기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 또는 기타 수생 동물의 3차원 이동 패턴을 연구하고, 이들의 운동학적, 공간적 및 사회적 특성을 분석하는 것입니다. 이를 통해 유전자 변이 또는 화학적 및 환경적 요인으로 인한 행동 변화를 감지할 수 있습니다. 이는 먼저 시스템을 보정함으로써 수행되며, 이 과정에서 굴절로 인해 발생하는 상당한 이미지 왜곡 또한 교정합니다.

두 번째 단계는 최소 두 개의 서로 다른 각도에서 상대적으로 높은 시간 분해능으로 비디오 프레임을 동시에 기록하는 것입니다. 다음으로, 소프트웨어가 물고기의 궤적을 재구성합니다. 노이즈의 영향을 줄이고, 가려짐이나 군집 현상이 발생했을 때 물고기의 위치를 추론하기 위해 고급 알고리즘이 적용됩니다.

마지막 단계는 데이터를 분석하고 속도 가속도, 회전각, 관찰 용기 내의 수평 및 수직 분포, 개체 간 거리 및 기타 관심 파라미터에 대한 통계 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 고속 보정 3D 트래킹은 변이 제브라피시의 행동 결함과 다양한 행동 체계에 미치는 약물의 효과를 연구하는 데 유용합니다. 신약 개발 관점에서 이 시스템의 한 가지 장점은 물고기의 행동을 3D로 연구할 수 있다는 점입니다.

물고기는 자연스럽게 3차원 공간으로 이동하며, 여러 마리의 물고기를 동시에 기록할 때 2D 기록 방식은 그룹의 공간적 구성을 조사하는 과정에서 매우 오해의 소지가 있을 수 있으므로 이는 중요합니다. 이 시스템의 또 다른 장점은 빛의 굴절을 보정한다는 점인데, 현재 구성에서 이를 보정하지 않으면 상당한 측정 오차가 발생할 수 있습니다. 제브라피쉬가 들어 있는 관찰 용기는 관찰 챔버 내에 배치됩니다.

챔버에는 카메라, 용기 위로 약 45도 각도로 매달려 있는 거울, 그리고 LED 라이트 바가 포함되어 있습니다. 녹화 전, 시스템 보정을 통해 용기 벽면과 수면의 위치 및 녹화된 프레임의 스케일링 인자를 결정하고, 빛이 물에서 공기로 통과할 때 발생하는 굴절 오차를 보정하십시오. 보정이 완료되면 모형 물고기를 사용하여 테스트 실행을 수행해야 합니다.

거울이나 카메라의 위치가 어긋났거나 추적에 문제가 있을 경우 재교정을 수행해야 합니다. 녹화 세션을 시작하려면, 표시선까지 물을 채운 관찰 용기를 관찰 챔버에 넣으십시오. 용기의 받침대가 정렬 구멍에 삽입되어야 합니다.

카메라에서 보았을 때 반투명 또는 불투명한 벽면이 먼 쪽과 오른쪽을 향하도록 용기를 배치하십시오. 그다음, 챔버의 조명을 켜고 물고기를 용기에 넣은 후 커튼을 닫으십시오. 기록 모듈을 열면 용기의 정면 및 상단 뷰 이미지가 화면에 나타납니다.

처음에 획득한 이미지가 이상적이지 않을 수 있으며, 따라서 물고기와 배경 사이에 충분한 대비를 얻기 위해 일부 조정이 필요할 수 있습니다. 이미지를 조정하려면 카메라 제어(camera control)를 선택하고, 열리는 일반 설정 창에서 여기에 표시된 상자들의 선택을 해제한 다음, 이미지가 과다 노출되지 않도록 셔터와 게인(gain)을 조정하십시오. 다음으로, 카메라 제어 창의 왼쪽에서 화이트 밸런스 컬러(white balance color)를 선택하고, 새 창에서 자동(auto) 상자의 선택을 해제한 후 적색 및 청색 값을 조정하여 정면 및 평면 뷰 모두에서 최적의 색상 대비를 얻으십시오.

조정이 완료된 후 여러 번의 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 기록 모듈의 메인 메뉴에서 데이터 위치를 선택하여 폴더를 생성하거나 선택하십시오. 각 기록은 실험 폴더의 하위 폴더인 개별 폴더에 저장되어야 합니다.

이제 녹화 시작을 누르고 녹화 시간(분)을 정수로 입력한 다음, 확인을 누르면 실험 녹화 세션이 시작됩니다. 녹화가 완료되면 보정 폴더에서 동물 케이지 데이터와 대응 데이터 하위 폴더를 복사하여 이전에 생성한 녹화 중 폴더에 붙여넣고 경로 재구성을 시작하십시오. 소프트웨어의 궤적 모듈을 엽니다. 그런 다음 데이터 위치를 눌러 녹화 모듈로 생성된 폴더를 선택하십시오.

다음으로, 시스템 설정 버튼을 눌러 매개변수 창을 먼저 연 후, 상단 끝 하단 뷰(top end bottom view)의 색상 임계값을 조정하십시오. 적절한 시작 값은 1000입니다. 그런 다음, 상단 끝 하단 뷰의 크기 임계값을 선택하십시오.

중간 크기의 제브라피시의 경우 적절한 시작 크기는 10이며, 큰 물고기는 20, 작은 물고기는 5를 사용하십시오. 이 임계값이 높을수록 소프트웨어가 노이즈를 인식할 가능성이 낮아집니다. 하지만 값이 너무 높으면 물고기를 감지하지 못할 수 있습니다.

실험 진행 중에 이러한 임계값을 나중에 다시 조정해야 할 수도 있습니다. 상한 크기 임계값(upper size threshold)의 경우, 일반적으로 3000이라는 값이면 충분합니다. 그리고 특정 길이(specific length)의 경우, 사전 설정된 값인 220을 유지하십시오.

물고기 수는 관찰 탱크 내의 물고기 마리 수를 의미합니다. 최대 포인트 수는 총 프레임 수를 의미하며, 이 숫자를 기록하거나 기억한 후 Okay를 누르십시오. 그런 다음 배경 획득(acquire background)을 선택하십시오.

다음 창에서 두 개의 필드를 입력하라는 요청이 나타납니다. 배경을 로드한 후 마우스를 사용하여 세 개의 빨간색 상자를 조정하십시오. 이 상자들은 소프트웨어가 물고기를 찾는 영역을 표시합니다. 왼쪽 상자의 크기를 최소화하십시오.

측면 뷰는 보정용으로만 사용되므로, 이제 궤적 생성 시작 버튼을 누르면 경로 재구성이 시작됩니다. 이상적으로는 태그가 물고기 이미지 위에 위치해야 하며, 태그가 자주 잘못 배치되는 경우 정보 창을 여십시오. 여기서는 물고기의 외곽선만 보이는 이상적인 사례를 확인할 수 있습니다.

노이즈가 과도하게 발생하는 경우, 메인 메뉴에서 정지 버튼을 누르고 새로운 색상 및 크기 임계값을 선택하십시오. 또한, 빨간색 상자의 크기를 약간 줄일 수 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 상단 부분에서 수면의 움직임으로 인해 발생하는 노이즈를 제외하려면 3D 화면의 궤적을 관찰하십시오.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 3D 구성의 회전과 이동 중에서 선택할 수 있습니다. 데이터 처리를 시작하려면 데이터 처리 모듈을 열고 툴바에서 project를 선택한 다음, 풀다운 메뉴에서 new를 선택하고 실험 이름을 입력하십시오. 다음으로 edit project를 선택하십시오.

그 다음, 프로젝트에 추가한 후 새로운 그룹을 생성하고 실험 그룹의 이름을 입력합니다. 이제 오른쪽 창에서 실험 그룹을 선택하십시오. 이때 툴바가 변경되는 것을 확인할 수 있습니다.

'편집 그룹(edit group)'을 선택한 다음, '그룹에 추가(add to group)'를 클릭하고, '새 측정치(new measurements)'를 선택합니다. 그러면 브라우저 창이 열립니다. 이어서 녹화 중에 생성된 폴더를 열고, '궤적(trajectories)' 하위 폴더를 선택한 후 '포인트 평활화(point smoothened)' 파일을 선택하십시오.

여기 제시된 그룹 A의 예시에서는 6개의 파일이 로드되었으며, 그룹 B의 경우에는 4개의 파일이 로드되었습니다. 분석을 시작하려면 오른쪽 창에서 평활화된 지점(point smoothened) 파일을 선택하십시오. 그런 다음 풀다운 메뉴에서 데이터 처리(data processing) 및 단일 값 엔드포인트(single value endpoints)를 선택하십시오.

예를 들어, duration freezing을 선택하십시오. 프로그램에 익숙해지기 위해 속도 임계값(speed threshold)과 지속 시간 임계값(duration threshold)으로 freezing을 지정하는 창이 열립니다. depth level 수와 burst frequency를 결정할 수 있는 travel distance depth distribution과 같은 다른 예시들도 시도해 보십시오.

해당 옵션을 선택하면, 기본 임계값을 이용한 일괄 처리를 통해 약 200개의 엔드포인트가 이 문맥에서 계산됩니다. 여기서 기본값은 구분 기호가 설정되었음을 의미합니다. 예를 들어, 현재 깊이 분포는 3개의 깊이 수준에 대해 계산되며, 각도 분포는 4개의 섹션에 대해 계산됩니다.

파라미터를 생성하면, 생성될 파일의 위치와 이름을 묻는 새 창이 열립니다. 파일은 CSV 형식으로 저장되며 다른 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 여기서 그림 A는 대조군에 대한 전형적인 예시 프레임을 보여줍니다.

제브라피쉬이며, 그림 B는 오전 세션 동안 기록된 MK 801 처리 제브라피쉬의 전형적인 예시 프레임을 보여줍니다. 대조군 제브라피쉬는 바닥 근처에서 서로 가깝게 모여 있었음에 유의하십시오. 이와 대조적으로, MK 801 처리 제브라피쉬는 상단 근처에 있었으며 서로 상당한 거리를 두고 헤엄쳤습니다.

여기 대조군 제브라피시와 10 µM MK 801을 처리한 제브라피시의 대표적인 궤적 두 가지를 오전 세션과 오후 세션에 대해 나타내었습니다. 이 그림에서는 두 세션 모두에서 대조군과 10 µM MK 801 처리군의 평균 사회적 거리를 나타내었으며, 여기 두 그룹의 평균 개체 간 거리의 타임라인을 제시하였습니다.

그림 A에서는 오전 세션 동안 10개의 동일한 수심 단계에 따른 제브라피쉬의 분포를 볼 수 있으며, B에서는 오후 세션의 분포를 확인할 수 있습니다. 여기에서는 실험군의 4개 방사형 구역에 따른 시간적 분포가 나타나 있습니다. 삽입도는 중심부에서 주변부까지 이 구역들의 위치를 보여주며, 이어서 실험군의 4개 사분면에 따른 시간적 분포를 볼 수 있습니다.

삽입도는 각 사분면의 위치를 보여줍니다. 이중선은 흰색 벽을, 단일선은 투명한 벽을 나타냅니다. 카메라는 삽입도의 왼쪽에 위치하여 사분면 1과 4에 가장 가깝습니다.

검은색 별표는 오전 세션 그룹 간의 비교를 나타내며, 회색 별표는 오후 세션 그룹 간의 비교를 나타냅니다. 마지막으로, 오전 및 오후 세션 동안 제브라피시의 이동 거리 X, Y, Z 성분이 여기에 표시되어 있습니다. 평균 및 표준 오차가 제시되었습니다.

시스템을 사용할 때, 데이터의 품질은 기록 상태에 달려 있으므로 시스템이 잘 보정되었는지와 카메라 설정이 최적인지 확인하십시오. 그 외의 과정은 간단하며, 각 단계를 익히는 과정만 거치면 됩니다.