Name: 인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 배우세요 포스콜린으로 유도한 표피 멜라닌이 공정한 피부 마우스 모델에서 UV 손상으로부터 보호하는 방법을. 이 연구는 약리학적 피부 색소 침착이 자외선 저항성을 높이는 것을 보여줍니다.

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저자는 기술 지원을 Malinda 활발한를 감사드립니다. 우리는 또한 현재와 과거의 자금 출처를 인정 : 국립 암 연구소 (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), 웬디 윌 케이스 암 연구 기금, 마키 암 재단, 어린이의 기적 네트워크 및 제니퍼와 데이비드 디킨스 흑색 종 연구 재단.

1. 플렉 barbatus (Cohleus의 포스 콜리) 공장의 원유 뿌리 추출물의 국소 투여를위한 포스 콜린의 제조 <ol><li> 쥐 실험 프로토콜은 동물의 관리 및 사용에 윤리적 인 행위에 대한 지침을 다음과 켄터키 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (프로토콜 # 00768M2004)에 의해 승인되었다. 뿌리 추출물은 70 % 에탄올의 표준 피부과베이스, 30 % 프로필렌 글리콜 40 % 중량 / 부피로 이루어진다. </li><li> 원유 포르 스 콜린 뿌리 추출물 200 g의 무게와 비커로 전송. 40 % 500 ㎖를 (w / v) 용액을, 차량의 부피 전체 (70 % 에탄올, 30 % 프로필렌 글리콜)는 아니지만 대부분을 첨가하여 조질 포스 콜린 뿌리 추출물 200g을 재현 탁하고의 해결책을 가져다 약 450 ML. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 교반 하였다. 이 솔루션은 다소 점성이 될 것이며,하기 전에 솔루션에 &quot;리프트&quot;추출물을 수동으로 동요가 필요할 수 있습니다교반 막대가 인수 할 수있다. </li><li> 교반 시간 후, 눈금 실린더에 혼합물을 부어 (커에서 포르 스 콜린의 회복을 극대화하기 위해) 슬러리를 교반하는 데 사용 된 비커를 &quot;린스&quot;에 사용 된 차량을 이용하여 500 ml로 볼륨을 일정하게 . </li><li> 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브에 슬러리를 전송합니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 (1,500 XG, 실내 온도, 15 분). 이 시점에서, 불용성 물질은 상등액 쉽게 떨어져 부어 질 수 있도록 상당히 압축 될 것이다. </li><li> 추출물로부터 잔류 불용성 물질을 제거하기 위해 0.22 ㎛의 셀룰로오스 아세테이트 용액을 막을 통해 필터. 우리는 뿌리 추출물의 불용의 멤브레인의 조기 막힘을 방지하는 장치와 함께 사전 필터의 사용과 함께 세포 배양을 위해 디자인 된 병 톱 시스템을 사용합니다. 추출물의 대량을 할 때, 프리 필터 내기를 변경시 약 100 ㎖를 고를추가 된 각 볼륨과 사이. </li><li> 상온에서 보관하면, 추출물은 최대 1 년 동안 생물학적 활성을 유지합니다. </li></ol> 2. 국소 치료에 대한 C57BL / 6 K14-SCF 마우스의 준비 <ol><li> 전기 전단에 의해 동물로부터 등의 모피를 제거합니다. 간단히 0.25 mm 수술 준비 머리 (피셔 과학)에 장착 된 전기 가위 등의 모피의 전단을 용이하게하기 위해 흡입 이소 플루 란과 동물을 마취. 바람직하게 만 마취 과다 복용의 위험을 최소화하기 위해 마취의 한 종류 (예를 들면 케타민 / 자일 라진)를 사용합니다. 포화 흡입 챔버는 흄 후드 외부에서 사용할 때 직업적 위험을 실시하고 동물 마취제를 알 수없는 금액을 제공합니다. 이상적으로 정밀 기화기가 사용되어야한다. </li><li> 잔여 머리 수염을 제거 화학 탈모와 동물을 치료하는. 케타민 40 ㎎ / ㎏과 자일 라진 4 ㎎ / ㎏의 IP를 주입 동물을 마취 관리 </li&gt; <li> 동물을 적절하게 (발가락 핀치에 의해 판단으로) 마취되면, 장갑을 낀 손가락을 사용하여 전단 지느러미 피부에 제모 크림의 손가락 크기의 금액을 적용합니다. 30 ~ 60 초 또는 그 주변에 이동하는 등 머리가 명확 크림에서 볼 수있을 때까지 피부에 크림을 문질러. 장기간 노출은 표피의 무결성의 손실로 피부 표피의 고장과 죽음의 화학 물질 연소에 이르게으로 만 머리 제거에 필요한 최소한의 시간 동안 크림을 둡니다. </li><li> 모든 크림이 제거 될 때까지 반복적으로 물을 적신 거즈 패드 등의 피부를 닦아주십시오. 부드러운 종이 타월을 사용하고 따뜻한 한적한 위치 (예 : 깨끗한 케이지는 온난화 패드에 위치)에서 복구 할 수 드라이 동물. 하나씩 동물 털을 뽑다 및 절차 전반에 걸쳐 긴밀하게 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 포스 콜린 또는 차량 제어의 국소 투여 <ol><li> 동물은 한 번에 하나씩 처리한다. 간단히 흡입과 마취아래의 양식을 장착 나일론 공기 투과 필터의 상단에 마우스를 배치하여 D의 이소 플루 란은 흄 후드에서 이소 플루 란 포화 리드 형 투명 유리 항아리에 이소 플루 란 포화 종이 타월을 배치되었습니다. 자발적인 근육의 움직임을 억제 할 수 있지만, 자발적 호흡 (일반적으로 10 ~ 20 초)을 유지하기 충분한 시간 동안 이소 플루 란에 마우스를 노출합니다. 너무 오래 이소 플루 란에 동물을 방치하면 호흡 억제 및 사망을 초래할 것입니다. 그것은 &quot;빛을 것&quot;과 약물 및 위험 죽음에 동물을 노출 오버 더 이소 플루 란보다는 짧게 마우스를 다시 노출 할 필요의 측면에 잘못을하는 것이 좋습니다. </li><li> 이소 플루 란 챔버에서 동물을 제거하고 깨끗한 흡수 벤치 패드에 놓습니다. </li><li> 일회용 폴리 프로필렌 팁이 장착 1,000 μL의 마이크로 피펫, 40 % 원유 포르 스 콜린 추출물의 400 μl를 그려 사용 (차량 제어 동물은 70 % 에탄올, 단독 30 % 프로필렌 글리콜을 받게됩니다). </li><li> 에 추출물로 이동모든 피부가 덮여있다 때까지 피펫 팁의 측면을 사용하고 피부에 그것을 떨어지는 및하여 동물의 등쪽 피부를 통해 추출물을 얼룩. 도포 후 피부를 가릴 필요도 없다. </li><li> 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복 될 때까지주의 깊게 관찰한다. </li><li> 비 안료 캠프 효과는 UV 민감도 실험을 혼동하지 않도록하려면, 자외선 노출 (안료의 효과가 마지막으로 국소 치료를 넘어 몇 일 지속) 2 일 전에 모든 국소 치료를 중단. </li></ol> 4. 반사 비색법에 의해 색상 측정을 피부 <ol><li> 간단히 흡입 이소 플루 란 (위 참조)와 마우스를 마취. </li><li> 색채와 함께 제공되는 표준화 된 흰색 표면에 휴대용 머리를 배치하여 미놀타 색채를 보정합니다. </li><li> 보장 동물의 등 피부에 색채 플러시의 휴대용 측정 헤드를 배치하는 것이 1cm 2 라운드 aperturE는 완전히 피부에 가압된다. 등쪽 피부의 다른 영역에서 적어도 세 별도의 측정을 수행. </li><li> 동물 당과 치료 그룹별로 SD ± 평균 패 * 점수를 계산합니다. 사려 깊은 색채는 실험에서 어느 시점에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 5. &quot;최소 홍반 선량&quot;(MED)의 계산에 의해 UV 감도의 결정 <ol><li> 차량이나 상술 한 바와 같이 포르 스 콜린 하나가 미리 처리 된 동물을 사용합니다. 케타민과 자일 라진 (위 참조)의 표준 혼합물의 복강 내 주사로 동물을 마취. </li><li> MED 테스트를위한 UV-폐색 테이프의 조각을 준비한다. 테이프에 구멍을 생성하는 1 ㎠의 원형 컷 아웃이있는 대형 홀 펀치 (그림 2A와 B)를 사용하십시오. 테이프에 정의 된 크기와 대칭 배열의 구멍을 갖는 방사선 조사 후 피부 변화의 인식을 용이하게한다. 테이프의 각 구멍을 통해, 작지만 쉽게 분리 할 수​​있는 부분을 적용<html> 다른 UV 선량의 관리를 허용하도록 UV 노광 중에 정의 된 시간에 제거 될 수있는 테이프. </li><li> 동물이 충분히 진정되면, 등의 표면에 테이프를 넣습니다. 눈 윤활제는 항상 마취하에 사용되어야한다. </li><li> 두 웨스팅 F15T8UV-B로 구성된 UV 소스를 켜고는 313 nm의 피크 출력과 280-370 nm의 범위 램프. (일반적으로 따뜻하게 램프 몇 분 소요) UVB 센서 UV 광도계로 측정 한 램프가 일정한 UV 출력에 평형을 허용합니다. </li><li> UV 광도계에 의해 측정 한 UV 투과도에 기초하여, 원하는 각 투여 량에 대한 UV 노출 시간을 계산한다. 예를 들어, 우리의 램프의 UVB 출력 측정 2.4 mW의 / ㎠. 따라서, 5 kJ의 / m 2를 관리하는, 피부 아래 계산 한 UVB 방사선 (3 분 28 초 위치) 208 초에 노출 될 필요가있다 : upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> 심지어 UV 노출을 보장하기 위해 복부 아래 표면 마취 동물 (장소에 폐쇄 테이프로 각각) 놓습니다. UV 방사선의 선택 복용을 관리하려면, 순차적으로 방사선의 올바른 복용에 1cm에게 피부의 2 영역을 노출하는 구멍을 덮고있는 작은 폐색 테이프를 제거합니다. 40 kJ의 / m 2 실험에서 최대 투여 량 인 경우, 따라서, 위의 예를 사용하여, 다음 동물 제공된 것 40 kJ의 / m이 상태에서 27 분 및 47 초 다운로드 및 피부 램프 하에서 것 테이프에게 전체 시간을 덮는. 노광에 남아 208 초있을 때 그러나 kJ의 5 / m 2 조건을 덮는 테이프가 제거 될 것이다. 각각의 조건이 동시에 종료되도록 테이프 제거의 타이밍 수행해야합니다. </li><li> UV 노출 후, 갑작 스럽거나 지나치게 강력한 움직임으로 피부를 벗겨 않도록주의하면서 조심스럽게 등의 피부에서 테이프를 벗겨. 수 있도록 따뜻한 조용한 장소에서 동물을 배치마취에서 회복. </li><li> 홍반 (적색) 또는 부종의 은밀한 부분을 찾기 위해 48 시간 동안 마우스를 모니터 (붓기) UV 조사의 특정 용량에 노출 된 해부학 적 위치에 해당. 사진으로 피부 결과를 문서화합니다. </li><li> MED 값 홍반 및 / 또는 피부의 전체 노광 원의 부종에 의해 정의 된 염증을 일으키는 UV의 최소량에 대응한다. 피부의 색소 침착하지만, 홍반 및 부종이 여전히 일반적으로 정확하게, 부분 UV 노출시 테이프에 구멍의 정의 모양 덕분에 평가 될 수있다, MED의 결정에 도전 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 통계 분석 Bonferroni 사후 테스트 (그래프 패드 PRISM). P 값 &lt;0.05를 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다으로 한 일원 분산 분석에 의해 생쥐의 동료 사이에서 데이터를 분석 할 수 있습니다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

공정 피부 인간의 동물 모델을 사용하여, 우리는 포르 스 콜린이 풍부한 원유 뿌리 추출물의 국소 응용 프로그램이 견고하게 피부에있는 멜라닌 생성을 자극하여 표피를 어둡게 것을 찾을 수 있습니다. 표피 melanization는 사람의 피부에서 발생로, 기초의 표피 줄기 세포 인자의 발현에 의존하지만 유전자 변형되지 않은 마우스의 피부에. 유전자 변형되지 않은 마우스의 등쪽 피부는 피부에 색소를 부여하기 in​​terfollicular 멜라노 충분한 수 없다. 그러한 줄기 세포 인자 (키트 리간드) 또는 간세포 성장 인자 (HGF) 등의 멜라닌 세포 성장 인자의 구성 적 발현의 설정에서 멜라닌 세포가 동물 50-51의 일생 표피의 기저층에 유지 될 수있다. 공정 피부 인간의 우리의 동물 모델은 C57BL / 6 쥐 라인의 확장 색소 변형에 K14-SCF의 유전자의 결합을 기반으로합니다. 모든 연령의 동물이 될 수 있지만사용, 우리의 실험은 일반적으로 젊은 성인 (나이 4-12 개...

흑색 종의 발병률은 피부암의 가장 치명적인 형태는, 특히 공정한 피부 사람들 사이에서, 미국에서 지난 몇 년 동안 극적으로 증가했다. 강한 분자 역학적 증거는 주요 원인이되는 환경 요인 2-5로 UV 방사선을 연루. 태양에 노출 선탠 침대 사용의 형태로 증가 UV 노출은 흑색 종 발생률 6-7의 증가의 대부분에 대한 책임을 져야 할 것입니다. 흑색 종의 위험이 특히 볕 8, 생활 9-10 초기 특히와 연결 보인다. 햇볕의 위험은 복용량 및 자외선 노출의 강도뿐만 아니라 자외선에 피부 반응에 영향을 미치는 유전 요인에 의해뿐만 아니라 연결되어 있습니다. 피부 착색은 UV 감도의 가장 중요한 결정 요소 중 하나, 썬탠 및 암 위험의 위험이다. 흑색 종은 어두운 피부 individua에에 비해 빛 피부 사람의 약 20 배 더 자주 발생11-13 LS. 멜라닌, 표피 멜라닌 세포에 의해 생성 된 안료는 피부 안색의 주요 결정 인자이다. (1) 유 멜라닌, UV 방사선의 에너지를 흡수에 효과적 어두운 블랙 / 브라운 안료, (2) 페오 멜라닌, 피부에 자외선 광자의 침투를 방지하는 정도 효과 붉은 / 금발의 안료 : 멜라닌은 두 가지 종류로 제공됩니다. 피부 색깔, UV 감도와 흑색 종의 위험은 크게 표피의 멜라닌 함유량 14 ~ 15에 의해 결정됩니다. 표피에서 더 유 멜라닌은 적은 UV 광자는 피부 속으로 침투 할 수있다. 때문에 유 멜라닌의 낮은 타고난 수준의 공정 피부 개인은 더 많은 경향이 UV 방사선 16-18의 급성 및 만성 효과에 있습니다. 피부 색소 침착, 흑색 종의 위험을 &quot;황갈색&quot;UV 노출 후 모두가 멜라노 1 수용체 (MC1R)의 신호 전달 능력과 상관 관계, G의 결합 일곱 횡단의 능력멜라닌 세포 19 ~ 22에 urface 수용체. MC1R는 동족의 높은 친 화성 리간드, α-멜라닌 세포 자극 호르몬 (α-MSH)를 결합하는 경우, 두 번째 메신저 캠프 (23)의 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 생산의 활성화가있다. 자외선 노출 후 피부의 정상적인 생리적 반응은 각질 세포 24-29으로 α-MSH의 표피 생산을 포함한다. 우리와 다른 사람들은 각질 세포 유래 α-MSH는 아데 닐 레이트 사이 클라 제 30의 활성화를 통해 캠프 두 번째 메신저의 다운 스트림 생산을 시작, 표피의 멜라닌 세포에 MC1R에 결합 가설. 캠프 수준은 생존 경로, DNA 수리 및 색소 합성 등의 멜라닌 세포의 분화의 여러 측면을 제어 할 수 있습니다. MC1R 신호 및 캠프 명확 안료 효소 수준과 유 멜라닌 생산을 유도한다. MC1R 신호는 그대로이며, 멜라닌 캠프의 수준이 강력한 경우, 유 멜라닌이 생성되어 피부가 어둡게된다. 그러나, MC1R 신호에 결함이있는 경우세포질 캠프 수준이 낮게 유지, 페오 멜라닌 대신 1 생성된다. 유 멜라닌 합성 캠프 수준에게 1,14,31-35 인상 에이전트가 약리학 적으로 자극 할 수있다. MC1R 단백질은 인간 36-46에서 흑색 종 위험의 주요 조절하기 때문에, 우리는 MC1R 자외선에 의한 발암에 대한 멜라닌 세포를 보호하는 메커니즘에 관심이 있습니다. 우리의 연구를위한 기초로, 우리는 순수한 C57BL / 6 유전 적 배경 (1)에 유전자 변형 MC1R 변종 쥐 모델을 생성합니다. 이 모델에서, 구조적 기저 표피에서 발현되며 상피 interfollicular 멜라닌 세포가 모낭에서 진피 지역화 멜라노되는 비 - 형질 전환 마우스는 대조적으로, 생활 (47)에 걸쳐 피부에 유지되는 세포 인자 (SCF)를 줄기. K14-SCF의 유전자가 혼입으로, 표피는 안료의 특정 멜라닌 색소로 착색되어 특성동물 (1)의 변형. 야생형 MC1R 신호와 C57BL / 6 유전 적 배경에 K14-SCF 마우스는 제트 검은 피부는 멜라닌 색소의 매우 높은 수준을 특징으로했다. 아니나 다를까,이 동물은 높은 UV 저항이다. 대조적으로, 돌연변이 비활성 MC1R 항구 유 전적으로 일치 K14-SCF C57BL / 6 동물 표피에 거의 유 멜라닌이 없습니다. 대신 이러한 &quot;확장자&quot;동물 (MC1R의 E / E)는 페오 멜라닌 색소 (그림 1A)의 침착에 의한 고운 피부 안색을 가지고 더 많은 자외선에 민감한 48 ~ 49이다. 피부에 침투를 허용 화학적 특성을 가진 약물 화합물은 강력하게 직접적으로 피부 표피의 멜라닌 세포에서 cAMP의 수준을 조작하여 확장 (MC1R의 E / E) K14-SCF의 동물 모델에서 유 멜라닌을 유발하는 것으로 나타났다. 이 모델의 멜라닌 상향 조절은 R되었습니다아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화 1 등 포스 포 디에스 테라 제 4 억제 (35)에 의해 eported. 이 문서에서는, 우리는 확장 (MC1R의 E / E) K14-SCF 동물 모델 공정 피부 자외선에 민감한 사람의 준비와 포스 콜린의 국소 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 약의 매일 두 번 응용 프로그램, 가속 melanization을 촉진하는 피부 어둡게하는 멜라닌 색소의 표피 증착에 의한 것입니다 및 그 유도 표피 멜라닌은 &quot;최소 홍반 량&quot;(MED) (48)의 측정을 통해 UV에 의한 자외선으로부터 보호 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli 추출물 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>해당 없음</td><td>프린스턴, 뉴저지</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurane, USP</td><td>버틀러 Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>더블린, 오하이오, 미국</td></tr><tr><td>자일라진</td><td>Anased 주사</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, 아이오와, 미국</td></tr><tr><td>케타민 HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>세인트 조셉, 미주리, 미국</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, USA</td></tr><tr><td>탈모 크림, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan = "4 ">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Germicidal Hg 램프 UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>복사계 광도계</td><td>국제 광</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA,USA</td></tr><tr><td>크로마미터</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>크로마미터 CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td>용 데이터 프로세서</tr></tbody></table>

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

피부, UV 감도 및 피부 암 위험의 공정성 모두 멜라노 1 수용체의 생리 학적 기능, 멜라닌 세포의 표면에서 발견 G의 결합 된 신호 전달 단백질과 연관. MC1R 차례로, 피부에 멜라닌의 멜라닌 생산을 상향 조절, 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 캠프의 생산을 자극한다. MC1R 시그널링 UV 손상에 대하여 피부를 보호하는 메커니즘을 연구하기 위하여, 본 연구는 줄기 세포 인자 (SCF)의 표피 식에 근거 &quot;인간화 피부&quot;와 마우스 모델에 의존한다. K14-SCF 형질 전환 생쥐에서 멜라노 유지 따라서 표피는 표피 멜라닌을 증착 할 수있는 능력이있다. 이 동물 모델에서 검은 멜라닌 색소와 UV 보호 된 표현형의 강력한 증착 야생형 MC1R 상태의 결과. 반면, 결함 MC1R 신호 능력 전시 금발 / 레드 색소 침착, 피부에 약간의 유 멜라닌과 함께 K14-SCF 동물자외선에 민감한 표현형. 이 유 멜라닌 침착을 추론하는 것은 MC1R 신호를 모방 국소 요원에 의해 향상 될 수 있습니다, 우리는 MC1R 불량 공정한 피부 생쥐의 피부에 포르 스 콜린 추출물 직접 응용 프로그램이 강력한 멜라닌 유도 및 UV 보호 한 결과 나타났습니다. 여기에 우리가 준비하고 K14-SCF 공정 피부 마우스에 포르 스 콜린 함유 천연 뿌리 추출물을 적용하고 최소 홍반 량 (MED)를 결정하여 UV 감도를 측정하는 방법을보고하는 방법을 설명합니다. 이 동물 모델을 사용하면, 피부의 표피 캠프 유도 melanization은 UV 노광에 생리적 반응에 미치는 영향을 연구 할 수있다.

C57BL / 6 마우스 설명 (그림 1A)으로 K14-SCF의 유전자를 도입, eumelanotic pheomelanotic 또는 무색소 배경에 생성 된. 공정한 피부 확장 코호트 (MC1R의 E / E는 티르 + / +) 마우스는 자동차 (70 % 에탄올, 30 % 프로필렌 글리콜) 또는 40 % 원유 콜레 우스 포스 콜리 뿌리 추출물 (80 μM 당 하나의 하루에 두 번 복용으로 국소 치료를 받았다 오일 (그림 2B)를위한) 복용량. 표피의 색소 침착에 대한 국소 치료의 효과는 육안 검사 및 반사 비색 (그림 1B)에 의해 모두 결정되었다. 뿌리 추출물의 응용 프로그램은 K14-SCF 형질 전환 배경 그러나 유 전적으로 일치 비 형질 전환 동물에서의 강력한 표피 어두워과 관련되었다. 우리는 약리학 적으로 유도 된 멜라닌 epide...

표피의 멜라닌은 공정한 피부가 자외선에 민감한 인간의 쥐 모델 포스 콜린의 국소 응용 프로그램에 의해 유도된다. 최소 홍반 량 (MED) 분석에 의해 측정 된 강력한 UV-매개 성 염증 (자외선)으로부터 보호 어둡게 피부 표피에있는 캠프 수준의 약리학적인 조작.

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

다음 실험의 전반적인 목표는 네 가지 피부 처리제를 전처리한 밝은 피부 쥐에서 최소 홍반량을 측정하여 UV 민감도를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 털 깎기와 제모를 통해 조사 대상인 쥐의 등 피부를 준비합니다. 그다음, 등 피부에 포스콜린을 국소 도포합니다.그다음, UV 조사에 의한 염증에 4-mediate melon의 효과를 결정하기 위해 마우스에 서로 다른 용량의 UV 조사를 실시합니다. 그 결과, 국소적으로 도포한 forline이 피부 색소 침착을 강력하게 증가시키며, 약리학적으로 me가 강화된 동물은 MED로 측정했을 때 UV에 내성이 있다는 결과가 얻어집니다. 이는 melanocortin one receptor 또는 MC one R이라 불리는 매우 중요한 멜라닌 세포 유전자의 결함으로 인해 태닝이 불가능한 개체에서도 약리학적으로 태닝을 유도하는 것이 가능하다는 것을 보여주는 개념 증명 연구입니다. 인간 집단의 경우, mc one R의 기능 상실은 UV 민감성, 햇빛 화상 경향 및 태닝 불능과 상관관계가 있으며, 이후 생애 동안 흑색종 발생 위험이 최대 4배까지 증가하는 것과 상관관계가 있습니다.우리는 이러한 연구를 위한 약물로 scullin 4를 선택했는데, 이는 결함이 있는 melanocortin 수용체 신호 전달 경로를 우회하여 멜라닌 세포가 정상적인 mc1R 신호 전달 경로를 가지고 있다고 인식하게 함으로써 많은 양의 멜라닌을 생성하게 하며, 생성된 멜라닌이 피부에 침착되어 동물을 UV 방사선으로부터 보호할 수 있기 때문입니다. 우리는 이 방법이 피부 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 점을 알고 있으며, 이는 암 예방에도 중요할 수 있습니다.UV 복사가 대다수 피부암의 주요 발암물질이며, 피부 보호 조치의 실행을 강화하면 UV 손상을 방지할 수 있다는 점을 알고 있습니다. 복강 내 주사를 수행할 때, 바늘을 찌른 후 내용을 주입하기 전에 반드시 흡인하여 바늘이 혈관, 장 또는 방광을 관통하지 않았는지 확인하십시오. 복강 내 주사는 비장을 피해 우측에 투여해야 합니다. 포린 추출물을 준비하고 이소플루란으로 마우스를 짧게 마취시킨 후 진행하십시오.텍스트 프로토콜에 따라, 케타민과 자일라진을 IP 주사하여 동물에게 추가 마취를 실시합니다. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 진정 상태를 확인합니다. 0.25 millimeter 수술 준비용 헤드가 장착된 전기 바리캉을 사용하여 등 쪽의 털을 깎습니다.제모 크림을 사용하여 잔털을 제거합니다. 그런 다음 피부 화상이나 손상을 방지하기 위해, 크림이 모두 제거될 때까지 물에 적신 거즈 패드로 등 쪽 피부를 부드럽게 닦아냅니다. 부드러운 종이 타월로 동물을 건조시킨 후, 회복을 위해 가온 패드가 설치된 깨끗한 케이지에 넣습니다.일반적으로, 흄 후드 내에서 이소플루레인(isof fluorine) 흡입 마취를 통해 포스콜린(forskolin) 또는 대조 용액의 국소 투여를 용이하게 하기 위해 마우스를 짧게 마취해야 합니다. 이소플루레인이 적셔진 종이 타월을 넣은 이소플루레인 포화 뚜껑 있는 투명 유리병으로 시작합니다. 형태에 맞게 제작된 나일론 공기 투과성 필터를 부착한 후, 진정된 동물을 깨끗한 흡수성 벤치 패드 위에 두고, 자발적인 근육 움직임이 억제될 때까지만 마우스를 필터 위에 올려놓아 마취시킵니다.발가락 꼬집기 전이를 수행한 후, 400 µL의 조 정제 포라인 추출물을 동물의 등 피부에 떨어뜨려 도포합니다. 그런 다음 팁의 측면을 사용하여 노출된 등 피부 전체 표면에 추출물을 문질러 펴 바릅니다. 마우스가 마취에서 회복될 때까지 주의 깊게 관찰하여 비색소 침착을 방지한 후 케이지로 돌려보냅니다.교란 요인인 UV 민감도 실험으로 인한 Cyclic A MP 영향. 반사 색도 측정을 수행하기 위해 UV 노출 2일 전부터 모든 국소 치료를 중단하십시오. 이소플루레인 흡입으로 마우스를 짧게 마취시킨 후.장치와 함께 제공된 표준 백색 표면에 휴대용 헤드를 놓아 색채계를 교정합니다. 휴대용 측정 헤드를 동물의 등 쪽 피부에 밀착시키고, 1 cm² 크기의 원형 개구부가 피부에 완전히 눌리도록 합니다. 등 쪽 피부의 서로 다른 부위에서 최소 3회 이상 개별 측정을 수행합니다.동물 및 처리 그룹별로 평균 L 점수와 표준 편차를 계산하십시오. 최소 홍반량(MED)을 결정하기 위해, 각 동물에 다양한 UV 선량을 조사합니다. 먼저, 1cm² 크기의 원형 펀치 홀이 있는 고성능 펀치를 사용하여 UV 차단 테이프의 각 구멍 위에 구멍을 뚫어 테이프 조각을 준비하십시오.테이프를 사용합니다. 쉽게 떼어낼 수 있는 작은 조각의 테이프를 부착하십시오. UV 조사를 위해, 마취된 마우스의 등 쪽에 테이프를 붙입니다.동물의 눈이 떠져 있는 경우, 건조 및 UV 노출로 인한 손상을 방지하기 위해 인공눈물을 도포합니다. 피크 출력 313 nanometers, 범위 280 to 370 nanometers의 UVB 램프 두 개로 구성된 UV 광원을 켭니다. 어린 양이 일정한 UV 출력에 적응하도록 둔 후, UVB 센서가 장착된 UV 광도계를 사용하여 출력을 확인합니다. UV 광도계로 측정한 UV 투과율을 기반으로, 원하는 각 선량에 대한 UV 노출 시간을 계산합니다.예를 들어, 램프의 UVB 출력이 2.4 milliwatts per square centimeter로 측정되었다고 가정합니다. 따라서 5 kilojoules per square meter를 조사하려면, 여기서 계산한 바와 같이 피부를 208초 동안 UVB 방사선에 노출시켜야 합니다. 다음으로, 진정된 동물의 복부가 아래를 향하게 놓아 UV가 균일하게 노출되도록 함으로써, 선택한 방사선 용량을 순차적으로 조사합니다.적절한 시점에 구멍을 덮고 있는 작은 테이프 조각들을 제거하십시오. 예를 들어, 40 kJ/m²가 최대 선량인 경우, 마우스는 램프 아래에 27분 47초 동안 머물게 되며, 이 선량에 해당하는 구멍은 시작부터 노출됩니다. 반면, 5 kJ/m² 조건의 경우, 208초 동안 노출된 시점에서 테이프를 제거해야 합니다.UV 노출 후 남은 시간 동안 테이프를 조심스럽게 제거하고, 동물들을 따뜻하고 조용한 곳에 두어 마취에서 회복시킨 후 케이지로 돌려보냅니다. 최소 홍반량 또는 MED 값은 노출된 피부 원형 전체에 홍반 및/또는 부종으로 정의되는 염증을 유발하는 최소 UV 용량에 해당합니다. 24~48시간 동안 마우스를 관찰하여 UV 노출 부위에 뚜렷한 홍반 또는 부종 영역이 나타나는지 확인합니다.때로는 잔존하는 첫 번째 털이 피부 홍반이나 부종을 가려 MED 테스트의 해석을 방해할 수 있는데, 70% ethanol로 피부를 적시면 피부 상태를 훨씬 더 명확하게 판독할 수 있습니다. 모든 피부 소견을 사진으로 기록한 후 마우스를 동물 시설로 돌려보냅니다. 본 실험에서는 K 14 줄기세포 인자 트랜스진이 도입된 anodic, anodic 또는 anodic 배경의 C 56 black six 마우스를 제작하였으며, 이를 통해 마우스가 표피에 멜라닌 세포를 유지하고 결과적으로 멜라닌을 침착시킬 수 있도록 하였습니다.여기에 표시된 표피에서, fair skin extension 마우스 집단에 vehicle 또는 40% crude colus fors coly 뿌리 추출물을 5일 동안 하루 두 번 국소 투여하였습니다. 국소 치료가 표피 색소 침착에 미치는 영향은 육안 검사와 반사 색상 이미지 분석을 통해 결정되었습니다. 뿌리 추출물의 도포는 K 14 SCF 형질전환 배경에서 강력한 표피 흑화와 관련이 있었으나, 유전적으로 일치하는 비형질전환 동물에서는 나타나지 않았으며, 이는 약물로 유도된 멜라닌이 침착되기 위해서는 모낭 간 표피 멜라닌 세포가 존재해야 함을 시사합니다.표피에서, 4-galin 외에 식물 파이토케미컬이 존재하여 뿌리 추출물이 짙은 색을 띠고 있음에도 불구하고, 피부 착색이 단순히 약물에 의한 염색 효과만으로 발생한 것은 아닙니다. 본 실험에서 입증된 바와 같이, 비형질전환 동물에 뿌리 추출물을 1일 2회 국소 도포했을 때는 피부 착색이 나타나지 않은 반면, forskolin의 멜라닌 효과는 단 이틀 만에 관찰되었습니다. 이 그림의 font mason 및 등쪽 피부 절편의 멜라닌 염색에서 알 수 있듯이, 최대 착색은 그 후 며칠이 더 지난 뒤에 뚜렷하게 나타났습니다.멜라닌 생성 정도는 용량 의존적이었습니다. 15일 동안 하루에 한 번 또는 5일 동안 하루에 두 번 four skin을 처리한 동물들은 유사한 수준의 피부 착색을 보였습니다. 또한, 두 처리군 모두에서 four skin 노출로 인한 뚜렷한 독성 효과는 나타나지 않았습니다. 따라서, 5일간의 가속 처리 방식이 표준적인 1일 1회 처리 방식만큼 효과적으로 등 쪽 피부의 안전한 mein을 촉진한다는 결론을 내렸습니다.이 그림은 MED 테스트 측정 결과, 4-gallin으로 유도된 표피-mein이 강력한 UV 보호 효과를 나타냈음을 보여줍니다. 반면, vehicle을 5일 동안 하루 두 번 처리한 K 14 SCF extension 마우스의 평균 MED는 5.0 ± 0.0 kJ/m²였습니다. 국소적으로 4-gallin을 처리한 코호트의 평균 MED는 30.0 ± 0.0 kJ/m²보다 높았습니다. 실제로 30.0 kJ/m²의 용량으로는 홍반을 유발하기에 불충분했습니다. 표준 4-gallin 용량을 사용한 이 실험에서, 처리된 K 14 SCF extension 마우스의 평균 MED는 50.0 ± 7.1 kJ/m²였습니다.중요한 점은, K 14 SCF 매개 표피 멜라닌 세포의 결핍 또는 티로시나아제 결핍으로 인해 멜라닌 생성이 불가능한 동물의 경우 forline 전처리가 MED에 영향을 미치지 않았다는 것입니다. forline 도포는 UV 노출 2일 전에 중단되었으며 UV 노출 후에도 계속되지 않았으므로, 비색소성 CAMP 효과가 MED 결과에 영향을 미치지 않았다고 결론지었습니다. 오히려 데이터는 표피 멜라닌이 이 모델에서 forline이 UV 보호를 유도하는 기전이었음을 시사합니다.이 기술을 숙달하면 피부 색소 침착 반응과 자외선 민감도를 쉽고 재현성 있게 평가할 수 있습니다. 동물 모델에 적용할 경우, 포랜드(forland) 처리는 하루에 단 몇 분밖에 걸리지 않으며, 실험 시간의 대부분은 실제로 UV 조사와 MED 테스트에 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때는 피부가 점진적으로 원래의 밝은 피부색 상태로 돌아온다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.멜라닌 유도는 피부가 자극을 받는 동안에는 어둡게 유지되지만, 자극이 제거되면 이후 몇 주에 걸쳐 태닝된 피부가 서서히 원래 상태로 돌아온다는 점에서 태닝 반응과 매우 유사합니다.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

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