Name: 정량 체외 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 정량 체외 분석을 통해 활성화된 내피세포에 대한 호중구 부착을 측정하는 방법을. 형광 분광법을 사용하여 염증 반응 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 기여합니다.

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이 작품은 마취와 수술 전후 관리의 UCSF 부에 의해 지원되었다.

1. 도금 및 미세 혈관 내피 세포의 유지 보수 <ol><li> 해동 및 제조 업체에 따라 혈관 내피 세포 성장 지침을 제공. 이 프로토콜에서는, 세포는 EGM-2 MV 미디어 (론자)에서 재배되었고, 그것은 모든 실험은 통과 번호로 인한 변형을 최소화하기 위해 해동 후 2 주 내에서 수행하는 것이 좋습니다. HMVEC 폐를 가진 우리의 실험은 9-4 구절 사이에 수행됩니다. </li><li> 1 일 : 세포가 80 % ~ 90 % confluency에 도달하면 trypsinize 및 ML 당 120,000 세포에 resuspend을. 48도, 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (들)에 플레이트 잘 당 36,000 세포 (0.3 mL를). 배경 형광 판독 값을 얻기 위해 백혈구와 함께 배양되지 않습니다 HMVEC의 우물이 (가) 있습니다. 특히 형광 분석, 교대 행 또는 열을 위해 디자인 된 48 - 웰 플레이트를 사용하지 않는 이웃 우물에서 어떤 빛 ​​오염을 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 웰스 폴리 라이시로 사전 코팅 할 수 있습니다NE, 콜라겐이나 fibronectin의. </li><li> 주 2 : 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 3 일 : 위상차 현미경으로 세포가 (즉, &quot;조약돌&quot;외관과 작은 세포 파편) 건강한 확인하고, 그들은 100 % 합류 (그림 1)입니다. 세포가 100 % 합류하지 않은 경우 그들은 준비가 될 때까지 매일 미디어를 변경합니다. </li><li> HMVEC 단층 치료 준비가되면, 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 한 번 세포를 세척하고 적절한 우물에 염증 작용제를 포함하는 신선한 EGM-2 MV 미디어 또는 미디어 0.3 ML를 추가합니다. 이 프로토콜에 HMVEC 폐는 TNFα 처리 하였다 3 시간 동안 [100 NG / ML] (PeproTech, 뉴저지)이 EC에 21 잘 설명 활성제이기 때문에. 주 : 당신의 활성화 HMVEC 세포 (단계 4.1)와 calcein 레이블이 호중구 (단계 3.5) 오전 그래서 당신은 시간 실험을하는 것은 동시에 사용할 준비가 권장됩니다. 그것은 neutroph를 분리하고 라벨을 우리에게 약 2.5 시간 소요ILS. </li></ol> 2. Polymorphprep를 사용하여 호중구의 분리 <ol><li> 이전 22 설명 된 호중구를 분리, 또는 전체 혈액에서 다형 과립구를 분리하는 기성품 밀도 기울기 솔루션. Nuzzi, 외 의해 프로토콜에 따라 Polymorphprep을 채용. 전체 혈액의 23 ML 당 약 2-3 X 10 6 호중구의 생산량 2007 결과. 참고 : 적혈구를 제거하기 위해 과도한 적혈구 용해, 덱스 트란 침강을 방지하려면이 밀도 기울기 원심 분리 24 이전에 수행 할 수 있습니다. </li><li> RT에 Polymorphprep 밀도 기울기 솔루션을 가지고. </li><li> 의 면전에서 건강한 인간 자원에서 전체 혈액의 30 ML를 수집 헤파린, 구연산 또는 EDTA로 항 응고. 혈액은 2 시간 이내에 사용하고, 18-22 ° C. 사이에서 유지되어야한다 </li><li> 15 ML 원뿔 튜브의 밀도 기울기 용액 (5 ㎖를 통해 전체 혈액의 5 층 ML <strong&gt; 그림 2A). 이 다음 원심 분리 조건을 변경할 수 있으므로 혈액의 볼륨과 밀도 기울기 솔루션을 변경하지 마십시오. </li><li> 18-22시 30 분 450 XG에 원심 분리기 ° C. 천천히 속도를 아래로 원심 분리기 (즉, 원심 브레이크를 해제) 및 호중구의 활성화를 줄이고 레이어의 혼합을 방지하기 위해 진동을 방지하기 위해 잘 튜브의 균형을해야합니다. 이상 원심 분리 시간 이상 원심력 펠렛 적혈구쪽으로 더 아래로 마이그레이션하는 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층에서 발생합니다. </li><li> 호중구 (그림 2B)를 포함하는 레이어의 오염을 방지하기 위해 말초 혈액을 포함하는 플라즈마 상 백혈구 밴드를 대기음. </li><li> 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층을 제거하는 1-2 ML 혈청 피펫을 사용합니다. PBS의 30 ML에 호중구 층을 결합 50ml에 (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)원뿔 튜브. </li><li> PBS 50 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 18-22시 10 분 450 XG에 원심 분리기 ° C.에 볼륨을 가지고 </li></ol> 참고 : 단계 2.9 및 2.10은 선택 사항이지만 매우 좋습니다. <ol start="9"><li> 뜨는을 대기음. 적혈구를 용해하기 위해 30 초 동안 멸균 물 8 ㎖에 호중구를 resuspend을 즉시 배 PBS 2 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 부드럽게 손으로 혼합이.에서 세포를 배양하지 마십시오에 세포 현탁액을 추가 이상 30 초 동안 물 상당한 호중구 죽음이 발생할 수 있기 때문이다. </li><li> 18-22에서 5 분 250 XG에 원심 분리기 ° C. </li><li> PBS의 10 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)과 18-22에서 5 분 250 XG에서 다시 원심 분리기 ° C. 한 번 세포를 씻으 </li><li> RPMI-1640 10 ㎖에 호중구를 resuspend을 (페놀 레드없이) 트리 판 블루를 사용하여 살아있는 세포를 계산E 염색 제외 방법. 이 호중구의 활성화가 발생할 수 있으므로 ML 당 5 × 10 6보다 큰 세포 밀도의 연장 기간을 피하십시오. </li></ol> 3. Calcein AM와 호중구 레이블 <ol><li> 6 × 10 5 호중구는 48 - 웰 플레이트 잘 당 사용됩니다. </li><li> 계산 후, 50 ML 원뿔 튜브에 재 부유 세포를 전송하고 2-4 페놀 레드 무료 RPMI-1640 ML 당 X 10 6 세포 호중구를 희석. </li><li> calcein 3 μM (calcein AM 품절 즉, 2.98 μL (1 MG / ML) 당 ML 미디어)의 주식 솔루션 AM 추가하고 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 잘 섞는다. 이상 5 μM는 calcein 호중구에서 누수가 발생합니다 오전. 주 : 비 형광 calcein AM이 높은 형광 분자 calcein (즉, 죽은 세포가 형광을하지 않을 것이다) 생산 내생 에스 테라 제에 의해 세포 내에서 쪼개 있습니다. </li><li> 알루미늄 호일로 튜브를 커버와 f를 품다또는 37 30 분 ° 어둠 주에 C :. 긴 배양 시간은 접착 분석의 과정을 통해 호중구에서 해방되고 더 calcein이 발생할 수 있습니다. </li><li> 18-22 ° C에서 5 분 450 XG에 원심 분리기 및 RPMI-1640 10 ㎖ (페놀 레드 않고, 37 미리 예열 ° C)의 2 배 호중구을 씻는다. 40 μM 살균 필터가 18-22에서 덩어리를 제거하고 5 분 450 XG에 한 번 더 원심 분리 할 수​​ 있지만 두 번째 세척에 대한 세포를 현탁 한 후, 최초의 호중구를 통과 ° C. </li><li> ML 당 2 × 10 6 호중구에서. (37 ° C로 예열없이 페놀 레드) RPMI 1640 호중구를 resuspend을 </li></ol> 4. 호중구 바인딩 분석 <ol><li> 필터 소독 (0.22 μm의) RPMI 1640 0.5 ML (페놀 레드없이) 잘 당 3 % BSA를 포함하는와 배 HMVEC 단일 층을 씻으십시오. </li><li> 미디어를 대기음 6 × 10 5 calcein - 라벨 호중구 (셀 suspensio의 0.3 ML를 추가. 48 - 웰 플레이트주의의 적절한 우물에 호중구가없는 RPMI 1640 N), 0.3 ML은 (페놀 레드없이) : 이것은 cm 2 당 8 × 10 5 호중구에 해당합니다. </li><li> 37 ° C에서 20 분, 5 % CO 2 배양기에 대해 품어. </li><li> 총 호중구 형광 (PRE 세척) : 485 ㎚의 여기 파장과 FLUOstar, 또는 이와 동등한 분광 광도계 520 nm의 (형광 필터 세트)의 발광 파장 각 우물의 형광 강도를 측정한다. . 직전에 배양 엔드 포인트에 참고이 단계를 수행하십시오 :이 프로토콜에서는, calcein의 여기 및 방출되는 빛의 검출이 밝혀 우물의 상단에서 수행되었다, 그러나 모두는 우물의 바닥에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PBS의 잘 당 0.5 mL로 배 HMVEC 단층 및 호중구가 포함 된 우물 세척 (W / CA 2 + 및 마그네슘 2 +). 미디어 및 세척을 제거반전 플레이트 및 종이 타월로 가볍게 두드려하면 남아있는 액체를 제거합니다. </li><li> 다시 잘 당 RPMI 1640 0.3 mL를 (페놀 레드없이)을 추가합니다. </li><li> 자기편 호중구 형광 (POST 세척) 단계 4.4에서뿐만 아니라 각각의 형광 강도를 측정한다. </li><li> 퍼센트 준수하고 잘 당 기준 준수를 확인합니다 : </li></ol> 참고 :이 단계에서, calcein - 라벨 호중구의 이미지가 표준 형광 필터 장착 된 형광 현미경 능력을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 4의 이미지는 Pro7 소프트웨어 (Q 이미징) Q는 캡처를 사용 Retiga 2000R 카메라 (Q 영상)를 탑재 올림푸스 IX51 도립 현미경 하였다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

성공적으로 호중구 / 미세 혈관 내피 세포 접착 분석을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 낮은 통로 번호 (&lt;10), 건강한 내피 세포의 사용, 낮은 밀도 (즉, &lt;5 × 10 6 세포에서 분리 된 호중구를 유지 2) / ㎖) 및 분리 2 시간 이내에 그들을 사용하여, 각각 3) 까다로운 calcein AM-라벨 호중구의 세척 및 호중구에서 calcein의 EC 오염과 손실을 최소화하기 위해 적시에 calcein AM-라벨 호중구의 사용, . 우리는 조직 문화의 cm 2 당 8 × 10 5 호중구 잘 표면적 (즉, 60 호중구 잘 당 48 - 웰 플레이트)를 추가합니다. 우리는 60 호중구의 입력은 우리 분광 광도계의 선형 범위 내에 있는지 발견하고 상대 adherences 측정시 안정적으로 데이터를 재생합니다. 단, 호중구 바인딩 매우 유사한 감소에 관찰40,...

혈관 내피 세포는 혈액 순환과 직접 접촉에 있기 때문에, 그것은 유일하게 감염이나 부상시 신속한 염증 반응을 시작할 수 있습니다. 내피 세포 (내피) 보존 세균의 구성 요소와 위험 분자의 다양성을 인식하고 표현 패턴 인식 수용체, 그리고 TNFα와 같은 호스트에 염증 매개체에 대한 수용체. 이들 수용체의 활성화는 내피는 사이토 카인 (예를 들어, IL-6, IL-8, CXCL1 및 CCL2) 분비하고, 그들의 세포 표면 1에서 부착 분자 (예를 들어, E / P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1)를 상향 조절을 유도 2. 이 분자는 모든 전염성 에이전트의 호스트를 삭제하고 조직 수선에게 3,4을 시작하기 위해 감염과 부상의 사이트에 백혈구의 국산화를 촉진한다. 감염 호중구 반응은 혈관 내피 세포와 응답 사이의 잘 조율 된 상호 작용을 포함 호중구. EC의 활성화에 따라, IL-8 분비 감염이나 부상 5,6의 사이트에 집으로 호중구 수있는 내피 세포에서 혈관 그라데이션을 형성하고 있습니다. E / P-셀렉틴를 중재 호중구 캡처 및 호중구 세포 표면에 glycomolecules 상대적으로 약한 연결을 통해 압 연입니다. 이러한 상호 작용은 그 동족 수용체 IL-8 바인딩과 함께, 강력한, 인테-매개 부착과 내피 세포 표면 7-10 호중구 결국 체포를 용이하게합니다. 체포 후 호중구가 직접 병원균을 제거 병원균의 확산을 방지하기 위해 호중구 세포 트랩을 생성, 상처 치유를 촉진하고 단핵구, 대 식세포 및 수지상 등의 백혈구를 모집하는 추가 요인을 풀어 감염의 특정 사이트에 혈관 밖으로 마이그레이션 할 수 있습니다 세포 11-17. microv에 호중구 부착을 정량 할 수있는 체외 방법은이 보고서에 설명ascular는 TNFα 호스트 염증 매개체에 의해 활성화 된 후 ECS. 이 분석은 내피의 활성화, 그리고 호중구을 평가하기 위해 설계되었습니다. 인간의 기본 호중구 먼저 밀도 기울기 분리를 사용하여 격리하고, 다음 calcein 아세 톡시 (AM)로 표시되어 있습니다. 살아있는 세포 가수 분해 calcein에서 에스 테라 제는 492-495 nm의 513-516 nm의 18의 배출 여기에 높은 형광 calcein 분자 오전. 찬란 - 라벨 호중구는 다음 EC 단층으로 배양되고, 비 부착 호중구는 이후에 제거됩니다. 나머지 바운드 호중구의 형광 그 형광 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 잘 당 총 호중구 형광 입력의 비율로 계산됩니다. 이 방법은 분광 광도계에 사용되는 바인딩 calcein - 라벨 호중구가 직접 EC의 AC 읽어 더 많은 정성을 제공하는 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다tivati​​on. 이 분석은 정적 인 조건에서 수행되기 때문에, 호중구 부착 폭포에서 발생 만 매우 초기 이벤트가 부과됩니다. 이 TNFα 처리 인간의 폐 혈관 EC (HMVEC 폐)에 해당 호중구 준수 E-셀렉틴과의 상호 작용이 중단 될 때 단일 층이 대폭 감소를 표시하는 E-셀렉틴 차단 항체를 사용하여이 보고서에서 확인됩니다. TNFα에 더하여, 우리는 성공적으로 수신자 같은 수용체 1 / 2 작용제 펩티도 글리 칸과 연관된 지단백 (PAL), murein 지방 단백질 (MLP)와 Pam3Cys에 의해 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 활성화의 범위를 결정하기 위해이 분석을 사용했습니다 Pam3Cys 19,20으로 HMVEC 폐 활성화. 또한, 우리는 성공적으로이 방법론의 다양한 호환되는 제안, 키나제 억제제와 HMVEC 폐의 표면과 세포질 단백질의 RNAi를 매개 최저 한 후이 분석을 사용 생화학 screeninG의 분석 20. 요약하면,이 분석은 체외에서 염증 매개 물질에 의해 EC 활성화의 범위를 액세스 할 재현성, 더 많은 기능을 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>모든 공급업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>48-well Tissue Culture Plates</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (페놀 레드 제외)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL001</td><td>모든 공급업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 및 페놀 레드 제외)</td><td>UCSF 세포 배양 시설</td><td>CCFAL003</td><td>모든 공급업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (페놀 레드 제외)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td><td>(0.995 mM) 재고 soln</td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M 필터</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>모든 공급 업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA 분광 광도계</td><td>BMG LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

혈관 내피 세포는 염증 반응에 중요한 역할을한다. 염증의 급성 단계 동안, 내피 세포 (내피)는 호스트 매개로 직접 보존 미생물 구성 요소 또는 호스트 파생 위험 분자에 의해 활성화됩니다. 활성화 된 내피 표현 사이토 카인, 케모카인 동원과 접착 분자는, 감염이나 부상의 사이트에서 백혈구를 활성화하고 유지합니다. 호중구 도착하는 최초의 백혈구이며, 두 세포의 표면에 존재하는 접착 분자의 다양한 통해 내피을 준수합니다. 호중구의 주요 기능은 직접 미생물의 위협을 제거하는 추가 요인의 출시를 통해 다른 백혈구의 채용을 촉진하고, 상처 복구를 시작하는 것입니다. 따라서 내피 세포에 자신의 모집 및 첨부 염증 반응의 개시에 중요한 단계입니다. 이 보고서에서, 우리는 사용하는 체외 호중구 접착 분석에 대해 설명합니다calcein 정적 조건에서 미세 혈관 내피 세포의 활성화 정도를 정량하는 인간의 기본 호중구 AM-레이블. 이 방법은 형광 분광 광도계로 정량 동일한 샘플을 직접 호중구 바인딩보다 질적 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다.

호중구 바인딩 분석을 사용하여 신뢰성, 재현성 결과를 얻기 위해서는 그림 1 HMVEC 폐에 그림과 같이 건강과 미세 혈관 내피 세포의 confluency에이 분석의 날에 최적이다하는 것이 필수적이다. 또한, 낮은 통로 번호 혈관 내피는 (이하 9 구절 즉,)를 사용하는 것이 필수적이며, 따라서, 우리는 해동 2 주 이내에 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 호중구의 건강은 세포가 어떤 방식으로 구성하는 경우 calcein AM은 형광 calcein 분자에 대사되지 않습니다 특히 이후, 또한 가장 중요합니다. 우리는 판 블루 배제 방식을 사용하며, 세포의 상당 부분 (즉, 스테인드) 죽은 경우 분석을 진행하지 않습니다. 이 밀도 기울기 및 항원 기반의 열 분리 방법 등 호중구를 분리하는 방법은 여러 가지가 있으며, 모든이이 절차에 충분합니다. 우리는 축 쉴드에서 Polymorphprep 기성품 밀도 기울기 솔루션...

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명<em&gt; 체외에서</em정적 조건에서 염증 매개 물질에 의해 활성화 된 내피 세포에 바인딩 인간의 기본 호중구의&gt; 정량.

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 정적인 조건의 in vitro 환경에서 내피세포에 부착되는 호중구의 상대적 수를 정량화함으로써 미세혈관 내피세포의 염증성 활성화 정도를 결정하는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 건강한 미세혈관 내피세포의 합류 단층(confluent monolayers)을 원하는 실험적 자극제로 먼저 처리함으로써 수행됩니다. 건강한 인간 자원봉사자로부터 호중구를 분리한 다음 calcium am으로 표지합니다.다음으로, 표지된 호중구(neutrophils)를 혈관내피세포(endothelial cells)에 첨가하고 20분 동안 부착시키며, 이 시간 동안 형광 분광법(fluorescence spectro geometry)을 통해 세척 전 측정을 수행합니다. 마지막 단계에서는 부착되지 않은 호중구를 세척하여 제거한 후, 세척 후 측정을 수행합니다. 최종적으로, 각 처리 조건에서 혈관내피세포 단일층에 대한 칼슘 표지 호중구의 부착 백분율 및 상대적 부착률을 결정할 수 있습니다.이 방법은 다양한 조건 하에서 미세혈관 내피의 염증성 활성화 정도를 결정할 수 있으므로, 인간 염증 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 분석법은 백혈구가 미세혈관 내피에 결합하는 것과 관련된 인간 내피 기반 질환 과정을 연구하는 도구로 활용될 가능성이 있습니다. 분석 당일에 위상차 현미경을 사용하여 세포가 세포 잔해 없이 건강한 cobblestone 형태를 보이며 100% confluency 상태인지 확인하십시오.HM VEC 단일층이 처리 준비가 되면, 세포를 HBSS로 한 번 세척한 후 염증성 작용제 포함 여부에 따라 적절한 웰에 0.3 mL의 신선한 미세혈관 내피세포 성장 배지를 첨가합니다. 여기서는 호중구를 분리하기 위해 HM VEC 폐 세포를 TNF alpha로 3시간 동안 처리합니다. Polymorph prep을 사용하기 전, 밀도 구배 용액을 상온으로 맞춥니다. 그런 다음 항응고제가 있는 상태에서 건강한 인간 지원자로부터 전혈 30 mL를 채집한 후, 15 mL 원뿔형 튜브에 Polymorph prep 5 mL 위에 혈액 5 mL를 층분리하여 얹습니다.튜브의 균형을 잘 맞춘 상태에서, 브레이크 기능을 끈 채 450 ×g, 18~22 °C에서 30분 동안 전혈을 원심 분리합니다. 그 다음, 불투명한 분홍색의 호중구 층이 섞이지 않도록 주의하며 노란색 혈장 및 PBMC 함유 층을 흡입하여 분리합니다. 호중구를 제거하려면, 피펫과 튜브를 천천히 회전시키면서 1~2 mL 세롤로지컬 피펫으로 호중구 층을 흡입합니다.여러 개의 튜브에서 호중구(neutrophils)를 30 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS를 추가하여 전체 부피를 50 mL로 맞춥니다. 세포를 원심 분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 다시 현탁합니다.호중구를 8 mL의 멸균수에 현탁하여 30초 후 적혈구를 용해시킵니다. 세포 현탁액 8 mL를 5 x 칼슘 및 마그네슘 무첨가 PBS 2 mL에 빠르게 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다. 세포를 다시 원심 분리하여 침전시킨 후, 칼슘 및 마그네슘 무첨가 PBS로 세포를 한 번 더 세척하고, 펠렛을 페놀 레드 무첨가 RPMI 1640 10 mL에 재현탁한 다음 trypan blue 배제법으로 생존 세포 수를 측정합니다.세포 수를 센 후, 재현탁된 세포를 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 phenol red가 없는 RPMI 1640을 사용하여 호중구를 mL당 200만~400만 개의 세포가 되도록 희석합니다. 그다음, 갓 제조한 calcium am 작업 용액을 세포에 3 µM 농도가 되도록 첨가합니다. 튜브를 가볍게 여러 번 뒤집어 세포 현탁액을 섞은 후, 알루미늄 호일로 튜브를 감싸 37 °C에서 배양합니다.30분 후, 표지된 중성구(neutrophils)를 원심 분리한 다음, 37 °C의 Phenol red free RPMI 1640 10 mL로 펠릿을 2회 세척합니다. 두 번째 원심 분리 전, 세포 현탁액을 40 µm 멸균 필터에 통과시켜 응집물을 제거합니다. 중성구를 37 °C의 10 mL 용액에 다시 현탁합니다.페놀 레드 프리 RPMI 1640을 사용합니다. 그런 다음 세포 수를 다시 측정하여, ml당 200만 개의 세포가 되도록 희석합니다. 이제 HM vec 단층 세포를 웰당 3% BSA가 함유된 0.22 micron 필터 멸균 페놀 레드 프리 RPMI 1640 0.5 ml로 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 배지를 흡입하여 제거하고, 48웰 플레이트의 해당 웰에 0.3 ml의 세포 현탁액에 포함된 600,000개의 칼슘 표지 호중구를 추가하거나, 호중구가 없는 페놀 레드 프리 RPMI 1640 0.3 ml를 추가합니다. 다음으로 37 °C, 5% CO2 조건에서 공동 배양물을 20분 동안 배양하고, 배양 기간이 끝나기 직전에 분광광도계를 사용하여 들뜸 파장 485 nm, 방출 파장 520 nm에서 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.그 다음 플레이트를 뒤집어 배지를 제거하고, 페이퍼 타월 위에 가볍게 눌러 남은 액체를 제거합니다. hm ve 단일층과 호중구가 포함된 웰을 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 0.5 mL/well로 5회 세척합니다. 매 세척 시마다 동일한 방식으로 PBS를 제거합니다.각 웰에 phenol red free RPMI 1640 0.3 milliliters를 넣어 교체한 후, 앞서 시연한 것과 같이 각 웰의 형광 강도를 측정하십시오. 마지막으로, 이 공식들을 사용하여 웰당 부착률과 상대적 부착률을 결정하십시오. 호중구 결합 분석(neutrophil binding assay)을 통해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻으려면, 분석 당일에 미세혈관 내피세포의 건강 상태와 합류성(confluency)이 최적이어야 합니다. Fluor star Optima 분광광도계를 사용하여 단일층의 cobblestone 외관과 전체 합류성을 확인하십시오.예를 들어, 10,000개에서 100만 개의 표지된 호중구를 분석할 때 형광 OD 520 nanometers가 선형 범위 내에 있음에 유의하십시오. 흥미롭게도, 염증성 작용제로 처리된 HM VEC 폐 단일층에 더 많은 호중구를 추가할수록 부착률이 증가합니다. P 38 map kinase는 이전에 e selectin 발현에 필수적인 것으로 입증되었습니다.TNF alpha 처리된 인간 내피 세포에서 TNF alpha의 억제는 부착된 호중구의 수를 감소시키며, 이는 분광광도계의 선형 범위 내에서 세포 수가 활용되는 한 웰에 첨가되는 호중구의 수는 임의적임을 입증합니다. 여기에서는 P 38 map kinase 억제제인 B IRB 7 96의 존재 유무에 따른 TNF alpha 처리 HM VEC 폐 세포를 이용한 호중구 부착 분석 결과가 제시되어 있습니다. 이러한 결과는 P 38 mapk 억제 후 호중구 결합의 상대적 감소가 유사함을 보여줍니다.웰당 호중구 수와 관계없이, TNF alpha 처리 후 내피세포 표면에 렉틴이 발현되며, 이는 호중구 표면에 존재하는 당분자와의 정전기적 상호작용을 통해 혈관으로부터 호중구를 포획합니다. 이 그래프에서 보듯이, TNF alpha로 활성화된 내피세포를 E selectin 항체로 사전 배양하면 호중구 결합 능력이 약 75% 감소합니다. 이는 본 분석법이 호중구 부착 단계의 매우 초기 사건들을 주로 평가한다는 것을 보여줍니다. 이 이미지들은 대조군 IgG 또는 E selectin으로 사전 배양한 후, 처리하지 않은 HM VEC 폐 단층과 TNF alpha 처리된 HM VEC 폐 단층에 결합된 칼슘 표지 호중구를 나타냅니다.이 열에는 다클론 항체의 투과광 현미경 이미지가 표시되어 있으며, 이 웰에는 플루오레세인 필터 세트를 사용하여 동일한 기준 시야를 촬영한 형광 이미지가 표시되어 있습니다. 방금 시연한 바와 같이 PBS로 세척하기 전의 전체 호중구 형광 대표 이미지가 이 웰들에 표시되어 있습니다. 방금 시연한 바와 같이 PBS로 세척한 후 부착된 호중구 형광의 대표 이미지가 표시되어 있습니다.TN FFA 처리 후의 부착 증가가 s selectin 다클론 항체 존재 하에 감소하는 점에 유의하십시오. 이 실험 절차를 수행할 때는 계대 배양 횟수가 낮은 건강한 내피 세포를 사용하고, 채집 후 2시간 이내에 전혈과 분리된 호중구를 사용하는 것이 중요합니다.

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

점막 세균 감염에 응하여 호중구 트랜스 상피 이동은 상피 손상 및 임상 질병에 기여합니다.  시험관 내 모델은 병원체, 인간 호중구 및 트랜스웰 필터에서 자란 편광 된 인간 상피 세포 층을 결합하여이 현상을 조율하는 분자 메커니즘을 해명하는 쪽으로 조사를 용이하게하는 것으로 개발되었습니다.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

배우세요 정량 체외 분석을 통해 활성화된 내피세포에 대한 호중구 부착을 측정하는 방법을. 형광 분광법을 사용하여 염증 반응 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 기여합니다.

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