세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

이 절차의 전반적인 목표는 나노 다공성 금 마이크로 패턴을 제작하고 세포 배양과의 호환성을 입증하는 것입니다. 이 작업은 먼저 스텐실 또는 포토 리소그래피 마스크를 만들어 수행됩니다. 두 번째 단계는 마스크를 통해 금과 은을 공동 스퍼터링하여 나노 다공성 금의 전구체 합금을 패턴화하는 것입니다.

다음으로, 금은 합금 패턴은 질산에서 합금되어 나노 다공성 금 코팅을 생성합니다. 마지막 단계는 나노 다공성 금 마이크로 패턴을 통해 세포를 배양하고 면역 염색을 통해 궁극적으로 형광 및 이미지 분석과 결합된 주사 전자 현미경을 사용하여 세포 물질 상호 작용을 정량화하는 것입니다. 탄소 나노 튜브와 같은 나노 구조 코팅을 만드는 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 나노 다공성 금이 미세 가공 호환성, 높은 유효 표면적, 타일 기반 화학을 통한 기능화 용이성, 전기 전도성 및 생체 적합성의 이점을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 재료 나노 구조가 전기적, 기계적, 생물학적, 화학적 특성에 미치는 영향과 같은 재료 과학 및 생명 공학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 세포 형태학에 대한 나노 구조의 영향에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한 바이오센서, 약물 전달 시스템 및 에너지 저장 플랫폼 개발과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 1인치 x 3인치 현미경 슬라이드와 작은 커버 슬립을 피라냐 용액으로 세척하고, 작은 커버 슬립을 도자기 면역 염색 보트에 넣고, 보트와 현미경 슬라이드를 피라냐 용액에 담그십시오. 청소 절차에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 세척 후 샘플을 결정화 접시로 옮기고 3분 동안 디워터로 헹굽니다.

보푸라기가 없는 수건에 샘플을 놓고 질소 건으로 건조시켜 밀리미터 스케일 패턴을 만듭니다. 250미크론 두께의 실리콘 엘라스토머 시트를 생검 펀치로 펀칭합니다. 가공된 엘라스토머 시트를 70% 이소프로판올에 담궈 세척한 다음 질소 건으로 건조시킵니다.

그런 다음 보푸라기가 없는 수건 위에 펀치 시트를 놓고 청소한 커버 슬립을 스텐실 위의 샘플 표면이 스텐실을 향하도록 정렬합니다. 커버 슬립이 있는 스텐실을 캐리어 웨이퍼로 옮겨 밀리미터 미만의 스케일 패턴을 만듭니다. 청소한 현미경을 놓고 회전하는 척을 밀어 넣고 질소 건으로 미립자를 불어냅니다.

1.5ml의 헥사 메틸 딜란을 유리 슬라이드에 분배합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 슬라이드를 500RPM으로 5초 동안, 1500RPM으로 30초 동안 연속적으로 회전시켜 헥사 메틸 딜란을 펴 바릅니다. 완료되면 섭씨 115도의 핫 플레이트에서 슬라이드를 7분 동안 구운 다음 5분 동안 식힙니다.

다음으로, 4밀리리터의 포지티브 사진을 분배합니다. 유리 슬라이드에 저항하십시오. 앞에서 설명한 조건을 사용하여 슬라이드를 회전하여 포토 레지스트를 펼칩니다.

슬라이드를 섭씨 115도의 핫플레이트에 1.5분 동안 굽고 UV 노출 및 베이킹 후 제거합니다. 노출된 사진을 디졸브합니다. 슬라이드를 포지티브 사진에 담그어 저항하십시오.

최소 3.5분 동안 현상액에 저항하십시오. 완료되면 슬라이드를 DI 물로 철저히 헹구고 광학 현미경으로 현상된 패턴을 검사합니다. 다음으로, 금, 은 및 크롬 스퍼터를 독립적으로 증착할 수 있는 스퍼터링 기계에 샘플을 로드합니다.

25 millitorr 아르곤 처리 분위기에서 50 와트에서 90 초 동안 샘플을 세척한 후 300 와트에서 10 분 동안 10 밀리토르 아르곤 스퍼터 크롬 아래에서 금속 증착을 시작합니다. 그런 다음 400와트에서 90초 동안 금을 스퍼터링한 다음 200와트에서 은과 100와트에서 금을 사용하여 10분 동안 금과 은을 공동 스퍼터링합니다. 실버 스퍼터 소스를 끄기 약 10초 전에 골드 스퍼터 소스를 끕니다.

스퍼터링 기계에서 샘플을 제거한 후 스퍼터링 기계에서 샘플을 제거하십시오. 약 180 밀리리터의 긍정적 인 사진으로 초음파 처리하십시오. 22 차 초음파 처리의 10 사이클 동안 스트리퍼를 레지스트 하고 사이클 사이에 2 분의 일시 중지를

완료되면 샘플을 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. 현미경으로 금속 패턴을 검사합니다. 그런 다음 두 개의 핀셋을 사용하여 비포토 레지스트 코팅 샘플에서 엘라스토머 스텐실을 벗겨내면 증착된 금속이 드러납니다.

작은 커버 슬립을 질산에 담그기 전에 10 초 동안 30 와트의 공기 플라즈마로 처리하십시오. De 합금 현미경 슬라이드를 섭씨 70도에서 55% 질산이 담긴 비이커에 15분 동안 담그십시오. 탈합금화가 완료되면 샘플을 디워터 비커에 각각 세 번씩 연속적으로 담가 헹굽니다.

보푸라기가 없는 수건에 샘플을 놓고 질소 건으로 말리십시오. 핫플레이트의 온도를 섭씨 150도에서 300도 사이로 조정하십시오. 그런 다음 급격한 온도 변화를 최소화하기 위해 샘플을 뜨거운 표면으로 천천히 내립니다.

5분 후 핫 플레이트에서 샘플을 제거하여 식힙니다. 나노 다공성 금 샘플을 폴리스티렌 접시에 넣고 10와트의 공기 플라즈마로 30초 동안 처리합니다. 그런 다음 샘플을 24개의 웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.

각각에 500마이크로리터의 완전한 배양 배지를 추가합니다. 세포를 파종할 때까지 섭씨 37도, 5%CO2의 가습 인큐베이터에 플레이트를 잘 보관하십시오. 배양 배지를 사용하여 T 75 플라스크에서 쥐 성상세포 세포를 유지합니다.

세포가 70% 집중되면 먼저 오래된 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하여 세포를 계파합니다. passeng 조건에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거한 후 웰에서 사용한 배지를 흡인하고 세포를 유리에 파종합니다.

덮개는 25, 평방 센티미터 당 000 세포의 조밀도에 1 밀리리터의 마지막 양과 더불어 미끄러진다. 배양 플레이트를 흔들어 샘플 위에 세포가 균일하게 코팅되도록 하고 세포를 분석할 준비가 되면 배양 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 우물에서 사용한 매체를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다.

세포가 PBS의 4% 파라 포름알데히드에 고정되고 두 번 세척되면 PBS에서 0.1% Triton X 100의 500마이크로리터에 5분 동안 투입합니다. PBS 세척을 두 번 반복하고 세포를 깨끗한 우물로 옮깁니다. 80마이크로리터의 염색 용액을 샘플에 주입하고 알루미늄 호일로 덮여 20분 동안 보관합니다.

PBS를 한 번 더 세척한 후 PBS에서 3나노몰의 DPI로 5분 동안 세포를 counterstain합니다. PBS로 세포를 한 번 더 세척하고 디에 담근 다음 유리에 세포를 장착합니다. 장착 미디어로 슬라이드를 덮고 선명한 매니큐어 이미지로 밀봉합니다.

50, 2 차 전자 검출기를 사용하여 10 킬로 볼트 전자 에너지에서 000 x 배율을 가진 주사 전자 현미경을 가진 나노 다공성 금 표면. 그런 다음 적절한 필터 큐브와 함께 10배 배율의 도립 형광 현미경을 사용하여 샘플의 여러 지점에서 복합 세포 이미지를 캡처합니다. 이미지 J.Split에서 이미지를 개별 채널로 엽니다.

8 입찰가로 변환합니다. 배경을 빼고 중앙값 필터링으로 매끄럽게 합니다. 그런 다음 임계값을 수동으로 조정하여 기공, 세포체 및 핵을 강조 표시합니다.

watershed 명령을 사용하여 병합된 기공 또는 셀을 분리합니다. 입자 분석 매개변수를 설정하고 명령을 실행하여 입자 수, 평균 면적 및 입자별 적용 비율을 추출합니다. 마지막으로, 포함된 매크로 파일을 수정하여 여러 이미지의 배치 분석을 수행합니다.

d 합금 전후에 증착된 금속 패턴의 색상 변화가 여기에 표시됩니다. 은빛 끝은 합금 위에 은이 풍부한 합금 함량 때문입니다. 필름은 눈에 띄게 주황색 갈색 색조를 띱니다.

여기에 표시된 것은 사진 석판화로 생성된 더 미세한 기능입니다. 금속의 패터닝. 다양한 불량 형태는 나노 다공성 금 필름의 열처리에 의해 얻어질 수 있습니다.

단면 이미지는 필름이 필름 두께를 통해 균일하게 탈합금되었는지 여부를 보여줍니다. 주사 전자 현미경 이미지는 공극에 의한 크기와 백분율 커버리지를 결정하기 위해 이진 이미지로 분할할 수 있습니다. 이 출력을 생성하는 코드는 JoVE 웹 페이지에서 다운로드할 수 있습니다.

나노 다공성 금 표면에서 배양된 부착 쥐 성상교세포 세포의 대표적인 형광 이미지가 여기에 그려져 있습니다. 이미지의 개별 채널을 분할 및 분할하여 세포 물질 상호 작용을 분석하기 위한 이진 이미지를 생성할 수 있습니다. 분할된 세포골격 이미지는 세포 면적 및 표면 범위를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

분절된 세포핵 이미지는 세포 계수에 유용합니다. 이러한 출력을 생성하는 코드는 JoVE 웹 페이지에서 다운로드할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 PO 필름 접착, 다공성 부재 및 과도한 열처리를 포함한 나노 다공성 금 구조 제작의 실패에 대한 시각적 요약입니다.

이 절차에 따라 다른 방법은 산림 현미경 검사에서 전기화학적 특성 분석, 세포 용해 및 PCR을 수행하여 나노 구조 세포 접착 및 유전자 발현의 영향과 같은 추가 질문에 추가로 답변할 수 있음을 제안합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 나노기공 금 패턴을 생성하고 현미경의 디지털 이미지 분석을 통해 세포와의 상호 작용을 정량화하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 결과. 질산, 황산 및 과산화수소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.