존적 이황화 결합 절단을 통한 나노 약물로부터의 ON 해리를 나타냅니다. In vitro 실험에서, 리드 나노 약물은 HER2 과발현 세포주에서 성장을 가장 효과적으로 유의미하게 억제하였습니다.

HER2를 과발현하는 인간 유방암 세포주 BT 474를 이식한 마우스 대상의 in vivo 실험 결과, Herceptin을 포함하는 선도 나노 약물에 의해 95% 이상의 성장 억제가 나타났습니다. 또한, HER2 특이적 항체를 이용한 ex vivo Western blotting 결과 HER2의 합성 및 인산화가 모두 억제되었음이 확인되었으며, PARP의 cleaved-K T 분절은 세포 사멸(apoptosis)이 일어났음을 나타냈습니다. 약물 처리에 따른 종양 퇴행은 조직학적 검사를 통한 종양 크기의 감소 및 종양 세포의 고갈로 입증되었습니다.

이제 여러분은 부작용 없이 효과적인 개인 맞춤형 치료를 구현하기 위해 생체 적합성 나노 플랫폼을 사용하는 방법과, 제어된 조성 및 검증된 기능적 활성을 갖춘 나노 약물을 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 일단 숙달되면, 이러한 센서는 개발 후 높은 재현성으로 수행될 수 있습니다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적 전달을 위해 폴리아크릴산 나노 플랫폼을 사용하는 이 기술은, 개인 맞춤형 유전자 분석을 통해 확인된 특정 종양 분자 표적을 겨냥한 종양 치료를 탐구하려는 개인 맞춤형 나노 의학 분야 연구자들에게 길을 열어줄 것입니다. 약리학적으로 활성 제제와 세포는 매우 위험할 수 있습니다.

본 절차를 수행하는 동안에는 항상 마스크와 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.