대규모 유전자 넉다운에 C. 엘레 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아 DS RNA 공급 라이브러리를 사용하여 C elegance에서 대규모 RNA 간섭 스크리닝을 수행하여 유전자 발현을 녹다운하는 것입니다. 이는 먼저 DS RNA 라이브러리에서 박테리아 클론을 배양하여 수행됩니다. 플라스미드 손실을 방지하는 성장 조건에서는 각 1차 라이브러리 플레이트를 복제한 다음 96웰 복제 라이브러리 플레이트를 사용하여 한천 옴니 플레이트에 임시 박테리아 줄기를 생성하는 것으로 시작합니다.

이 옴니 플레이트의 박테리아는 액체 배양에서 하룻밤 동안 성장한 후 지렁이 먹이 플레이트의 표면으로 옮겨집니다. 라이브러리의 각 박테리아 클론은 하나의 C elgan 유전자를 knockdown을 표적으로 하는 고유한 D-S-R-N-A 인코딩 플라스미드를 가지고 있습니다. 두 번째 단계는 동기화된 웜을 공급 플레이트에 배치하는 것입니다.

다음으로, 지렁이는 섭씨 20도의 가습실에서 며칠 동안 자랍니다. 기생충이 박테리아를 먹으면서 유도된 DS RNA는 동물의 장으로 방출된 다음 주변 조직으로 퍼져 전신 녹다운 효과를 일으킵니다. 마지막 단계는 유전자 특이적 넉다운(gene specific knockdown)으로 인한 표현형 효과(phenotypic effect)에 대해 사료를 먹인 동물을 조사하는 것입니다.

이러한 표현형 분석은 연구 중인 생물학적 과정에 중요한 유전자를 식별하는 데 사용됩니다. 웜 생식선에 이중선 가닥 RNA를 미세주입하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 처리량이 높다는 것입니다. 사료 라이브러리를 사용하면 단 몇 주 만에 거의 모든 바다 엘진 유전자의 생물학적 기능을 조사할 수 있습니다.

많은 실험실에서 이러한 녹다운 접근법에 어려움을 겪어왔는데, 그 이유는 대부분의 유전자와 C 우아함이 하플로(haplo)로 충분하기 때문이다. 따라서 RNA 녹다운은 유전자 발현을 50% 이상 감소시켜야 기능 표현형의 상실을 생성할 수 있습니다. 강력한 유전자 knockdown을 보장하기 위해서는 기생충에게 공급된 모든 박테리아가 이중 가닥 RNA 플라스미드를 발현하는 것이 중요합니다.

플라스미드 손실을 측정하기 위한 절차를 시작하려면 각 관련 단계에서 설명한 대로 작은 박테리아 샘플을 제거하고 450마이크로리터의 멸균수에 첨가합니다. 이 희석된 샘플 100마이크로리터를 사용하여 멸균수를 사용하여 추가 연속 희석을 만듭니다. 희석액 사이에 용액을 철저히 혼합하십시오.

각 희석액 100마이크로리터를 LB 및 LB AMP 플레이트에 펴고 다음 날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후 100개에서 500개 사이의 박테리아 군집이 포함된 LB 플레이트를 식별합니다. 이 플레이트와 해당 lb amp 플레이트에 있는 콜로니의 수를 세십시오. 이 방정식을 사용하여 플라스미드 손실을 측정합니다.

플라스미드를 함유하지 않는 박테리아의 비율은 LB 앰프 플레이트의 콜로니 수에서 LB 플레이트의 콜로니 수를 빼고, LB 플레이트의 콜로니 수로 나누고, 100을 곱하여 계산하며, 고농도의 탄산 셀린에서 박테리아를 성장시킴으로써 플라스미드 손실을 방지하여 효과적인 넉다운을 위해 계산한다. 동물에게 먹이를 주기 전에 플라스미드 손실이 있는지 확인하고 플라스미드 손실이 15% 미만인 경우에만 계속합니다.섭씨 80도의 음극 냉동고에서 중복된 라이브러리 플레이트를 제거하여 이 절차를 시작합니다. 배양물이 아직 얼어 있는 동안 호일 씰을 제거합니다.

플레이트 플라스틱 덮개를 교체하고 중복된 라이브러리 플레이트를 평평한 표면에 놓고 실온에서 30분 이상 해동하지 않도록 합니다. 구강 96핀 복제기를 살균합니다. 에탄올 욕조에 넣고 에탄올을 태우십시오.

롤빵과 버너를 사용하여 핀을 코팅합니다. 불꽃이 꺼지도록 한 다음 반복하십시오. 깨끗한 복제기의 핀은 증류수로 헹구고 매번 사용하기 전에 살균해야 합니다.

멸균된 복제기를 해동된 복제 플레이트의 웰에 넣고 이를 사용하여 배양물을 부드럽게 저어줍니다. 배양의 작은 볼륨은 복제기의 핀에 부착됩니다. 복제 플레이트의 웰에서 복제기를 조심스럽게 제거하고 옴니 플레이트의 표면에 부드럽게 핀으로 고정합니다.

한천 표면을 뚫지 않도록 주의하십시오. 복제기를 옴니 플레이트 표면에 3-4초 동안 그대로 두어 복제기의 핀에서 나온 박테리아가 한천 표면으로 옮겨지도록 합니다. 고체 매체에서 플라스미드 손실을 방지하기 위해 ate에는 밀리리터당 2mg이 포함되어 있습니다.

탄산 셀린. 복제기를 제거하고 소량의 박테리아 배양액이 한천에 흡수되도록 합니다. 두 플레이트가 모두 복제된 후.

다음날 아침 섭씨 37도에서 15-18시간 동안 뒤집힌 옴니 플레이트를 배양합니다. 이 옴니 플레이트는 96웰 액체 배양액을 접종하는 데 사용하거나 섭씨 4도에서 최대 7일까지 보관할 수 있습니다. 먹이를 먹기 위한 박테리아는 반복 피펫터와 50ml 콤비 팁을 사용하여 옴니 플레이트의 박테리아를 사용하여 액체 배양으로 준비되며, 각 2ml에 1ml의 박테리아 성장 배지를 분배합니다.

96웰 플레이트의 깊은 우물은 복제기를 살균하고 박테리아 콜로니가 포함된 옴니 플레이트의 표면에 놓고 핀이 96개의 박테리아 콜로니 각각과 접촉하는지 확인합니다. 복제기를 옴니 플레이트의 표면에서 딥 웰 플레이트로 조심스럽게 이동시키고, 성장 매체에 잠길 때까지 핀이 딥 웰의 측면을 긁지 않도록 합니다. 박테리아를 성장 배지로 몰아내기 위해.

복제기를 깊은 우물 플레이트의 내부 벽을 따라 정사각형으로 천천히 움직입니다. 오염된 우물을 튀거나 건너지 않도록 주의하십시오. 각 96웰 딥 웰 배양 플레이트에 대해 두 개의 컨트롤이 포함되어야 합니다.

DS RNA를 예상되는 녹다운에 대한 양성 대조군으로 발현하는 박테리아, 표현형 및 빈 DS RNA 벡터를 음성 대조군으로 포함하는 박테리아. 멸균 접종 루프를 사용하여 positive control plate에서 잘 분리된 단일 콜로니를 제거하고 plate라고 하는 깊은 well에 빈 well을 접종합니다. 접종된 우물의 위치를 기록합니다.

네거티브 컨트롤에 대해 반복합니다. 딥 웰 플레이트를 섭씨 37도의 마이크로 셰이커에서 650RPM의 평평한 위치에 밤새 흔듭니다. 하룻밤 동안 배양물을 배양한 후 96개의 깊은 웰 플레이트에서 박테리아가 12개로 옮겨집니다.

우물 공급 플레이트 이동은 한 번에 4 개의 우물을 수행 할 수 있습니다. 12채널 멀티채널 피펫의 모든 세 번째 채널에 피펫 팁을 놓습니다. 딥 웰 플레이트에서 150마이크로리터의 박테리아 배양액을 제거하고 12웰 공급 플레이트의 4개 웰 표면으로 배출합니다.

기생충이 굴을 파고 DS RNA를 발현하는 박테리아를 먹지 않으므로 이식 중에 한천 표면을 뚫지 않는 것이 중요합니다. 4개의 웰로 구성된 각 세트를 옮긴 후 4개의 피펫 팁을 4개의 새로운 멸균 피펫 팁으로 교체하고 공급 플레이트의 다음 4개의 웰에 씨를 뿌리고, 파종된 플레이트를 밤새 실온의 어두운 곳에 똑바로 세워 보관하여 박테리아가 한천에 흡수할 수 있도록 합니다. L을 옮기기 전에, 한 마리는 C 엘간 유충을 먹이 선별 검사를 위해 DS RNA 먹이판에 옮겼다.

미리 준비된 L one arrested 유충의 농도를 결정해야 합니다. 포획된 L 유충 1마리가 들어 있는 삼각 플라스크를 혼합하여 동물을 분배합니다. 그런 다음 10마이크로리터 분취액을 제거하고 장착되지 않은 6cm NGM 플레이트에 적가하여 놓습니다.

4-5 방울에서 접시의 중앙을 따라 떨어집니다. 피펫에서 모든 매체가 배출되었는지 확인하십시오. 피펫 팁의 끝을 사용하여 웜 현탁액의 점을 펴서 플레이트의 직경에 걸쳐 있는 하나의 연속적인 액체 선을 형성합니다.

해부 현미경을 사용하여 액체 라인의 한쪽 끝에서 시작하여 액체가 플레이트에 흡수되어 동물이 흩어지기 전에 다른 쪽 끝까지 모든 동물을 세십시오. 이를 위해서는 놓친 동물이 없는지 확인하기 위해 해부 범위의 초점을 지속적으로 다시 맞춰야 할 수 있습니다. 3개의 개별 10 마이크로리터 분취량에 대해 이 계수 절차를 반복하여 웜 현탁액 마이크로리터당 평균 웜 수를 결정하고 이 수치를 삼각 플라스크에 직접 기록합니다.

먹이 화면을 시작하려면 L 1 개의 포집 된 유충과 멸균 수의 현탁액을 사용하여 밀리리터당 2000 개의 벌레를 포함하는 용액을 준비합니다. 각 12웰 공급 플레이트에는 동물의 균일한 분포를 보장하고 피펫팅을 위해 동물을 멸균 저장소로 옮기기 위해 완전히 혼합된 120마이크로리터의 이 웜 현탁액이 필요합니다. 세 번째 위치마다 팁이 있는 멀티채널 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 웜 용액을 공급 플레이트의 박테리아 잔디밭으로 직접 옮깁니다.

벌레가 한천에 굴을 파고 들어가 박테리아를 발현하는 D-S-R-N-A를 먹지 않으므로 한천 표면을 뚫지 않도록 주의하십시오. 지렁이 용액을 두 줄의 공급 플레이트마다 옮긴 후, 지렁이가 가라앉을 때 저류기에 있는 지렁이 용액을 부드럽게 출렁거리게 하여 다시 혼합하고, 해부 범위 아래에서 초기에 몇 개의 우물을 검사하여 각 우물에 20-30개의 지렁이가 있는지 확인합니다. 모든 수유 플레이트에 벌레가 생기면 다음 날 벌레 현탁액이 접시에 흡수된 후 다음 날 섭씨 20도의 인큐베이터에 가습 상자에 접시를 똑바로 세워 보관하고 접시를 뒤집어 섭씨 20도의 휴미더로 되돌립니다.

이 플레이트에 있는 동물은 P zero 표현형의 경우 3일 후에 관찰할 수 있으며 F1 표현형의 경우 6일 후에 다시 관찰할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 4개의 유전자를 knockdown egg L 30 dumpy 17, PAT 10 및 4개의 난자 L 30 및 4개의 유전자가 신경계에서 발현되는 데 사용되었습니다. Pat 10은 체벽 근육에서 발현되고 Dumpy 17은 표피 세포에서 발현됩니다.

Erie one Lin 15 B 돌연변이체는 음성 대조군으로서 RNAi에 대한 민감도가 향상되었기 때문에 스크리닝에 사용되었습니다. 기생충은 예상대로 DS RNA를 발현하지 않는 빈 PL 44 40 플라스미드를 함유한 박테리아를 공급받았습니다. RIE one Lin 15 B 동물은 빈 플라스미드에 함유된 박테리아를 먹였으나 형태학적 또는 행동적 결함을 보이지 않았다.

이 사진은 정상적인 신체 자세로 자유롭게 움직이는 동물을 보여줍니다. 검은색 화살표는 어린 성인 동물의 위치를 나타냅니다. 흰색 화살표는 낳은 알 그룹의 위치를 나타냅니다.

벌레의 정상적인 행동은이 비디오 클립에 나와 있습니다 : 계란 L 30은 G- 단백질 소단위 G 알파 Q.L 1 단계 Erie 1 Lin 15 B 유충에게 계란 L 30 DS RNA를 발현 박테리아를 먹였습니다. 유충은 성인으로 자라서 운동과 알을 낳는 행동에 뚜렷한 결함을 보였습니다. 3일 후, 난자 L 30에 대해 DS RNA를 먹인 동물의 100%가 마비되어 알을 낳을 수 없었다.

이 사진은 모든 동물이 마비된 동물의 전형적인 단단한 모습을 채택했음을 보여줍니다. 접시에 낳은 달걀이 전혀 없다는 점도 주목해야 합니다. Dumpy 17은 바다에서 큐티클 형성에 필요한 콜라겐 단백질을 암호화합니다.

Elgan과 dumpy 17 null 돌연변이는 야생형 동물보다 키가 작고 뚱뚱합니다. 이 실험에서는 덤피 17 D-S-R-N-A를 먹인 P 제로 동물에서 형태학적 결함이 관찰되지 않았습니다. 그러나이 그림에 나타난 바와 같이 F1 동물의 98 %는 덤피 표현형을 보였습니다.

화살표로 표시된 들판의 성인 동물은 검은색 화살표로 표시된 성인 동물보다 키가 작고 뚱뚱합니다. 패널 A.에서 키가 작고 뚱뚱한 P 제로 동물의 부족은 적절한 신체 형태를 위해 초기 유충 단계에서 덤피 17 유전자 기능이 필요하다는 것을 나타냅니다. Pat 10은 칼슘을 결합하는 4개의 EF 손 모티프를 포함하는 체벽 근육 트로포닌 CA 단백질을 암호화합니다.

이 연구에서 Pat 10 DS RNA를 먹인 Erie one Lin 15 B 동물의 100%가 3일 이내에 마비되고 알을 낳지 않아 치명적인 표현형을 초래하는 것이 관찰되었습니다. 동물들은 마비되어 있지만, 복삭 운동 뉴런에서 발현되는 호메오 도메인 단백질인 4개의 인코딩에 화살표로 표시된 머리 근처의 박테리아가 제거된 것에서 알 수 있듯이 먹이를 먹기 위해 여전히 머리 근육을 움직일 수 있습니다. 이 연구에서 Choice on four가 테스트 유전자로 선정된 이유는 이전의 DS RNA 섭식 전략에 내성이 있는 것으로 입증되었기 때문입니다.

이 연구의 결과는 라이브러리 제제에서 박테리아를 발현하는 4개의 DS RNA를 먹인 동물의 62%가 머리를 찌르면 정현파 운동으로 자유롭게 뒤로 물러나는 야생형 동물에 비해 운동 행동의 결함을 보였으며, UNC 4개의 null 돌연변이는 뒤로 물러나지 않고 대신 단단히 수축하여 등굴곡근을 일으키고, 그것은 종종 너무 극단적이어서 동물의 머리와 꼬리가 닿아 몸을 똬리를 틀린 자세로 놓습니다. 이 표는 테스트된 4개의 유전자 각각에 대해 DS RNA를 먹였을 때 null like 표현형을 나타내는 동물의 비율을 보여주며, 각 넉다운 실험에 대해 100마리의 동물을 검사했습니다. 이러한 결과는 DS RNA의 성공을 위한 플라스미드 머무름의 중요성을 보여줍니다.

간섭 스크리닝: 모든 조직에서 강력하고 침투력이 높은 기능 표현형 손실을 관찰할 수 있습니다. 벌레에게 먹이가 된 모든 박테리아가 DS RNA를 발현하면 약 2개월 안에 한 사람이 전체 영양 라이브러리를 선별할 수 있습니다. 처리량을 개선하기 위해 공급 화면에서 각 박테리아 클론을 한 번만 테스트합니다.

라이브러리를 통한 첫 번째 패스에서 확인된 모든 유전자는 그런 다음 다시 테스트됩니다. 삼중으로, 우리는 유전자가 양성 히트로 제곱되기 위해 모든 재검사에서 원하는 표현형이 관찰되어야 한다고 주장합니다. 그런 다음 박테리아에서 플라스미드를 정제하고 염기서열을 분석하여 암호화된 유전자의 정체를 확인합니다.

유전자가 확인되면 사용 가능한 경우 L 돌연변이를 주문하고 유전자의 추가 특성 분석을 수행하기 전에 원하는 표현형을 테스트합니다.