Name: 기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 배우세요 3D 자동 추적 시스템을 사용하여 Danio rerio 개체와 무리의 운동 패턴을 분석하는 방법을. 이 계산 방법은 신경과학 및 행동 연구에서 약물 효과와 사회적 특성을 정확하게 측정하는 데 활용됩니다.

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저자는 인정하지 않습니다.

<ol><li>Brennan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavioural+assays+of+translational+relevance+for+the+study+of+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease.</a> Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).</li>
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</ol>

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu 및 Wei Weng은 이 기사에 사용된 추적 시스템을 생산하는 뉴욕 론콘코마에 있는 xyZfish의 직원입니다.

여기에 표시된 실험 절차를 통해 개별 제브라피쉬, 제브라피쉬 쌍(예: 짝짓기 또는 공격성을 연구하기 위해) 및 제브라피쉬 떼(대표적인 예에 표시된 대로)를 기록할 수 있습니다. 이 시스템은 3D(수직 및 수평) 분포, 운동학적 특성(예: 속도, 가속도, 회전 각도) 및 사회적 매개변수(예: 사회적 응집력)에 대한 정보를 동시에 얻는 데 특히 적합합니다. 다음에는 실험을 계획할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제가 나열되어 있습니다.
실험 절차에 따라 다양한 행동 시스템을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 신공포증(즉, 새로운 환경에 대한 두려움)을 탐색하려면 사전 습관화 없이 제브라피시를 관찰 탱크에 도입한 직후(물이 가라앉아 소음이 줄어들 때까지 몇 초만 기다린 후) 녹음을 시작해야 합니다11,17,37. 반면에 일부 연구 주제는 예를 들어 경보 페로몬의 효과를 연구할 때 제브라피쉬가 잘 습관화되어야 할 수도 있습니다16. 제브라피쉬 그룹을 연구할 때 실험자는 소프트웨어가 태그 전환을 최소화하지만 현재로서는 개별 제브라피쉬를 전체적으로 따라가는 것이 불가능하다는 점을 알고 있어야 합니다. 이것은 사회적 결속에 중점을 두는 떼 연구에도 중요하지 않지만 공격성이나 짝짓기를 탐구할 때는 중요합니다. 태그를 수동으로 재할당하는 것은 옵션이지만 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.
관찰 용기와 관찰실의 벽 색상은 제브라피쉬의 행동에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 흰 벽은 혐오 반응을 유도하는 것으로 설명되었습니다36, 37. 다른 색상을 시도할 때 두 가지 사항을 염두에 두십시오: 1) 전면 벽(즉, 카메라에 가장 가까운 벽)이 투명하게 유지되고 뚜껑(사용하는 경우)도 투명해야 합니다. 2) 이전에 사용한 적이 없는 색상을 선택할 때 먼저 제브라피쉬와 배경의 대비가 녹화에 적합한지 여부를 결정합니다. 테스트 실행을 수행합니다. 녹화를 위한 카메라 설정(2.5 및 2.6단계에서 설명한 대로 게인, 셔터, 빨간색 및 파란색)과 궤적 재구성 설정(예: 3.3, 3.5, 3.11 및 3.12단계에서 설명한 대로 색상 및 크기 임계값)을 변경하면 큰 차이를 만들 수 있습니다. 다시 말하지만, 시스템에 대한 경험은 무엇이 가능한지 결정하는 데 큰 도움이 될 것입니다.
실험의 목적에 따라 다양한 특성(예: 스펙트럼, 강도)을 가진 광원이 바람직할 수 있습니다. LED 막대는 쉽게 교체할 수 있습니다. 빛이 용기의 모든 부분에 닿는지 확인하십시오.
실험에서 제브라피쉬가 관찰 용기에 몇 시간 동안 남아 있어야 하는 경우 통기해야 합니다. 클립을 사용하여 오른쪽 뒤쪽 모서리에 에어 튜브를 부착할 수 있습니다. 컴퓨터 화면에서 클립이 녹음을 방해하지 않는지 확인하십시오. 제브라피쉬는 결코 시야에서 숨겨져 있지 않다는 것입니다. 그림 2A 및 2B 에서 검은색 클립은 상단 보기에서 볼 수 있습니다. 이상적으로는 녹음 전이나 녹음 사이에 통풍이 제공되어야 하지만 소음을 방지하기 위해 녹음 중에는 제공되지 않아야 합니다. 또한 강한 통기를 켜거나 끄면 제브라피쉬가 놀랄 수 있습니다.
실험을 위해 제브라피쉬를 밤새 용기에 보관해야 하는 경우 제브라피시가 튀어나오는 것을 방지하기 위해 관찰실을 투명한 뚜껑으로 덮는 것이 유용합니다(이는 매우 흔한 일입니다). 녹화 전에 덮개를 제거하지 않은 경우(제브라피시를 방해하지 않도록) 다음 두 가지 사항을 고려하십시오: 1) 광원의 거울 이미지가 녹화를 방해하지 않는지 확인하십시오(예 : 광원을 이동하거나 빛을 최소한으로만 반사하는 뚜껑을 선택함). 2) 특히 이 경우 통기도 제공되어야 하기 때문에 밤새 사용하면 뚜껑에 김이 서리게 될 수 있음을 고려하십시오. 이를 줄이는 한 가지 방법은 작은 구멍이 있는 뚜껑을 선택하는 것입니다.
일부 실험의 경우 약물을 투여하기 전에 제브라피쉬의 기본 행동을 결정하는 것이 필수적일 수 있습니다. 이 경우 튜브(위에서 설명한 폭기 튜브와 유사)를 통해 세션 사이에 약물을 추가할 수 있습니다.
여기서는 제브라피쉬(Danio rerio)를 기록하는 데 중점을 두었지만 물론 다른 어종도 시스템으로 기록할 수 있습니다. (어린) 금붕어(Carassius auratus), 호랑이 미늘(Barbus tetrazona) 및 녹색 검꼬리(Xiphophorus helleri)의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다.
마지막으로, 관측 탱크의 다른 차원은 주로 가능하다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 훨씬 더 큰 관측 컨테이너를 사용할 때 시스템을 재구성하고 공간 해상도와 시간 해상도 사이의 적절한 균형을 찾아야 합니다. 또한 컨테이너의 모양은 직육면체여야 합니다. 제브라피쉬 또는 기타 실험 대상의 수는 이론적으로 무제한입니다. 그러나 태그 교환은 주제 수에 따라 증가합니다.

얼룩말은 생물학 및 약리학 연구의 중요한 모델이 되었습니다1-3. 개별 제브라피시와 제브라피시 떼의 움직임과 공간 분포 패턴을 추적하는 것은 매우 중요합니다. 이전 연구에서는 기록된 이미지를 기반으로 수동 정량화를 적용합니다4. 이제 2D 자동 비디오 추적 시스템이 일반적으로 사용됩니다5. 그러나 제브라피시를 비롯한 많은 수생 및 비수생 동물이 3차원 공간에서 움직이기 때문에 3D 시스템에 대한 관심이 높아지고 있습니다6. 설명된 3D 시스템은 20077년에 처음 발표되었습니다. 기술 세부 사항 및 다른 시스템과의 비교는8을 참조하십시오. 다른 시스템과 비교했을 때 이 시스템의 기본적인 장점은 미러링 시스템을 사용하여 2개(선택적으로 3개)의 동기 및 독립 보기를 획득하고 2단계 보정 프로토콜을 사용한다는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 스테레오 시스템의 3D 형상(카메라와 미러에 의해 형성됨)이 보정됩니다. 두 번째 단계에서는 빛의 굴절로 인해 발생하는 비선형 오류가 수정됩니다. 수생 동물을 연구할 때 보정하지 않고 방치하면 빛 굴절의 영향이 상당할 수 있습니다. 지금까지 발표된 다른 시스템(심지어 최신 개발9)은 2단계 교정 절차를 생략합니다. 물체 식별, 다중 물체 추적을 통한 폐색, 지깅 노이즈 등에 대한 기술적 세부 정보. 독자는 원본 출판물8,9를 참조한다. 이 시스템은 불안과 유사한 행동 반응10,11, 얕은8,11,12 및 예비 연구에서 제브라피시13의 적대적 행동에 대한 연구를 위해 검증되었습니다. 또한 다른 물고기 종(금붕어8, 쇠꼬리, 호랑이 미늘)과 생쥐9에 대해서도 테스트되었습니다.
다음에서는 시스템 보정 및 사용을 위한 프로토콜이 설명되며, NMDA 수용체 비경쟁 길항제 MK-801이 제브라피시에 미치는 영향을 테스트하는 실험 결과를 대표적인 예로 제시하여 시스템으로 얻을 수 있는 데이터 유형을 보여줍니다.
자연 환경과 수족관 모두에서 제브라피쉬는 일반적으로14번 떼에서 수영합니다. 떼를 지어 다니는 것에 대한 선호도는 사육, 성별, 식량 가용성과 같은 몇 가지 요인에 의존하는 것으로 보인다14,15. 흥미롭게도, 암초에 있는 개별 제브라피시 사이의 거리는 경보 페로몬16 또는 참신함11과 같은 잠재적 위험 신호가 존재할 때 작아집니다. 따라서 떼를 짓는 패러다임은 불안 완화제를 테스트하는 데에도 사용되고 있습니다17. 지배 계층(Dominance hierarchies)18과 사회적 학습(social learning)19은 제브라피시 행동의 흥미로운 측면이다. 고도로 발달된 사회적 행동 특성으로 인해 제브라피쉬는 자폐증 연구에서도 관심을 갖게 되었습니다20,21.
MK-801은 제브라피시5,22,23의 사회적 행동을 변화시키는 것으로 보고되었으며, 이는 포유류24에 대한 영향을 연상시킵니다. 그러나 MK-801은 다른 행동(예: 수영 행동, 억제 회피 및 장소 선호25-27)에도 많은 다른 영향을 미칩니다. 따라서 초기 실험에서는 기본 관찰에서 가능한 한 많은 정보를 얻는 것이 중요합니다. 이것은 보다 표적화된 실험을 설계하기 위한 기초를 제공할 것입니다.
녹음 장치 및 소프트웨어 조사
현재 구성에서는 제브라피쉬를 담고 있는 관찰 컨테이너(25 cm x 25 cm x 18 cm, L x W x H)가 관찰실(91 cm x 46 cm x 56 cm, L x W x H)에 위치합니다. 챔버에는 카메라, 용기 위 약 >45° 각도로 매달려 있는 거울, LED 조명 막대도 포함되어 있습니다. 그림 1은 단순화된 다이어그램을 보여줍니다. 카메라는 정면 뷰와 평면도(미러)를 모두 기록하여 제브라피쉬의 x, y, z 좌표를 결정하여 제브라피쉬의 3D 궤적을 구성합니다. 방향을 위해 좌표 벡터는 관찰 컨테이너의 왼쪽 전면 모서리(카메라를 기준으로 한 위치)에 표시되며, 이는 경로 재구성 모듈(아래 참조)에 의해 생성된 3D 뷰(예: 그림 15)에 표시된 벡터에 해당합니다. 샘플링 속도는 카메라와 컴퓨터에 따라 다릅니다. 이 실험에서는 약 40프레임/초(fps)입니다. 기록된 프레임의 공간 해상도는 640 x 480 픽셀입니다(이 구성은 공간 해상도와 시간 해상도 간의 최적 균형으로 선택되었습니다). Windows XP 이상이 필요합니다.
첫 번째 기록 전에 시스템을 보정하여 용기 벽과 수면의 위치를 결정하고, 기록된 프레임의 스케일링 팩터를 결정하고, 물에서 공기로 통과할 때 빛의 굴절로 인해 생성되는 상당한 오류를 조정해야 합니다. 원칙적으로 캘리브레이션은 초기 설치 중과 카메라 또는 미러와 같은 설정 부품을 이동하거나 교체한 후에만 수행해야 합니다. 그럼에도 불구하고 교정이 여전히 올바른지 수시로 확인하고 필요한 경우 다시 교정하는 것이 좋습니다.
 소프트웨어는 세 개의 모듈로 구성됩니다. Recordings Module은 프레임을 기록합니다(그림 2에 표시된 두 개의 예시 프레임). 궤적 모듈은 모든 제브라피시의 경로를 재구성합니다. 데이터 처리 모듈은 표준 운동학 및 공간 매개변수의 범위를 계산합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>AABT-3D 추적 하드웨어</td><td>xyZfish</td><td>AABT II</td><td>카메라, 비디오 카드, 거울과 조명이 있는 관찰실</td></tr><tr><td>AABT-3D 보정 장비</td><td>xyZfish</td><td>calib</td><td>보정 패널과 사이드 미러</td></tr><tr><td>포함 AABT-3D 관찰 컨테이너</td><td>xyZfish</td><td>큐브</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>AABT-3D 추적 소프트웨어</td><td>xyZfish</td><td>v.1.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>옵션</td><td>N/A</td><td>Windows XP 이상</td></tr><tr><td>(+)-MK-801 수소 말레산염</td><td>시그마</td><td>M107</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에어 펌프</td><td>Fusion</td><td>500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에어 라인 튜빙 3/16 "</td><td>이리 s 수족관 및 애완 동물 제품</td><td>14508</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>중간 바인더 클립</td><td>OfficeDepot</td><td>561339</td><td>항공사를 관찰 컨테이너에 부착하기 위해</td></tr></tbody></table>

기록 개인과 성인 zebrafish의 떼에 자동 3d 추적 시스템을 사용하여

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

많은 수생 동물과 마찬가지로 제브라피쉬(Danio rerio)는 3D 공간에서 움직입니다. 따라서 3D 기록 시스템을 사용하여 거동을 연구하는 것이 좋습니다. 제시된 자동 비디오 추적 시스템은 미러 시스템과 광이 물에서 공기로 전환됨에 따라 발생하는 상당한 오류를 수정하는 보정 절차를 사용하여 이를 수행합니다. 이 시스템을 사용하면 성인 제브라피쉬의 단일 및 그룹을 모두 기록할 수 있습니다. 사용하기 전에 시스템을 보정해야 합니다. 이 시스템은 기록(Recording), 경로 재구성(Path Reconstruction) 및 데이터 처리(Data Processing)의 세 가지 모듈로 구성됩니다. 세 가지 모듈을 교정하고 사용하기 위한 단계별 프로토콜이 제시되어 있습니다. 실험 설정에 따라 이 시스템은 신 공포증, 백인 혐오, 사회적 응집력, 운동 장애, 새로운 물체 탐사 등을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 약물이나 돌연변이가 기본 행동 패턴에 미치는 영향을 연구하기 위한 첫 번째 단계 도구로 유망합니다. 이 시스템은 제브라피시의 수직 및 수평 분포, 운동학적 매개변수의 xyz 구성 요소(예: 이동, 속도, 가속도 및 회전 각도)에 대한 정보를 제공하고 여울을 테스트할 때 사회적 응집력을 위한 매개변수를 계산하는 데 필요한 데이터를 제공합니다.

제브라피쉬의 개별 및 그룹을 추적할 수 있는 3D 자동 비디오 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 응용 사례로, NMDA 수용체 길항제 MK-801이 제브라피시 떼에 미치는 영향을 조사합니다.

기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 또는 기타 수생 동물의 3차원 이동 패턴을 연구하고, 이들의 운동학적, 공간적 및 사회적 특성을 분석하는 것입니다. 이를 통해 유전자 변이 또는 화학적 및 환경적 요인으로 인한 행동 변화를 감지할 수 있습니다. 이는 먼저 시스템을 보정함으로써 수행되며, 이 과정에서 굴절로 인해 발생하는 상당한 이미지 왜곡 또한 교정합니다.두 번째 단계는 최소 두 개의 서로 다른 각도에서 상대적으로 높은 시간 분해능으로 비디오 프레임을 동시에 기록하는 것입니다. 다음으로, 소프트웨어가 물고기의 궤적을 재구성합니다. 노이즈의 영향을 줄이고, 가려짐이나 군집 현상이 발생했을 때 물고기의 위치를 추론하기 위해 고급 알고리즘이 적용됩니다.마지막 단계는 데이터를 분석하고 속도 가속도, 회전각, 관찰 용기 내의 수평 및 수직 분포, 개체 간 거리 및 기타 관심 파라미터에 대한 통계 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 고속 보정 3D 트래킹은 변이 제브라피시의 행동 결함과 다양한 행동 체계에 미치는 약물의 효과를 연구하는 데 유용합니다. 신약 개발 관점에서 이 시스템의 한 가지 장점은 물고기의 행동을 3D로 연구할 수 있다는 점입니다.물고기는 자연스럽게 3차원 공간으로 이동하며, 여러 마리의 물고기를 동시에 기록할 때 2D 기록 방식은 그룹의 공간적 구성을 조사하는 과정에서 매우 오해의 소지가 있을 수 있으므로 이는 중요합니다. 이 시스템의 또 다른 장점은 빛의 굴절을 보정한다는 점인데, 현재 구성에서 이를 보정하지 않으면 상당한 측정 오차가 발생할 수 있습니다. 제브라피쉬가 들어 있는 관찰 용기는 관찰 챔버 내에 배치됩니다.챔버에는 카메라, 용기 위로 약 45도 각도로 매달려 있는 거울, 그리고 LED 라이트 바가 포함되어 있습니다. 녹화 전, 시스템 보정을 통해 용기 벽면과 수면의 위치 및 녹화된 프레임의 스케일링 인자를 결정하고, 빛이 물에서 공기로 통과할 때 발생하는 굴절 오차를 보정하십시오. 보정이 완료되면 모형 물고기를 사용하여 테스트 실행을 수행해야 합니다.거울이나 카메라의 위치가 어긋났거나 추적에 문제가 있을 경우 재교정을 수행해야 합니다. 녹화 세션을 시작하려면, 표시선까지 물을 채운 관찰 용기를 관찰 챔버에 넣으십시오. 용기의 받침대가 정렬 구멍에 삽입되어야 합니다.카메라에서 보았을 때 반투명 또는 불투명한 벽면이 먼 쪽과 오른쪽을 향하도록 용기를 배치하십시오. 그다음, 챔버의 조명을 켜고 물고기를 용기에 넣은 후 커튼을 닫으십시오. 기록 모듈을 열면 용기의 정면 및 상단 뷰 이미지가 화면에 나타납니다.처음에 획득한 이미지가 이상적이지 않을 수 있으며, 따라서 물고기와 배경 사이에 충분한 대비를 얻기 위해 일부 조정이 필요할 수 있습니다. 이미지를 조정하려면 카메라 제어(camera control)를 선택하고, 열리는 일반 설정 창에서 여기에 표시된 상자들의 선택을 해제한 다음, 이미지가 과다 노출되지 않도록 셔터와 게인(gain)을 조정하십시오. 다음으로, 카메라 제어 창의 왼쪽에서 화이트 밸런스 컬러(white balance color)를 선택하고, 새 창에서 자동(auto) 상자의 선택을 해제한 후 적색 및 청색 값을 조정하여 정면 및 평면 뷰 모두에서 최적의 색상 대비를 얻으십시오.조정이 완료된 후 여러 번의 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 기록 모듈의 메인 메뉴에서 데이터 위치를 선택하여 폴더를 생성하거나 선택하십시오. 각 기록은 실험 폴더의 하위 폴더인 개별 폴더에 저장되어야 합니다.이제 녹화 시작을 누르고 녹화 시간(분)을 정수로 입력한 다음, 확인을 누르면 실험 녹화 세션이 시작됩니다. 녹화가 완료되면 보정 폴더에서 동물 케이지 데이터와 대응 데이터 하위 폴더를 복사하여 이전에 생성한 녹화 중 폴더에 붙여넣고 경로 재구성을 시작하십시오. 소프트웨어의 궤적 모듈을 엽니다. 그런 다음 데이터 위치를 눌러 녹화 모듈로 생성된 폴더를 선택하십시오.다음으로, 시스템 설정 버튼을 눌러 매개변수 창을 먼저 연 후, 상단 끝 하단 뷰(top end bottom view)의 색상 임계값을 조정하십시오. 적절한 시작 값은 1000입니다. 그런 다음, 상단 끝 하단 뷰의 크기 임계값을 선택하십시오.중간 크기의 제브라피시의 경우 적절한 시작 크기는 10이며, 큰 물고기는 20, 작은 물고기는 5를 사용하십시오. 이 임계값이 높을수록 소프트웨어가 노이즈를 인식할 가능성이 낮아집니다. 하지만 값이 너무 높으면 물고기를 감지하지 못할 수 있습니다.실험 진행 중에 이러한 임계값을 나중에 다시 조정해야 할 수도 있습니다. 상한 크기 임계값(upper size threshold)의 경우, 일반적으로 3000이라는 값이면 충분합니다. 그리고 특정 길이(specific length)의 경우, 사전 설정된 값인 220을 유지하십시오.물고기 수는 관찰 탱크 내의 물고기 마리 수를 의미합니다. 최대 포인트 수는 총 프레임 수를 의미하며, 이 숫자를 기록하거나 기억한 후 Okay를 누르십시오. 그런 다음 배경 획득(acquire background)을 선택하십시오.다음 창에서 두 개의 필드를 입력하라는 요청이 나타납니다. 배경을 로드한 후 마우스를 사용하여 세 개의 빨간색 상자를 조정하십시오. 이 상자들은 소프트웨어가 물고기를 찾는 영역을 표시합니다. 왼쪽 상자의 크기를 최소화하십시오.측면 뷰는 보정용으로만 사용되므로, 이제 궤적 생성 시작 버튼을 누르면 경로 재구성이 시작됩니다. 이상적으로는 태그가 물고기 이미지 위에 위치해야 하며, 태그가 자주 잘못 배치되는 경우 정보 창을 여십시오. 여기서는 물고기의 외곽선만 보이는 이상적인 사례를 확인할 수 있습니다.노이즈가 과도하게 발생하는 경우, 메인 메뉴에서 정지 버튼을 누르고 새로운 색상 및 크기 임계값을 선택하십시오. 또한, 빨간색 상자의 크기를 약간 줄일 수 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 상단 부분에서 수면의 움직임으로 인해 발생하는 노이즈를 제외하려면 3D 화면의 궤적을 관찰하십시오.마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 3D 구성의 회전과 이동 중에서 선택할 수 있습니다. 데이터 처리를 시작하려면 데이터 처리 모듈을 열고 툴바에서 project를 선택한 다음, 풀다운 메뉴에서 new를 선택하고 실험 이름을 입력하십시오. 다음으로 edit project를 선택하십시오.그 다음, 프로젝트에 추가한 후 새로운 그룹을 생성하고 실험 그룹의 이름을 입력합니다. 이제 오른쪽 창에서 실험 그룹을 선택하십시오. 이때 툴바가 변경되는 것을 확인할 수 있습니다.'편집 그룹(edit group)'을 선택한 다음, '그룹에 추가(add to group)'를 클릭하고, '새 측정치(new measurements)'를 선택합니다. 그러면 브라우저 창이 열립니다. 이어서 녹화 중에 생성된 폴더를 열고, '궤적(trajectories)' 하위 폴더를 선택한 후 '포인트 평활화(point smoothened)' 파일을 선택하십시오.여기 제시된 그룹 A의 예시에서는 6개의 파일이 로드되었으며, 그룹 B의 경우에는 4개의 파일이 로드되었습니다. 분석을 시작하려면 오른쪽 창에서 평활화된 지점(point smoothened) 파일을 선택하십시오. 그런 다음 풀다운 메뉴에서 데이터 처리(data processing) 및 단일 값 엔드포인트(single value endpoints)를 선택하십시오.예를 들어, duration freezing을 선택하십시오. 프로그램에 익숙해지기 위해 속도 임계값(speed threshold)과 지속 시간 임계값(duration threshold)으로 freezing을 지정하는 창이 열립니다. depth level 수와 burst frequency를 결정할 수 있는 travel distance depth distribution과 같은 다른 예시들도 시도해 보십시오.해당 옵션을 선택하면, 기본 임계값을 이용한 일괄 처리를 통해 약 200개의 엔드포인트가 이 문맥에서 계산됩니다. 여기서 기본값은 구분 기호가 설정되었음을 의미합니다. 예를 들어, 현재 깊이 분포는 3개의 깊이 수준에 대해 계산되며, 각도 분포는 4개의 섹션에 대해 계산됩니다.파라미터를 생성하면, 생성될 파일의 위치와 이름을 묻는 새 창이 열립니다. 파일은 CSV 형식으로 저장되며 다른 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 여기서 그림 A는 대조군에 대한 전형적인 예시 프레임을 보여줍니다.제브라피쉬이며, 그림 B는 오전 세션 동안 기록된 MK 801 처리 제브라피쉬의 전형적인 예시 프레임을 보여줍니다. 대조군 제브라피쉬는 바닥 근처에서 서로 가깝게 모여 있었음에 유의하십시오. 이와 대조적으로, MK 801 처리 제브라피쉬는 상단 근처에 있었으며 서로 상당한 거리를 두고 헤엄쳤습니다.여기 대조군 제브라피시와 10 µM MK 801을 처리한 제브라피시의 대표적인 궤적 두 가지를 오전 세션과 오후 세션에 대해 나타내었습니다. 이 그림에서는 두 세션 모두에서 대조군과 10 µM MK 801 처리군의 평균 사회적 거리를 나타내었으며, 여기 두 그룹의 평균 개체 간 거리의 타임라인을 제시하였습니다.그림 A에서는 오전 세션 동안 10개의 동일한 수심 단계에 따른 제브라피쉬의 분포를 볼 수 있으며, B에서는 오후 세션의 분포를 확인할 수 있습니다. 여기에서는 실험군의 4개 방사형 구역에 따른 시간적 분포가 나타나 있습니다. 삽입도는 중심부에서 주변부까지 이 구역들의 위치를 보여주며, 이어서 실험군의 4개 사분면에 따른 시간적 분포를 볼 수 있습니다.삽입도는 각 사분면의 위치를 보여줍니다. 이중선은 흰색 벽을, 단일선은 투명한 벽을 나타냅니다. 카메라는 삽입도의 왼쪽에 위치하여 사분면 1과 4에 가장 가깝습니다.검은색 별표는 오전 세션 그룹 간의 비교를 나타내며, 회색 별표는 오후 세션 그룹 간의 비교를 나타냅니다. 마지막으로, 오전 및 오후 세션 동안 제브라피시의 이동 거리 X, Y, Z 성분이 여기에 표시되어 있습니다. 평균 및 표준 오차가 제시되었습니다.시스템을 사용할 때, 데이터의 품질은 기록 상태에 달려 있으므로 시스템이 잘 보정되었는지와 카메라 설정이 최적인지 확인하십시오. 그 외의 과정은 간단하며, 각 단계를 익히는 과정만 거치면 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

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