Name: 세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 배우세요 나노다공성 금 미세 패턴 제작 및 세포 배양 기술을 활용한 세포-물질 상호작용 정량 분석 방법을. 현미경 영상 분석으로 생체재료 특성을 평가합니다.

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O. 쿠 르툴​​ 루스와 D. Dimlioglu는 캘리포니아 대학 실험실 비용 연구 프로그램 상 12 LR-237197에 의해 지원됩니다. P. Daggumati는 과학 및 엔지니어링 (RISE) 상에있는 캘리포니아 대학교 데이비스 연구 투자의 대학에 의해 지원됩니다. CA 채프먼은 국립 필요 원정대의 교육 대학원 지원 분야의 부서에 의해 지원됩니다. 이 작품은 UC 랩 수수료 연구 프로그램, UC 데이비스 상승 및 엔지니어링 창업 자금 UC 데이비스 대학에 의해 지원되었다.

1. 나노 다공성 골드의 제조 <ol><li> 피라 냐가 솔루션 깨끗한 기판 <ol><li> 결정화 접시와 열 ° C 열판에 65 혼합물의 100 ML 황산 (96 %)로 25 ML의 과산화수소 (30 %)를 추가합니다. 주의 : 액체 부식성하고주의하여 취급해야합니다. 그것이 폭발의 위험이 있으므로 소비 솔루션은 밀폐 용기에 저장하지 않아야합니다. </li><li> 장소 내산성 집게 10 분으로 청소를 사용하여 혼합물로 3 인치 현미경 슬라이드 1 인치. 작은 coverslips는을 배치 청소를 위해 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. 전에 용액에 침지 ~ 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. </li><li> 3 분 동안 탈 이온수 (DI) 흐르는 물에 결정화 요리 청소 샘플을 씻어. 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료. </li></ol></li><li> 스텐실 마스크 (미리 미터 스케일 패턴을 만들기 위해 이것을 사용 방법 1) 준비 <ol><li> 생검 펀치 및 / 또는 함께 펀치 250 μm의 두께의 실리콘 엘라스토머 시트는 반 경질 플라스틱 표면에 메스 지역을 절개. 질소 총 이소프로판올 건조 70 %의 가공 엘라스토머 시트를 청소합니다. </li><li> 보풀이없는 클린 수건에 구멍을 뚫은 시트를 배치하고 스텐실에 직면 시료 표면에 스텐실을 통해 피 세정 coverslips를 맞 춥니 다. </li></ol></li><li> 본 리프트 오프 레지스트 (방법 2 : 서브 밀리미터 스케일의 패턴을 만들기 위해이 옵션을 사용) <ol><li> 척 회전에 피 세정 현미경 슬라이드를 삽입하고 질소 총을 가진 모든 입자를 날려. 플라스틱 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 접착 촉진제 (헥사 메틸 디실 아젠)의 1.5 ML을 분배. 30 초 동안 5 초 1,500 rpm을 위해 500 rpm에서 연속적으로 슬라이드를 회전하여 발기인을 확산. 7 분 동안 115 ° C에서 열판에 슬라이드를 구워 5 분 동안 식히십시오. </li><li> 유리 슬라이드 위에 포토 레지스트 4 ML (3 인치 B 분배Y 1 인치). 접착 촉진제와 동일한 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 회전시켜 포토 레지스트를 확산. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 10 분 동안 식히십시오. </li><li> 15 초 동안 투명 마스크를 통해 : UV 빛을 가진 포토 레지스트 코팅 된 슬라이드 (22 mW의 / cm 2 세기)를 노출합니다. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 45 분 동안 기다립니다. 최소 3.5 분 동안 개발자에 노출 된 포토 레지스트를 용해. DI의 물로 씻어. 광학 현미경 개발 패턴을 검사합니다. </li></ol></li><li> NP-오 얇은 필름을 생산하기 위해 보증금 전구체 금속 <ol><li> 독립적으로 금,은, 크롬을 증착 할 수있는 스퍼터링 기계로 샘플을로드합니다. 금속 증착을 시작하기 전에 25 mTorr의 아르곤 처리 분위기 하에서 50 W에서 90 초 동안 샘플을 스퍼터 - 청소합니다. </li><li> 10 mTorr의 아르곤 하에서 300 W에서 10 분 동안 크롬 스퍼터. 400 W UN에서 90 초 동안 금 스퍼터데르 10 mTorr의 아르곤. 금은을 끄기 전에 소스를 약 10 초 스퍼터 끄고 100 W. 200 W와 오 전력에서 실버 10 분 동안 금과은을 공동 스퍼터 소스를 스퍼터. </li></ol></li><li> 전구체의 금속 micropatterns에를 얻을 <ol><li> 20 초 초음파의 10주기와주기 사이에 2 분 정지를위한 포토 레지스트 스트리퍼 ~ 180 ㎖에 포토 레지스트 코팅 샘플을 초음파 처리. DI 물과 샘플을 씻어 질소 총을 건조. 현미경 금속 패턴을 검사합니다. </li><li> 용착 금속을 나타 내기 위해 두 개의 핀셋을 사용하여 비 포토 레지스트 코팅 샘플에서 탄성 스텐실 껍질. </li></ol></li><li> 열처리를 통해 Dealloy 전구체 금속 및 수정 나노 <ol><li> 질산 (70 %) 170 ml의 200 ML 유리 비커를 입력하고 열판에 55 ° C에서 용액의 온도를 유지합니다. 주의 : 질산 매우 부식성이 적절한 보호 장비를 처리해야한다. </lI&gt; <li> 이전의 질산으로 침수 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. 내산성 집게를 사용하여 비커에 3 인치 현미경 슬라이드로 장소 1 인치 dealloy 그 15 분. 작은 coverslips는을 배치 마크로에 대한 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. </li><li> 연속적으로 신선한 탈 이온수로 3 회 채워진 두 개의 비커에서 그들을 담가 dealloyed 샘플을 씻어. DI 물에 샘플을 보관하고 적어도 일주일 동안 매일 신선한 DI 물과 물을 교체합니다. 사용하기 전에 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료. </li><li> 급속 열처리 장비 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 샘플을로드합니다. 200 ° C와 450 ° C와 램프 속도 사이에 온도를 조정 ~ 10 ° C / 초. 질소 대기 하에서 10 분 동안 소정의 온도로 시료를 노출합니다. 챔버 식지 (&lt;100 ° C) 및 샘플을 제거합니다. 또한, 천천히 열 트리트 위해 열판에서 샘플을 배치천만에. </li></ol></li></ol> 2. 세포 배양 <ol><li> 세포 배양을위한 NP-오 샘플을 준비 <ol><li> 장소는 NP-오 폴리스티렌 요리 샘플 및 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 처리 24 잘 조직 배양 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 각 well에 500 ㎕의 완전한 문화 미디어 (10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 Dulbecco의 수정 된 이글 매체)를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 저장 ° C와 세포를 (&lt;1 시간) 파종까지 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 유지 관리 통로, 그리고 종자 세포 <ol><li> 문화 미디어 세포가 70 %의 합류이다 통로 T75 플라스크에 관심 세포를 (이 경우 3T3-NIH의 섬유 아세포 또는 생쥐 성상)을 유지한다. </li><li> 셀과 Passaging를 들어, 술병에서 미디어를 제거하고, 10 ㎖ 인산로 두 번 세척 식염수 (PBS)는, 세포 분리 (~ 10 분)까지 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 2 ㎖를 추가 버퍼. 3 ML 신선한 매체를 추가하고3 분 동안 1,200 rpm으로 원심 분리기. 뜨는을 대기음 2 ML 매체에서 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 우물과 씨앗 25,000 세포 / 1 ML의 최종 볼륨 cm 2의 밀도에 유리 coverslips를 끌어 세포에서 보냈다 용지를 제거합니다. 샘플을 통해 세포의 균일 한 코팅을 보장하기 위해 앞으로 뒤로 좌우 문화 판을 흔들어. 매일 검사하는 동안 분석 될 때까지 세포를 품어. </li></ol></li></ol> 3. 셀 및 재료 분석 <ol><li> 골격과 핵을 시각화하는 세포를 얼룩 <ol><li> 우물에서 보낸 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 PBS에서 300 nm의 알렉사 플 루어 488 Phalloidin의의 얼룩 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으, 5 분 동안 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 PBS에서 X-100에서 그들을 permeabilize. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으 우물을 청소하도록 전송합니다. 오점 50-20 분 샘플과 어둠에 보관 상 200 μL 염색 솔루션입니다. </li><li> PBS 5 분 동안 PBS에서 DAPI 3 m로 카운터 얼룩 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS로 세포를 씻어 투명 매니큐어와 설치 미디어 및 인감 커버 유리 슬라이드에 장착하기 전에 증류수에 담근다. </li></ol></li><li> NP-의 Au 표면에 NP-오 샘플 및 세포 배양의 이미지를 얻기 <ol><li> 이미지 NP-오의 이차 전자 검출기를 사용하여 10 kV의 전자 에너지에서 50,000 X 배율과 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝 표면. </li><li> 적절한 필터 큐브 10X 배율에서 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 샘​​플에 다른 장소에서 복합 세포의 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 프로세스 이미지는 모공 세포 형태를 결정 <ol><li> ImageJ에와 해당하는 경우 각각의 채널로 분할 이미​​지 열기. 8 비트 이미지를 변환, 배경 빼기 및 중간 filteri하여 그들을 부드럽게NG. 수동으로 또는 기공 (빈 공간)와 세포 기관 / 핵을 강조하기 위해 알고리즘을 thresholding을 내장하여 임계 값을 조정합니다. </li><li> 병합 모공이나 세포를 분리하는 유역 명령을 사용합니다. 입자 분석 매개 변수를 설정하고 입자 입자의 평균 영역 및 백분율 범위의 번호를 추출하는 명령을 실행합니다. %의 커버리지를 정량화 세포 계수 및 Phalloidin의 스테인드 세포의 이미지를 DAPI 염색 세포의 이미지를 사용합니다. </li><li> 여러 이미지를 일괄 분석을 수행하기 위해 포함 된 매크로 파일을 수정합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 충돌하는 재무 적 이해 관계를 가질 수 없습니다.

우리는 마이크로 시스템즈 생물학 연구에서이 영화의 사용을 확장하는 micropattern과 NP-오 필름에 두 가지 방법을 보여줍니다. 스퍼터 코팅 금은 스퍼터링은 기존의 미세 공정과 합금 조성 및 두께는 쉽게 각 스퍼터링 건 힘의 변화에​​ 의해 제어 (금과은 대상에 대한) 될 수 있습니다와 호환이기 때문에, NP-오 패턴을 생성하는 다양한 방법 각각 증착 시간입니다. 전형적인 NP-오 필름은 200 nm의에서 2 μm의 범위를 두께. 생검 펀치와 메스를 사용하여 스텐실 방법 (방법 1, 그림 2A)는 포토 리소그래피에 대한 필요성을 우회 밀리미터 규모의 패턴을 만들 수 있습니다. 더 복잡한 패턴은 프로그래밍 레이저 절단기에 의해 생성 될 수 있습니다. 준수 실리콘 엘라스토머 스텐실 유리 표면에 자기 묻은하여 마스크와 증가하는 패턴 해상도 아래 금속 증착을 방지 할 수있다. 그러나 작은 F스텐실의 두께는 마스크의 구멍을 통해 균일 한 금속 증착을 방지로 eatures (&lt;1mm)은 일반적으...

<p class="jove_content"나노 스케일 기능&gt; 재료 연료 전지 등 다양한 응용 프로그램을 향상에 약속을 보여 주었다<sup&gt; 1</sup&gt; 센서<sup&gt; 2,3</sup&gt; 생물 의학 장치<sup&gt; 4,5</sup&gt;. 비교적 새로운 재료는 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산되는 나노 기공 금 (NP-오)입니다. NP-AU에 선구자는 가장 일반적으로 원자의 비율이 60 %에서 80 %로 은색으로 구성된 금 합금이다. 짧게 특성을 오픈 기공 나노 실버가 강한 산에 의해 용해되는 클러스터의 금 원자의 재 배열 결과입니다 (<em&gt; 예를 들어,</em&gt; 질산 70 %) 또는 전기 전위에 따라<sup&gt; 6-8</sup&gt;. 큰 유효 면적 등 여러 가지 바람직한 특성, 높은 전기 전도성, 잘 확립 된 표면 기능화 기술 및 생체 적합성에서 NP-오 혜택<sup&gt; 9</sup&gt;. NP-오에 대한 연구의 급속한 확장, NP-오의 기계적 특성에 초점을 맞출 대부분이있다하더라도<sup&gt; 10,11</sup&gt; 촉매<sup&gt; 12</sup&gt;, 그리고 생명 감지 성능<sup&gt; 13-15</sup&gt;. 바람직한 특성은 여러 가지 생물로 이용하실 매우 유용하지만<sup&gt; 16, 17</sup&gt;이 영역에있는 응용 프로그램이 제한되었습니다. 이것에 대한 한 가지 가능한 이유는 대부분의 연구는 주로 매크로 스케일의 표본을 사용하고있다 (<em&gt; 예를 들어,</em&gt; 시트, 포일 및 잉곳)와 소형 시스템에서 NP-오를 통합하는 기술은 부적당 남아있다. 사실 NP-오 영화를 채용 기존의 미세 기술을 사용하여 예제의 소수에 불과있다<sup&gt; 16-20</sup&gt;. 소형화 기술과 새로운 생물 의학 도구에 대한 필요성의 출현으로, 그것은 장치에 새로운 자료를 통합 할 수있을 중요한되고있다. 이는 일반적으로 물질이 퇴적 기존의 미세 기술을 모방 할 수 있어야합니다. 또한, 세포 물질의 상호 작용의 신속한 정량은 새로운 재료의 생체 적합성을 평가하기 위해 일반적으로 필요합니다. 본 논문의 목적은 micropattern과 NP-오 영화에 대한 기본적인 기술을 설명하고 나노 구조 및 디지털 이미지 프로세싱을 통해 세포 물질의 상호 작용을 모두 정량화하는 것입니다.</p

<table><tbody><tr><td>골드 타겟</td><td>Lesker</td><td>EJTAUXX403A2</td><td>np-Au</td></tr><tr><td>크롬 타겟</td><td>Lesker</td><td>EJTCRXX353A2</td><td>접착 층</td></tr> 생산을위한 합금<tr>의 전구체<td>실버 타겟</td><td>Lesker</td><td>EJTAGXX403A2</td><td>np-Au 도자기 보트 생산을위한 합금의 전구체</td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>작은 샘플 질산 처리에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43873</td> 황산 <td>탈합금에 70%에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>J.T Baker</td><td>7664-93-9</td><td>피라냐 청소에 96%에서 사용</td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>J.T Baker</td><td>7722-84-1</td><td>피라냐 청소에 30%에서 사용</td></tr> 생<tr><td>검 펀치</td><td>Ted Pella</td><td>150xx</td><td>여러 크기로 사용</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 시트</td><td>Rogers Corporation</td><td>HT 6240</td><td>여러 두께로 사용 가능</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td>포지티브 레지스트</td></tr><tr><td>Microposit MF CD26</td><td>Shipley</td><td>38490</td><td>포지티브 포토레지스트 개발자</td></tr><tr><td>PRS 3000</td><td>JT Baker</td><td>JT6403-5</td><td>포지티브 포토레지스트 스트리퍼</td></tr><tr><td>원형 유리 커버 슬립 (12mm)</td> <td>Ted Pella</td><td>26023</td><td>금속 패턴 및 세포 배양의 기판으로 사용</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 (1 x 3 인치)</td> <td>Ted Pella</td><td>26007</td><td>금속 패턴의 기판으로 사용</td></tr><tr><td>Kapton 폴리이 미드 테이프</td><td>VWR</td><td>82030-950</td><td>엘라스토머</td></tr><tr><td>투명 마스크</td> 확보에 사용 <td>출력 도시</td><td></td><td>포토 리소그래피에 사용 <a href="http://www.outputcity.com/" target ="_blank">http://www.outputcity.com/ </a></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>유리 표면 활성화에 사용</td></tr><tr><td>스퍼터링 머신</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>LAB18</td><td>금속 증착에 사용</td></tr></tbody></table>

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

수십 나노 미터의 기능 크기를 가진 나노 구조 재료는 연료 전지, 바이오 센서, 생물 의학 장치 코팅 및 약물 전달 도구를 포함한 여러 기술의 성능을 강화했다. 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산 된 나노 기공 금 (NP-오)는 큰 효과 표면적, 높은 전기 전도도와 촉매 활성을 보여 비교적 새로운 소재입니다. 이러한 속성은 NP-오에게 과학 사회 매력적인 소재를 만들었습니다. NP-오에 대한 대부분의 연구는 거시적 규모의 표본을 고용하고 물질과 촉매, 센서 응용 프로그램의 기초 과학에 초점을 맞 춥니 다. 매크로 스케일의 표본은 생물 의학 장치를 포함하여 소형 시스템에서 NP-오의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 처음에 딱딱한 기판 micropattern과 NP-오 박막의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은, 간편하게 조절할를 밀리미터 규모의 NP-오 패턴을 만들기 위해 직접 제작 한 스텐실 마스크를 고용E는 두 번째 방법은 본 서브 밀리미터 스케일 패턴 리프트 오프 리소그래피를 사용합니다. NP-오 박막 스퍼터링 증착 공정에 의해 얻을 수있다, 그들은 마이크로에 손쉬운 통합함으로써 의무가 기존의 미세 기술과 호환됩니다. 이러한 시스템은 높은 효과적인 표면적, 전기 전도도, 및 금 - 싸이 기반 표면의 바이오 콘쥬 게이션에서 해당 혜택을 전기적 주소 바이오 센서 플랫폼 (가) 있습니다. 우리는 몇 가지 바이오 센서에 대한 중요한 성능 매개 변수 포유 동물 세포와 NP-오의 상호 작용을 정량화 세포 배양, 면역 염색, 및 이미지 처리 기술을 설명합니다. 우리는 여기에 설명 된 기술은 다양한 길이 비늘 및 바이오 센서, 에너지 저장 시스템, 촉매 등 다양한 애플리케이션의 플랫폼에서 NP-오의 통합을 지원할 것으로 기대합니다.

그림 1은 배양 세포를 NP-오 패턴을 만드는 나노 구조를 정량화하고, 세포의 형태학의 특성을 포함하여 주요 절차 단계를 설명합니다. 그림 2a에서와 같이 탄성 스텐실 (TOP) 아래 이미지에서와 같이 NP-오 패턴을 만드는 데 사용됩니다. 그림 2B는 일괄 처리 시편 도자기 보트의 사진입니다. 그림 2C는 용착 금속 패턴의 색 변화를 표시 이전과 마크로 후. 은빛 마무리 (마크로 이전)는 실버가 풍부한 합금 내용 때문이다. 마크로에, 영화는 눈에 띄게 오렌지 - 갈색 색조를 얻습니다. 그림 2D는 금속의 포토 리소그래피 패터닝에 의해 생성 된 미세한 기능을 보여줍니다. 다른 기공 형태소 그림 3에서와 같이 NP-오 영화 9의 열 처리에 의해 얻을 수 있습니다. 단면 이미지 (그림URE 3) 필름은...

우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 나노 다공성 금 마이크로 패턴을 제작하고, 이것이 세포 배양과 호환됨을 입증하는 것입니다. 우선 스텐실 또는 포토리소그래피 마스크를 제작하여 이를 달성합니다. 두 번째 단계는 마스크를 통해 금과 은을 공동 스퍼터링하여 나노 다공성 금을 위한 전구체 합금 패턴을 형성하는 것입니다.다음으로, 질산 내에서 금-은 합금 패턴을 탈합금화하여 나노 다공성 금 코팅을 생성합니다. 마지막 단계로, 나노 다공성 금 마이크로 패턴 위에 세포를 배양하고 면역 염색을 수행하며, 최종적으로 형광 및 주사 전자 현미경과 이미지 분석을 결합하여 세포-재료 상호작용을 정량화합니다. 탄소 나노튜브와 같은 다른 나노 구조 코팅 생성 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 나노 다공성 금이 미세 가공 호환성, 높은 유효 표면적, 티올 기반 화학을 이용한 기능화의 용이성, 전기 전도성 및 생체 적합성을 갖추고 있다는 점입니다.이 방법은 재료의 나노 구조가 전기적, 기계적, 생물학적 및 화학적 성질에 미치는 영향과 같이 재료 과학 및 바이오공학 분야의 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 나노 구조가 세포 형태에 미치는 영향에 대한 통찰을 제공합니다. 아울러 바이오센서, 약물 전달 시스템 및 에너지 저장 플랫폼의 개발과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.먼저 1인치 x 3인치 크기의 현미경 슬라이드와 작은 커버 슬립을 피라냐 용액(piranha solution)으로 세척하여 이 절차를 시작합니다. 작은 커버 슬립을 포슬린 면역 염색 보트에 넣고, 보트와 현미경 슬라이드를 피라냐 용액에 담급니다. 세척 절차에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 세척 후, 시료를 결정화 접시로 옮기고 DI water로 3분 동안 헹굽니다.샘플을 보풀 없는 수건 위에 놓고 질소 건(nitrogen gun)으로 건조하여 밀리미터 규모의 패턴을 생성합니다. 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 250 micron 두께의 실리콘 엘라스토머 시트를 펀칭합니다. 처리된 엘라스토머 시트를 70% isopropanol에 담가 세척한 후 질소 건으로 건조합니다.그 다음 펀칭 시트를 보풀 없는 수건 위에 놓고, 세척된 커버 슬립을 스텐실 위에 정렬하되 샘플 표면이 스텐실을 향하게 합니다. 커버 슬립이 부착된 스텐실을 캐리어 웨이퍼로 옮겨 서브 밀리미터 규모의 패턴을 생성합니다. 세척된 현미경 슬라이드를 스피닝 척 위에 놓고 질소 건으로 미세 입자를 불어내어 제거합니다.유리 슬라이드 위에 1.5 milliliters의 hexa methyl dilane을 분주합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 슬라이드를 500 RPM에서 5초 동안, 이어서 1500 RPM에서 30초 동안 회전시켜 hexa methyl dilane을 도포합니다. 완료되면 핫플레이트에서 115 degrees Celsius로 7분 동안 베이크한 후, 5분 동안 식힙니다.다음으로, 4 mL의 양성 감광액(positive photoresist)을 유리 슬라이드 위에 분주합니다. 앞서 설명한 조건을 이용하여 슬라이드를 회전시켜 감광액을 도포합니다.슬라이드를 핫플레이트에서 115 °C로 1.5분 동안 가열하고, UV 노광 및 베이킹 후 꺼냅니다. 슬라이드를 positive photoresist 용액에 담가 노광된 포토레지스트를 현상합니다.레지스트를 최소 3.5분 동안 현상합니다. 현상이 완료되면 슬라이드를 DI water로 충분히 헹구고, 광학 현미경으로 현상된 패턴을 검사합니다. 다음으로, 금, 은, 크롬을 독립적으로 증착할 수 있는 스퍼터링 장비에 샘플을 적재합니다.금속 증착을 시작하기 전, 25 millitorr Argonne 처리 분위기에서 50 watts로 90초 동안 샘플을 세척합니다. 이후 10 millitorr Argonne sputter chrome 조건에서 300 watts로 10분 동안 증착합니다. 그다음 400 watts로 90초 동안 금을 스퍼터링하고, 이어서 금과 은을 10분 동안 공동 스퍼터링하며 이때 은은 200 watts, 금은 100 watts로 설정합니다. 은 스퍼터 소스를 끄기 약 10초 전에 금 스퍼터 소스를 먼저 끕니다.스퍼터링 장치에서 샘플을 꺼냅니다. 약 180 milliliters의 양성 감광제 제거제(positive photoresist stripper)에 넣고, 사이클 사이에 2분간의 휴지기를 두어 22nd sonication으로 10회 초음파 처리합니다.작업이 끝나면 샘플을 di water로 헹구고 질소 건으로 건조합니다. 현미경으로 금속 패턴을 검사합니다. 그런 다음, 두 개의 핀셋을 사용하여 비포토레지스트 코팅된 샘플에서 엘라스토머 스텐실을 벗겨내어 증착된 금속을 확인합니다.질산에 침지시키기 전, 소형 커버슬립을 10 W의 공기 플라즈마로 30초 동안 처리합니다. 현미경 슬라이드를 55 °C의 70% 질산이 담긴 비커에 15분 동안 담가 탈합금화합니다. 탈합금화가 완료되면, 샘플을 초순수(di water)가 담긴 비커에 각각 세 번씩 차례대로 침지시켜 헹굽니다.샘플을 보풀 없는 타월 위에 놓고 질소 건(nitrogen gun)으로 건조시킵니다. 핫플레이트의 온도를 150°C에서 300°C 사이로 조절합니다. 그런 다음, 급격한 온도 변화를 최소화하기 위해 샘플을 가열된 표면 위로 천천히 내립니다.5분 후, 샘플을 핫플레이트에서 꺼내 식힙니다. 나노 다공성 금 샘플을 폴리스티렌 접시에 넣고 10W의 전력으로 30초 동안 공기 플라즈마 처리를 합니다. 그 다음, 샘플을 24웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.각 웰에 500 µL의 완전 배양액을 첨가합니다. 세포를 파종할 때까지 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에 보관하십시오. 마우스 성상교세포는 배양액이 담긴 T 75 플라스크에서 유지하십시오.세포의 밀도가 70%에 도달하면, 먼저 기존 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하여 계대 배양합니다. 계대 조건에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 웰에서 사용한 배지를 흡입하여 제거하고 세포를 유리에 접종합니다.제곱센티미터당 25,000 cells의 밀도로 커버슬립에 분주하고 최종 부피를 1 mL로 맞춥니다. 배양 플레이트를 흔들어 샘플 위에 세포가 균일하게 도포되도록 하고, 분석 준비가 되면 배양 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 웰에서 폐배지를 제거하고 PBS로 2회 세척합니다.세포를 PBS 내 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 두 번 세척한 후, PBS 내 0.1% Triton X 100 500 µL로 5분 동안 투과화합니다. PBS 세척을 두 번 반복하고 세포를 깨끗한 웰로 옮깁니다. 샘플에 염색액 80 µL를 도포하고 알루미늄 호일로 덮어 20분 동안 보관합니다.PBS로 다시 한 번 세척한 후, PBS에 희석된 3 nM의 DPI로 5분 동안 세포를 대조 염색합니다. 세포를 PBS로 한 번 더 세척하고 슬라이드 글라스에 고정합니다. 슬라이드에 마운팅 용액을 덮고 투명 매니큐어로 밀봉합니다.이차 전자 검출기를 사용하여 10 kV의 전자 에너지와 50,000배 배율의 주사 전자 현미경으로 나노 다공성 금 표면을 관찰합니다. 그 후, 적절한 필터 큐브가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 10배 배율로 시료의 여러 지점에서 복합 세포 이미지를 캡처합니다. ImageJ에서 이미지를 엽니다. 이미지를 개별 채널로 분리합니다.이를 8비트로 변환하십시오. 배경을 제거하고 중앙값 필터링(median filtering)을 통해 평활화합니다. 그런 다음 임계값을 수동으로 조정하여 기공, 세포체 및 핵을 강조하십시오.watershed 명령을 사용하여 병합된 기공 또는 세포를 분리하십시오. 입자 분석 파라미터를 설정하고 명령을 실행하여 입자 수, 평균 면적 및 입자 점유율을 추출하십시오. 마지막으로, 포함된 매크로 파일을 수정하여 여러 이미지에 대한 일괄 분석을 수행하십시오.d 합금화 전후의 증착된 금속 패턴의 색상 변화가 여기에 표시되어 있습니다. 은색 마감은 합금화 시 은 함량이 높은 합금 성분으로 인해 나타납니다. 박막은 눈에 띄는 오렌지빛 갈색 색조를 띠게 됩니다.포토리소그래피로 제작된 더 세밀한 특징들이 여기에 나타나 있습니다. 금속의 패턴 형성 과정입니다. 나노 다공성 금 박막의 열처리를 통해 다양한 다공성 형태를 얻을 수 있습니다.단면 이미지를 통해 필름 두께 전체에 걸쳐 탈합금이 균일하게 일어났는지 확인할 수 있습니다. 주사 전자 현미경 이미지는 이진 이미지로 세그멘테이션하여 보이드의 크기와 피복률을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 결과물을 생성하는 코드는 JoVE 웹페이지에서 다운로드할 수 있습니다.나노 다공성 금 표면에서 배양된 부착성 마우스 성상교세포의 대표적인 형광 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 이미지의 개별 채널을 분리하고 세그먼트화하여 세포와 재료 간의 상호작용을 분석하기 위한 이진 이미지를 생성할 수 있습니다. 세그먼트화된 세포골격 이미지는 세포 면적과 표면 피복도를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.분할된 세포핵 이미지는 세포 계수에 유용합니다. 이러한 결과물을 생성하는 코드는 JoVE 웹페이지에서 다운로드할 수 있습니다. 여기에는 PO 필름 접착 불량, 다공성 부재 및 과도한 열처리 등 나노 다공성 금 구조 제작 과정에서 발생한 실패 사례에 대한 시각적 요약이 제시되어 있습니다.이 절차 이후, 다른 방법으로는 나노구조의 세포 접착 및 유전자 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기화학적 특성 분석, 포레스트 현미경 관찰, 세포 용해 및 PCR을 수행하는 것이 제안됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 나노포어 금 패턴을 제작하고 현미경 이미지의 디지털 분석을 통해 세포와의 상호작용을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 결과. 질산, 황산 및 과산화수소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용을 포함한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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