정량 체외 분석

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명

이 절차의 전반적인 목표는 정적 조건에서 체외에서 내피 세포에 부착된 호중구의 상대적 수를 정량화하여 미세혈관 내피 세포 염증 활성화의 정도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 두 번째 단계에서 원하는 실험적 자극으로 미세혈관 내피 세포의 건강한 합류 단층을 처리함으로써 달성됩니다. 건강한 인간 지원자의 호중구를 분리한 다음 칼슘 am으로 표시합니다.

다음으로, 표지된 호중구를 내피 세포에 첨가하고 20분 동안 부착하도록 하며, 이 시간 동안 형광 분광 기하학에 의해 사전 세척 측정을 얻습니다. 마지막 단계에서는 비부착성 호중구를 씻어낸 후 세척 후 측정을 얻습니다. 궁극적으로, 각 치료 조건에서 칼슘으로 표지된 호중구가 내피 세포 단층에 대한 비율과 상대적 순응도를 결정할 수 있습니다.

이 방법은 다양한 조건에서 미세혈관 내피 염증 활성화의 상대적 범위를 결정할 수 있기 때문에 인간 염증 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 분석은 분석 당일 미세혈관 내피에 백혈구 결합을 포함하는 인간 내피 기반 질병 과정을 연구하는 도구로 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포가 세포 파편이 거의 없는 건강한 조약돌 모양을 나타내고 100% 융합되어 있는지 확인합니다.

HM VEC 단층이 치료할 준비가 되면 HBSS로 세포를 한 번 세척한 다음 염증 작용제 유무에 관계없이 0.3ml의 새로운 미세혈관 내피 세포 성장 배지를 적절한 웰에 추가합니다. 여기서 HM VEC 폐는 호중구를 분리하기 위해 3시간 동안 TNF 알파로 처리되고 있습니다.먼저 Polymorph prep을 사용하여 밀도 구배 용액을 실온으로 가져옵니다. 그런 다음 건강한 사람으로부터 30ml의 전혈을 채취한 후, 항응고제 층이 있는 곳에서 5ml의 혈액을 15ml 원뿔형 튜브에 5ml의 Polymorph prep으로 채웁니다.

전혈을 G 450회, 섭씨 18-22도에서 30분 동안 분리하여 튜브의 균형이 잘 잡혀 있는지 확인합니다. 그런 다음 노란색 플라즈마와 PBMC를 포함하는 층을 흡인하여 불투명한 분홍색 호중구층의 오염을 방지합니다. 호중구를 제거하려면 1-2ml의 혈청학적 피펫으로 호중구층을 흡인하면서 피펫과 튜브를 천천히 회전시킵니다.

여러 튜브의 호중구를 30ml의 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS가 들어 있는 50ml 원추형 튜브로 당깁니다. 더 많은 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 부피를 최대 50ml까지 가져오십시오. 세포를 회전시킨 후 스내트를 흡인한 다음 소생시킵니다.

30초 후에 적혈구를 이가 되도록 8ml의 멸균수에 호중구를 매달아 놓습니다. 8ml의 세포 현탁액을 2ml의 5 x 칼슘 및 마그네슘 프리 PBS에 빠르게 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다. 세포를 회전시킨 후, 다시 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS에서 세포를 한 번 세척한 다음 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 10ml에 펠릿을 재현탁하고 트리안 블루 배제에 의해 살아있는 세포를 계수합니다.

계수 후, 재현탁 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 호중구를 페놀 레드 프리 RPMI 1640으로 밀리리터당 2-400만 개의 세포로 희석합니다. 그런 다음 갓 준비한 칼슘 am 작업 용액을 세포에 3 마이크로 몰 농도로 첨가합니다. 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포 현탁액을 혼합한 다음 호일로 덮인 튜브를 섭씨 37도에서 배양합니다.

30분 후, 라벨링된 호중구를 원심분리한 다음 펠릿을 섭씨 37도의 10밀리리터에서 두 번 세척합니다. 페놀 레드 프리 RPMI 1640, 40 미크론 멸균 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시켜 두 번째 원심분리 전에 덩어리를 제거합니다. 호중구를 섭씨 37도의 10밀리리터에 재현탁합니다.

페놀 레드 무료 RP MI 1640. 그런 다음 세포를 한 번 더 세고 나서 밀리리터당 200만 개의 세포로 희석합니다. 지금 0.22 미크론 여과기의 0.5 밀리리터, 3번째 세척 후에 우물 당 3%BSA를 포함하는 살균한 페놀 빨간 자유로운 RPMI 1640년을 가진 HM vec 단층을 3 번 세척하고, 매체를 흡인하고 세포 현탁액의 0.3 밀리리터에 있는 600, 000의 칼슘에 의하여 표를 붙인 호중구, 또는 48의 잘 판의 적합한 우물에 호중구 없는 페놀 빨간 자유로운 RPMI 1640년의 0.3 밀리리터를 다음으로 20 분 동안 CO 배양물을 배양하십시오 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%를 감춘 후 배양 기간이 끝나기 직전에 여기 파장 485나노미터와 방출 파장 520나노미터에서 분광 광도계에서 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.

그런 다음 플레이트를 뒤집어 미디어를 제거하고 종이 타월에 부드럽게 덧대어 남아 있는 액체를 제거합니다. hm ve 단층과 호중구가 들어있는 우물을 칼슘과 마그네슘으로 PBS 당 0.5mm로 5회 세척합니다. 매번 같은 방법으로 PBS를 제거합니다.

웰당 0.3ml의 페놀 레드 프리 RPMI 1640으로 웰을 새로 고친 다음 방금 설명한 대로 각 웰의 형광 강도를 측정합니다. 마지막으로, 이러한 공식을 사용하여 웰당 순응도 및 상대 순응도를 측정합니다.호중구 결합 분석을 사용하여 신뢰할 수 있는 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 분석 당일에 미세혈관 내피 세포의 건강과 공동 유창성이 최적이어야 합니다. 조약돌 모양과 Fluor star Optima 분광 광도계에서 단층의 총 cofluency를 주목하십시오.

예를 들어, 형광 OD 520 나노미터는 10, 000에서 100만 개의 표지된 호중구를 분석할 때 선형 범위 내에 있습니다. 흥미롭게도, 염증성 작용제로 치료한 HM VEC 폐 단층에 더 많은 호중구가 추가됨에 따라 순응도 순응도가 증가합니다. P 38 map kinase는 이전에 e selectin 발현에 필요한 것으로 입증되었습니다.

TNF에서 알파 처리된 인간 내피 세포와 그 억제는 부착된 호중구의 수를 감소시켜 사용된 세포의 수가 분광 광도계의 선형 범위 내에 있는 한 웰에 추가되는 호중구의 수가 임의적임을 입증합니다. 여기서, P38 맵 키나아제 억제제 B IRB 7, 96의 부재 또는 존재 하에서 TN F 알파 처리된 HM VEC 폐 세포를 사용한 호중구 접착 검정이 도시되어 있습니다. 이러한 결과는 P 38 mapk 억제 후 호중구 결합의 상대적 감소가 유사하다는 것을 보여줍니다.

웰당 호중구의 수에 관계없이 렉틴은 TNF 알파로 처리한 후 내피 세포 표면에 발현되며 호중구 표면에 존재하는 당분자와의 정전기 상호 작용을 통해 혈관 구조에서 호중구를 포착합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, TNF 알파 활성화 내피 세포를 E 셀렉틴에 대한 항체로 사전 배양하면 호중구에 결합하는 능력이 약 75% 감소합니다. 이 분석법은 주로 이러한 이미지에서 호중구 접착 캐스케이드의 초기 이벤트를 평가하며, 칼슘 표지된 호중구는 처리되지 않은 상태로 결합되고 TN ffat 처리된 HM VEC 폐 단층은 대조군 IgG 또는 E 셀렉틴으로 사전 배양됩니다.

이 열에는 다클론 항체가 표시되어 있으며, 반투명 광 현미경 이미지에는 Fluorescein 필터 세트를 사용하는 동일한 참조 필드의 형광 이미지가 이 웰에 표시되어 있습니다. 방금 시연된 바와 같이 PBS로 세척하기 전의 총 호중구 형광의 대표적인 이미지가 이 웰에 표시되어 있습니다. 방금 시연된 바와 같이 PBS로 세척한 후 부착된 호중구 형광의 대표적인 이미지가 표시됩니다.

TN FFA 치료 후 순응도 증가는 s selectin polyclonal 항체가 존재할 때 감소합니다. 이 절차를 시도하는 동안 건강한 저계경수 내피 세포를 사용하고 채취 후 2시간 이내에 전혈 및 분리된 호중구를 사용하는 것이 중요합니다.