Name: 유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: 학습하세요 유기 용매 없이 트리클로산이 RBL-2H3 비만 세포 탈과립을 억제하는 형광 마이크로플레이트 분석법을 통해 화학 물질의 면역 독성 효과를 평가하는 방법을.

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LMW 및 RHK는 생명 과학 및 엔지니어링 (GSBSE)의 UMaine의 대학원에 의해 지원됩니다 RHK는 메인 농업 및 산림 실험 역에 의해 지원되었다. 추가 자금은 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIH P20-GM103423), 메인 농업 및 산림 시험장 (허가 번호 ME08004-10, JAG), 타이드 센터 (NSF 그랜트 # 1,008,498)를 상승 메인 ADVANCE의 대학에 의해 제공되었다 및 PhRMA 재단 (JAG)에서 약리학 / 독성학의 연구 스타터 부여합니다. 우리는 Drs에 감사드립니다. 항원 세포 데이비드 Holowka와 바바라 베어드. 우리는 히나 Hashmi, 알레한드로 벨 레즈, 장비 및 명령에 대한 도움말 앤드류 Abovian에 감사합니다. 이 메인 농업 및 산림 시험장 간행물 번호 3311입니다.

우리는 공개 아무것도 없어.

2004 년,이 NaAl 등. 1 탈과립의 높은 처리량 테스트를 위해 비만 세포 바이오 센서를 개발했다. 그것은 우리가 우리의 TCS 연구에 대한 적응이 비디오에 설명 한 강력한 분석이다. 이전이 NaAl 등에 1. 분석은 비만 세포의 탈과립은 정기적으로 β-헥 소사 미나 59-61 통해 평가하지만, 이러한 초기의 방법은 하나의 샘플을 한 번 읽은하는 형광 분석기를 이용하고 있었다. 중요한 것은,이 NaAl 하였다. 자신의 마이크로 플레이트 리더를 활용하여 더 높은 처리량 방법 및 샘플 형광에 한 번에 하나를 읽은하는 이전 방법과 설정 직접적인 일치. 요컨대,이 NaAl 등 1. 크게뿐만 아니라 워크 플로에 ​​몇 가지 변화를 통합하여, 높은 처리량 마이크로 플랫폼에 적응하여 속도, 전력, 단순 및 분석의 신뢰성을 향상 시켰습니다. 여기에, 우리는 또한 특히, 여기에 다양한 테스트 화학 물질의 연구에이 분석...

비만 세포는 높은 천식의 주요 매개체 역할을 면역 효과기 세포, 알레르기, 기생충 방어 및 발암 13-16 알갱이 있습니다. degranulate을 활성화 때까지 안전하게 세포질 과립에 알레르기와 염증 매개을 저장할 위치를 그들은 거의 모든 혈관 조직 15에 있습니다. 탈과립은 히스타민, tryptase 및 류코트리엔 15와 같은 약리학 적 활성 중재자의 릴리스에서 결과 막 바인딩 된 과립의 exocytosis에 있습니다. 유형의 시작이 처리 결과 I 기생충에 대한 방어를 장착뿐만 아니라 알레르기 천식 및 발암 응답하기 15 시작의 중요한 과민 반응. 비만 세포와 호염기구는 FcεRI 수용체 면역 글로불린 E (IgE에) 17의 높은 친화력 수용체를 표현한다. 알레르겐 또는 항원에 노출 여러 IgE에 결합 FcεRI 수용체 17의 집계를 발생하고,이 s의티로신 인산화 이벤트, 내부 상점에서 포스 C, 칼슘 유출의 활성화 및 세포 18에 칼슘의 유입의 폭포 : 탈과립 프로세스를 시작 IgE에 결합 구단 수용체의 &quot;가교&quot;오 -라고. 이 칼슘 유입 탈과립을 위해 필요하며, 더욱, 과립 exocytosis에 15을 초래하기 전에 막으로 과립 융합을 알립니다. 실험적으로, 칼슘 이온 운반체 상류되거나 하류로 독성 물질에 의해 경로 대상의 식별을 허용, 직접 기본적으로 모든 신호 전달은 칼슘 유입 20 단계 이전 단계를 거치지 세포막을 19 일에 걸쳐 셔틀 버스 칼슘을 사용할 수 있습니다 칼슘은 20 신호. 탈과립은 히스타민 6 함께 과립에서 선형 적으로 해제 세포의 상층 액을,에 β-헥 소사 미나의 방출을 모니터링하여 신속하고 효율적으로 측정 할 수 있지만 난의 훨씬 쉽게 분석 형광 제품에 대한 간단한 효소 기질 반응 및 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 감지합니다. 같은 프로토콜 절에 자세히 설명이 마이크로 분석은에 의해 β-형광 기판의 절단 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide을 정량화 원래이 NaAl 등에 의해 개발. 강력한 방법 1을 기반으로합니다 헥 소사 미나. 트리클로산은 여기에서 강조와 함께 우리는 약물과 독성 물질의 테스트 효과 분석을 수정했습니다. 이 방법은 신뢰성 탈과립을 정량화 예를 들어, 유세포 기반의 탐지 방법 21에 저렴한 대안입니다, 안티 - 알레르기 약물의 다양한 높은 처리량 검사에 잘 자신을 빌려 잠재력을 가지고뿐만 아니라, immunotoxic 또는 극성 물질. 이 마지막 점은 21 세기 2007 년 국립 연구위원회 보고서 &quot;독성 시험에 비추어 특히 중요하다 : 비전과 스트랫EGY &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> 는 마우스와 같은 전통적인 실험 동물의 비용 사용을 줄이기 위해 세포 배양을 활용 높은 처리량 독성 시험의 개발을지지한다). 이 NaAl 등 1.가 개발하고 우리 2로 수정 탈과립 프로토콜은, 상동 인간의 점막 비만 세포 나 호염기구에 3-5 잘 받아 들여진 모델 RBL-2H3 세포 라인을 사용합니다. (배양 RBL-2H3 세포에 대한 방법은 허친슨 등에 자세히 설명되어 있습니다. 22). 이 분석 가능성이 장착 된 비만 세포 유형에 적용 할 수 있습니다. 트리클로산 (TCS)는 병원, 개인 배려 제품, 소비자 제품 23,24에서 30 년 이상 사용되어왔다 광범위한 스펙트럼 항균이다. TCS의 항균 특성에 대한 행동의 모드는 억제 enoyl-아실 의한 것으로, 지방산 생합성의 억제입니다운반 단백질 환원 25,26. 이 같은 샤워 젤, 핸드 로션, 치약, 양치질, 0.3 % 또는 10 mM의 최대 24 농도에서 손을 비누와 같이 가전 제품의 넓은 범위에서 세계적으로 발견된다. TCS의 대폭적인 사용은 인간 27-29의 강과 하천 (30)에 검출 수준 귀착되었다. Allmyr 등에 의해 수행 연구. 27 TCS와 그 대사 산물이 혈장과 모유로 기르는 어머니의 우유 모두에 존재하는 것을 보여 주었다. 중요한 것은, TCS는 쉽게 피부에 31-37로 흡수된다. Queckenberg 등. 37 비만 세포가있는 피부에 상당한 농도의 결과, 12 시간 이내에 인간의 피부에 ~ 70 밀리미터 TCS 크림 ~ 10 %의 흡수를 발견했다. TCS는 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11을 관리하기 위해 임상 적으로 표시되었지만, TCS는 알레르기 성 피부 질환을 완화하는 메커니즘은 38 알 수있다. 형광 마이크로 플레이트 분석 detaile를 사용하여D는이 비디오에서 우리는 최근에 2 μM의 낮은 농도 TCS는 크게 이러한 임상 데이터 2에 대한 잠재적 인 설명을 제공하는 비만 세포 기능과 탈과립을 꺾는 것을 보여 주었다. 이러한 임상 데이터에 대한 설명을 제공 할뿐만 아니라, 파머 등 우리의 연구 결과는. 2 TCS 칼슘 유입의 하류 신호 분자 표적으로하는 것이 좋습니다. 많은 면역 및 기타 생물 학적 과정에 신호 칼슘의 중요성으로 인해, TCS는 잠재적으로 필요한 생물 학적 과정의 다양한에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, Udoji 등. 39 TCS는 또 다른 중요한 타고난 면역 기능, 인간의 자연 살해 세포의 세포 용해 활성을 억제 것으로 나타났다. 알레르기 성 피부 질환 (또는, 반대로, immunotoxicant 등)의 치료 원조로의 잠재력을 넘어, TCS는 장애 물질 40-49 내분비 할 수 있습니다. 따라서, 용액이 화학 물질을 준비하는 방법에 대한 명확한 절차 I독성 학자의 관심의. TCS는 작은 소수성 분자이기 때문에, 유기 차량은 종종 물에 용해성하기 위해 사용됩니다. TCS가 테스트되었습니다 가장 독성 연구에서, 준비는 에탄올, 아세톤 또는 석유 2,50,51 등의 유기 용매의 도움으로 물에 용해를 포함하고있다. 그러나 종종 이러한 용매 번하여 테스트 화학 물질 데이터를 51의 해석을 복잡하게, 자신 생물학적으로 활성 상태입니다. 사실, Rufli 등에 따라. 52 등 53, 그것은 수생 독성 실험을위한 테스트 솔루션은 독성 아티팩트를 생성하는 화학 용제의 가능성으로 인해, 화학적 방법을 통해 물리적 인 방법을 사용하여 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 이전 TCS는 0.24 % 에탄올 / 물 (권 / 권)에 녹여 30 분 꺾 RBL 비만 세포의 탈과립 2 초음파 것으로 나타났습니다. 0.24 %보다 높은 농도의 에탄올 비만 세포 degra을 저해하는 표시되었습니다nulation 54,55 - 예 독성 연구에서 유기 용제의 잠재적 인 혼란 함을 주죠 효과. 뿐만 아니라 그것은 생물체 또는 연구에 사용되는 세포에 대한 용매의 영향을 고려하는 것이 중요하지만, 또한이 시험 화학 물질 자체에 용매의 효과를 모니터링하는 것이 중요합니다. 예를 들어, Skaare 등. 51 기름에 용해 함수의 완전한 손실이 발생하면서 폴리에틸렌 글리콜의 TCS를 (일반적으로 치약 및 구강에서 발견) 용해하는 건강한 여성 여성 안티 박테리아 및 안티 플라크 효과를 약화 것으로 나타났습니다. 따라서, 다른 용매의 능력 TCS 등 독성 물질 및 약물을 조절하는 효과를 분석 설계에 고려되어야한다. 오일이나 맛 첨가제의 사용은 다양한 제품 50,51에서 TCS의 효과를 방해 할 수 있습니다. 유기 용제를 사용하는 필요성을 제거하기위한 노력의 일환으로, 우리는 유기 졸의 사용을 제거하여 TCS 2 용해 우리의 방법에 따라 개선배출. 본 프로토콜에서는, 우리는 열 (≤ 50 ° C)과 수성 버퍼에 직접 TCS 과립을 분해 한 후 UV-VIS 분광 광도법으로이 TCS 주식의 농도를 확인합니다. TCS는 40 μM (최대 물에 용해하기 때문에 이러한 개선이 가능 <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) 50 ° C (가열시 분해에 저항하기 위해 표시되었습니다 <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. TCS도 강하게 4,200 L / 몰 / CM 12의 몰 흡광 계수와 280 nm의 58에서 흡수하는 것으로 알려져 있습니다대로 우리는 또한 UV-VIS 분광 광도계의 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 저렴한 비용과 신속한 확인 등 유기 용제의 도움없이 버퍼에 TCS 과립을 분해 할 수있는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다농도, 그리고 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 모니터링하기위한 강력한 형광 마이크로 플레이트 분석을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 셀 </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> 우리가 사용한 셀은 선물이었지만 ATCC에서도 구할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> 저습도 환경에서 보관해야 합니다 </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> 겐타마이신 설페이트 </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> 알부민, 소 혈청 </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% 용액) </td><td>피어스</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T 베이커</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> 염화마그네슘 </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-포도당 </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> 염화칼륨 결정 </td><td>J.T 베이커</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> 염화칼슘 dihyrdate </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> 글리신</p</td><td>> 시그마</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-&beta;-D-glucosaminide (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4 <</td><td>p align="center">Wrap in foil &ndash; 빛에 민감함 </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> 시약의 농도는 1mg/ml입니다. 부분 표본 25 &마이크로; 엘&nbsp; 시약을 별도의 마이크로 원심분리기 튜브와 파라필름에 넣습니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C는 사용되지 않고 2-8°C에서 사용되는 부분 표본을 저장합니다. C 1 개월 이상 . </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>코넬 대학교 데이비드 홀로 카 박사와 바바라 베어드 박사의 선물</td><td></td><td> 제안 : 생명 과학 DNP-BSA 카탈로그 # <a href = "http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A2301<8 / a> </td></tr><tr><td> 칼슘 이오노 포어 A23187 </td><td>시그마</td> <td>C75-22-1mg</td><td> Ionophore는 400 &micro를 첨가하여 분말로 만들어졌습니다. 엘&nbsp; 신선한 100% DMSO를 이오노단 바이알에 넣고 -20°C로 유지합니다. C 참고: 만료 날짜가 3개월이 지난 ionophore를 성공적으로 사용했습니다 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> 무수 탄산나트륨 </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5 <</td><td>p align="center"> </td></tr><tr><td> 염산 </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> 참조 버퍼, pH 7 </td><td></td><td>VWRBDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> 참조 버퍼, pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> 참조 버퍼, pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> pH 전극 스토리지 솔루션 </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> DU 7500 분광 광도계 </td><td>Beckmann</td><td>더 이상 판매되지 않음</td><td> </td></tr><tr><td> Synergy 2 플레이트 리더 Gen5 마이크로플레이트 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 사용 </td><td>BioTek</td><td>모듈 S</td><td> </td></tr><tr><td> 혈구계 </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </tr><tr><td> > 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR 120 V 핫 플레이트/마그네틱 교반 플레이트 </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> 조직 배양 수조 </td><td>VWR</td><td>모델 # 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> 조직 배양 생물 안전 캐비닛 SafeGARD (TC 후드) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> 조직 배양 인큐베이터 </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></p</td><td>> 범위: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> pH meter </td><td>Symphony/VWR</td><td>Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </tr><tr><td> > Combitip 디스펜서 </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">조리법:</td></tr><tr><td> 아세테이트 완충액, pH 4.4 </td><td>0.12M 아세트산을 만들고 10N NaOH로 pH 4.4로 적정합니다. 이것은 MilliQ 물 1L에 5.3ml 빙하 아세트산입니다 : (1 L) * (0.12 mol / L) * (60 g / mol) * (ml / 1.37 g) = 5.3 ml 빙하의 밀도는 1.37 g / ml이기 때문에</td> <td> 멸균 필터를 고압 증기 멸균 유리 병에 넣으십시오 </td><td></td></tr><tr><td> 기판 (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20°C에 보관; C 주식 : DMSO에서 0.12 M (1 ml DMSO에서 46 mg), 37 &deg로 따뜻한; C, 와류, 따뜻한 물로 수조 초음파 발생기에서 10 분 초음파 처리, 다시 와류</td><td>각 실험에 대해 아세테이트 완충액 (100x 희석)에서 기질의 새로운 용액을 만들고 아세테이트 완충액에서 1.2 mM의 최종 농도를 만듭니다 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 탄산 완충액, pH 10 </td><td>26.7 g 글리신 47.1 g 무수 탄산 나트륨 1 L에 탈 이온수를 추가합니다. pH를 10</td><td>멸균 필터를 고압증기멸균 유리병</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes(2L), pH 7.4 </td><td>135mM NaCl: 15.78g(또는 1M 270ml) 5mM KCl: 1M 스톡 10ml 1.8mM CaCl2: 0.5 M 스톡 7.20 ml 1 mM MgCl2: 0.5 M 스톡 4.00 ml 5.6 mM 포도당: 2.02 g (1 M 11.2 ml) 20 mM HEPES: 1 M 스톡 40 ml 농축 HCl pH 사용 ~9.7-7.4</td><td>멸균 필터를 고압증기멸균 유리병에 넣</td><td></td></tr><tr><td> RBL 세포 매체 </td><td>해동 소 태아 혈청 (FBS, -20 &deg; C) 37°C에서 약 4시간 동안; C 수조: 표준 멸균 기술을 따르십시오: L-글루타민(Earle' 포함)과 함께 1L의 최소 필수 배지(MEM)를 꺼내십시오. s salts) MEM을 약간 부어 800ml MEM을 만들고 200mL의 따뜻한 FBS를 추가합니다. 멸균 피펫이 있는 배지 1L에 겐타마이신 설페이트 항생제 1ml를 추가합니다. 세포 배양 전용으로 오토클레이브 처리되고 표시된 배지 병만 사용합니다.</td><td>멸균 필터 (0.2 mm)를 고압클레이브 유리 병에 넣</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">사용된 플라스틱 재료:</td></tr><tr><td> 200 &micro; 엘&nbsp; 96 rack </td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> 1,000 &micro; 엘&nbsp; HighRecovery가 있는 멸균 에어로졸 피펫 팁 </td><td>VWR</td><td>89003-420 <</td><td>p align="center">폴리에틸렌 </td></tr><tr><td> 10 &micro; 엘&nbsp; 마이크로 팁 저 바인딩 멸균 </td><td>VWR</td><td> 14217-704 </td><td> 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 높은 G-force를 위한 일회용/원추형 미세 원심 분리기 튜브 </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> 폴리프로필렌 </td></tr><tr><td> 일회용/졸업식/원뿔형/멸균 50 ml&nbsp; 스크류 캡이 있는 원심분리기 튜브 </td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> 일회용/점진/원추형/멸균 15 ml&nbsp; 스크류 캡이 있는 원심분리기 튜브 </td><td>VWR</td><td>21008-103</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 조직 배양 처리 T-25 플라스크 w/ 필터 캡 </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> 폴리스티렌 </td></tr><tr><td> CELLSTAR 조직 배양 처리된 T-75 플라스크 w/ 필터 캡 </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> polystyrene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; 종이/플라스틱으로 감싼 혈청학 피펫 </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> 폴리스티렌 </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; 종이/플라스틱 래핑 혈청학 피펫 </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> 폴리스티렌 </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; 종이/플라스틱 래핑 혈청학 피펫 </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> polystyrene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; 종이 / 플라스틱 포장 혈청 피펫 </td><td>Greiner Bio One</td> <td>760180</td><td> polystyrene </tr><tr><td> > 1 cm 큐벳 </td><td>N / A</td><td> N / A</td><td> 폴리스티렌 </td></tr><tr><td> CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> 폴리스티렌 </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> 폴리 프로필렌 / < 정렬 = "중심">폴리에틸렌 </td></tr></tbody></table>

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : rbl-2h3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

비만 세포는 알레르기 질환과 기생충에 대한 면역 방어에 중요한 역할을한다. 일단 (알레르겐에 의해 예) 활성화, 그들은 degranulate, 프로세스가 알레르기 중재자의 exocytosis에 결과. 약물 및 독성 물질에 의한 비만 세포의 탈과립의 변조는 인간의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 비만 세포 기능은 쥐 염기성 백혈병 비만 세포의 사용 (RBL-2H3), 3-5 인간의 점막 비만 세포의 널리 사용되는 모델을 자세히 해부하고있다. 6 마스트 세포에서 히스타민과 협력하여 선형 출시 비만 세포 과립 구성 요소와 알레르기 중재자 β-헥 소사 미나는, 쉽게 신뢰성에 대한 의무가 마이크로 분석에서 측정 형광 강도를 산출, 형광 기질과의 반응을 통해 측정 할 수있다 높은 처리량 연구 1. 원래이 NaAl 등 1.에 의해 게시, 우리는 검사 O이 탈과립 분석을 적응F 약물 및 독성 물질과 여기에서의 사용을 보여줍니다. 트리클로산은 많은 소비자 제품에 존재하며이 효과에 대한 메커니즘은 알 수 있지만, 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11 치료 도움이 될 발견되었습니다 광범위한 스펙트럼 항균 에이전트입니다. 여기에서 우리는 비만 세포 탈과립에 트리클로산의 효과에 대한 분석을 보여줍니다. 우리는 최근 트리클로산 강하게 비만 세포의 기능이 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유기 용매의 사용을 방지하기위한 노력의 일환으로, 트리클로산은 열 교반 수성 버퍼에 직접 용해되고, 결과 농도는 12 (ε 280 = 4,200 L / M / ㎠ 사용) UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 확인됩니다. 이 프로토콜은, 더 넓게 자신의 알레르기 가능성을 비만 세포 탈과립에 미치는 영향을 결정하기 위해 다양한 화학 물질과 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고 있으며,.

50 가열하면 ° C 90 분, TCS에 대한 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 그림 1에서 보는 바와 같이 280 nm의 피크 ~ 260, 300 nm의 사이에 강한, 부드러운 곡선을 생산하고 있습니다. 280 nm에서 발표 몰 흡광 계수는 4,200 L / 몰 / ㎠ 12 년부터 UV-VIS 분광 광도계는, 따라서 농도를 계산하는 데 이용 될 수있는 중요한 도구입니다. 우리는 TCS는 50 ° C 가열 (데이터가 표시되지 않음)에 따라, 전체 탈과립 실험의 기간 동안 용액 빠지지 않는 것으로 나타났습니다. 수성 버퍼에 직접 TCS를 해산이 가열 방법을 사용하면, 우리는이 NaAl 등의 최적화 된 형광 기반의 분석을 사용하여 비만 세포 탈과립에 TCS의 효과를 조사 하였다. 1이 분석은 돛대에서 풀어 β-헥 소사 미나의 수준을 기록 형광 기판 제품을 감지하여 한 시간 배양 한 후 세포. DNP-BS에 의해 degranulate을 자극 여부항원 <stro...

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 마이크로플레이트 분석을 사용하여 비만 세포 탈과립화에 대한 화학적 영향을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 유기 용매를 사용하지 않고 항균제인 트리클로산의 억제 효과가 입증되었습니다. 이는 먼저 비만 셀을 96웰 플레이트에 도금하여 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 하고 가열을 통해 유기 용매를 사용하지 않고 수용액에 트리클로산을 준비함으로써 달성됩니다.그런 다음 Trian 용액의 농도는 자외선 가시광선 분광법을 사용하여 신속하게 측정됩니다. 두 번째 단계로, 트리안의 유무에 관계없이 IgE 슬래시 항원 또는 칼슘 이오노포어로 세포를 자극하여 비만 세포 탈과립 마커 베타 헥소사미니다아제를 상청액으로 방출합니다. 세포 상등액으로의 베타 헥소사미니다아제 방출은 베타 헥소사미니다아제 기질을 사용하여 정량화되며, 이 기질의 형광 생성물은 마이크로플레이트 리더에서 정량화됩니다.비만 세포 탈과립에 대한 트리클로산 또는 기타 테스트 화학 물질의 효과를 측정하기 위해 결과를 얻습니다. 그 쇼는 triclosan이 형광 기반 마이크로 플레이트 분석을 기반으로 쥐 호염 우병 백혈병 비만 세포에서 항원 또는 칼슘 이온 4 활성화 과립을 억제한다는 것을 보여줍니다. 이전 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 고처리량 스크리닝에 적합할 수 있는 저렴하고 빠르며 매우 민감한 대안이라는 것입니다.또한, 일부 유기 용매를 사용하지 않고 트리안을 수용액에 용해하면 많은 유기 용매가 비만 세포 기능에 미치는 교란 효과를 피할 수 있습니다. 트리클로산 농도 측정을 위한 이 기법은 UV 대 분광법이 빠르고 비용이 저렴하다는 장점도 있습니다.이 MA는 비만 세포 탈과립에 대한 트리클로산의 효과에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, SA인 이 마이크로플레이트는 면역독성 또는 내분비 교란 효과에 대해 테스트 중인 다양한 잠재적 항알레르기 약물 후보 및 화학 물질의 스크리닝에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 호염기성 백혈병 비만 세포주 또는 RB two H three를 사용하며, 이는 널리 인정되는 인간 점막 비만 세포 또는 호염기구 모델입니다. RBL 세포는 트립신 및 세포 계수에 대한 표준 절차에 따라 T 25 플라스크에서 배양됩니다.밀리리터당 6개 셀에 대해 밀도가 0.5 곱하기 10인 세포 현탁액을 RBL 매체로 만들어 플레이트를 만들고 평평한 검은색 바닥 96웰 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 셀을 분

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 호염질 탈과립화를 유도하기 위해 항원의 알레르기 가능성을 평가하는 시험관 내 방법에 대해 설명합니다. β-hexosamindase는 화학적 매개체 방출의 지표로 사용되며 β-hexosamiminase의 효소 활성은 형광 기질을 사용하여 측정합니다.

인간화 매개체 효소 방출 분석법: 체외에서 호염질 탈과립 반응을 모니터링하여 테스트 항원의 알레르기 가능성을 스크리닝하는 면역화학적 방법

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

이 비디오는 CXCR4 케모카인 수용체를 발현하는 교모세포종 세포와 관련된 세포 분석을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 제제 상호 작용에 따른 형광 변화를 측정하여 세포 신호 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

이 동영상은 탈과립 분석을 통해 호중구 활성화 및 과립 외세포작용(granule exocytosis)을 모니터링하는 분석을 보여줍니다. 전염증성 화합물에 의해 활성화되면, 젤라티나제를 함유한 호중구 내의 세포질 과립이 세포막과 융합하여 화물을 배출합니다. 상등액 내 젤라티나아제의 존재 여부는 형광단 접합 젤라틴 기질의 가수분해를 통해 평가되어 호중구 활성화 및 탈과립화를 확인합니다.

호중구 활성화 및 젤라티나아제 방출을 모니터링하기 위한 탈과립 분석

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.

인간화된 중재자 릴리스 분석으로 알레르겐 효능에 대 한 읽기-아웃

여기에서, 우리는 향상된 화학탁증 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 전통적인 세균 화학 요법 방법의 단계와 비용을 줄이고 식물 미생물 상호 작용을 이해하는 데 중요한 자원역할을하는 것입니다.

루트 엑수데이트에서 뿌리 균 화학 물질의 신속 한 식별에 대 한 향상 된 화학 분석

학습하세요 유기 용매 없이 트리클로산이 RBL-2H3 비만 세포 탈과립을 억제하는 형광 마이크로플레이트 분석법을 통해 화학 물질의 면역 독성 효과를 평가하는 방법을.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

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