Name: 대규모 유전자 넉다운에 C. 엘레 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 dsRNA 먹이 라이브러리를 이용한 대규모 RNAi 스크리닝 방법으로 유전자 기능을 효율적으로 연구하세요. 이 기술은 신경과학 및 유전학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 MH097163의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원되었다. 일부 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40-OD010440)에 의해 투자 된 CGC에 의해 제공되었다.

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 C.에 대형 화면을 수행하기 위해 시판하는 dsRNA 수유 라이브러리를 사용하는 프로토콜을 기술했다 엘레. 우리는 라이브러리를 복제하고 효과적으로 사용하는 모든 지침을 제공합니다. 우리는이 방법은 동물의 조직에서 다른 여러 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별 할 수 있다는 것을 보여준다. 우리가 여기에서 설명하는 표현형 (UNC, EGL, 그리고 DPY) 쉽게 관찰 할 수 있지만,이 프로토콜은 거의 모든 생물학적 과정에 필요한 유전자를 검색에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 웜 (25) 신경 전달에 필요한 유전자를 확인하기 위해 프로토콜을 사용 해왔다. 동물 dsRNA를 표현 박테리아에 공급하면 (일반적으로 P0 스크린, F1 화면에 대한 6~7일을위한 3 일)은, 그들은 먹이 판에서 제거하고 행동 표현형에 대한 검사를 할 수 있습니다. 플라스미드 손실 : ...

C. 역사적으로, 유전 화면 엘레 DNA 내에 무작위 돌연변이를 만들 에틸 메탄 술폰산 등의 화학적으로 돌연변이 동물을 처리하여 수행되었다. 돌연변이 동물의 자손 또는 grandprogeny는 그 전시에게 원하는 이상 표현형을 격리됩니다. 표현형의 원인에 대한 책임 돌연변이 후 노동 집약적 매핑 절차를 통해 또는 돌연변이 벌레의 전체 게놈을 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 이 그들이 모두 이득 함수 지점 기능 상실 표현형을 초래할 수 웜 게놈 내의 영구 병변을 생성 같은 화학적 돌연변이 스크린을 수행하는 많은 장점이 있지만 매핑 절차가 느리고 비싸다. 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi)가 중요한 생물 학적 과정에 관련된 유전자를 확인하는 다른 방법을 제공합니다. 이 방법에서, 내생 유전자의 코딩 서열과 일치하는 dsRNA는 웜에 도입된다.dsRNA에이 가이드가 파괴 1을 대상으로 일치하는 내생의 mRNA를 찾아 바인딩하는 역할을 소형 (21 ~ 22 염기) RNA를 생성하기 위해 생체 내에서 처리된다. 이 절차는 비교적 빠른이지만 dsRNA에 오히려보다 DNA의 mRNA를 표적으로하기 때문에, 단지 환원의 기능 표현형이이 방법을 사용하여 관찰된다. 동물에 dsRNA에 도입 dsRNA를 3 동물을 담가, 또는 dsRNA에 4을 표현하는 동물 박테리아를 공급함으로써, dsRNA에 2의 직접 주입에 의해 달성 될 수있다. 동물의 대부분의 세포는 SID-1, dsRNA에 5를 가져올 수있는 횡단 채널을 표현하는 이러한 전달 방법의 각 조직 최저 효과를 일으킬 수 있습니다. 원래시 개별 유전자의 발현을 녹다운하는 역 유전학 방식으로 사용이 급전 라이브러리의 개발은 지금은 대규모 유전자 스크린을 허용한다. 시판하는 dsRNA 라이브러리는 BA를 포함모든 C의 55 % 또는 87 % 중 하나를 나타내는 cterial 클론 elegans의 유전자 6, 7. 불행하게도, 대규모 dsRNAi 공급 화면은 종종 변수 최저 효율 8-10 결과. RNAi에 의한 최저의 절대 레벨이 쉽게 측정되지 않지만, 대형 화면에서 관찰 감소 최저 효율은 RNAi에 의해 열화를 피할 잔류 유전자 특이의 mRNA에 의해 발생되어야한다. 이것은, 차례로, 이러한 화면에 동물에 공급하는 dsRNA 박테리아 플라스미드 손실의 직접적인 결과 일 수있다. 넉다운 효과를 먹인 동물 (11)를 제어하기 위해 비교 될 때 (있는 경우)이 아이디어를지지, 동물은 박테리아의 50 % 만이 표적 유전자의 dsRNA에 대하여을 표현하는, 세균의 혼합물을 공급 극적으로 감소 보여준다. C. 대부분의 유전자로 dsRNAi 화면을 수행 할 때 유전자 최저의 정도는 중요한 문제가됩니다 엘레 haplosufficient이며, 따라서 유전자의 발현은 적어도 50 %의 t에 의해 감소되어야O 기능 상실이 12 표현형의 원인이됩니다. 우리는 대형 스크린을 수행하기 이전에 발행 된 먹이 프로토콜을 사용하고 다른 사람 8-10에서보고 같은 변수 최저의 효과를 발견했다. 가능한 원인에 대한 검색, 우리는 화면에서 동물에 공급되는 박테리아의 약 60 %는 dsRNA에 플라스미드를 잃은 것으로 나타났습니다. 우리는 극적으로 감소 또는 제거 플라스미드 손실을 크게 최저 효율을 향상 도서관 복제 및 검사 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 C.에서 대형 스크린을 수행하기에 적합 엘레하고 시판하는 dsRNA 라이브러리 중 하나 하나를 선별하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 화면 동안 동물에 공급되는 박테리아의 본질적으로 100 % dsRNA에 인코딩 플라스미드를 유지하고 검사를 모든 조직의 기능 표현형의 강력하고 고도로 침투 손실이 발생할 수 있음을 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>96-well Falcon flat bottom plate </td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>멸균</td></tr><tr><td>접착 호일</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 옴니플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 깊이 96-웰 폴리프로필렌 Masterblock</td><td>USA Scientific</td><td>5678-0285</td><td></td></tr><tr><td>딥 웰 플레이트용</td> 오토클레이브 뚜껑 <td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50ml 콤비팁</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>개별 포장</td></tr><tr><td>Reservoir</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>오토클레이브 12</td></tr><tr><td>웰 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>개별 포장</td></tr><tr><td>dsRNA 공급 라이브러리</td><td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>스토어 -80 &deg; C</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린은</td><td></td><td></td><td>배송에 2-4주를 허용합니다 <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>웜 플레이트</td></tr><tr>용<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Brayer roller</td><td>USA Scientific</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211; kel 96-pin replicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>가능한 마이크로쉐이커</td><td>Thomas Scientific</td><td>1231A93</td><td>3 mm 궤도</td></tr><tr><td>12 채널 다채널 피펫 (0.5-10 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12채널 멀티채널 피펫 (30-300 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>리피터 플러스 수동 피펫터</td><td>USA Scientific</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; c. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsrna를 먹이는 라이브러리 사용

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

dsRNA에 표현 벌레 박테리아를 먹이로 RNA 간섭 C. 유전자의 기능을 평가하는 유용한 도구이다 엘레. 유전자의 작은 숫자가 최저 대상 때이 전략은 잘 작동하는 동안, 대규모 공급 화면은 자신의 유틸리티를 제한하는 변수 최저 효율을 보여줍니다. 우리는 이전에 출판 된 RNAi의 최저 프로토콜을 해체하고 감소 최저의 기본 소스는 동물에 공급되는 박테리아에서 dsRNA를 코딩하는 플라스미드의 손실에 기인 할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 크게 줄이거 나 효율, 높은 처리량 최저를 달성하기 위해 플라스미드 손실을 제거하는 dsRNA에 먹이 프로토콜을 개발했습니다. 우리는이 프로토콜은 C의 아래 강력한 재현 노크를 생산 것을 보여 엘레 신경 등 다양한 조직 유형, 유전자, 그리고 대형 화면에 효율적으로 최저를 허용합니다. 이 프로토콜은 시중에서 dsRNA에 먹이를 사용도서관은 도서관을 복제하고 dsRNA에 화면을 수행하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 프로토콜은 정교한 장비의 사용을 필요로하지 않으며, 따라서 어떠한 C. 의해 수행 될 수있다 실험실 엘레 간스.

P0의 최저 표현형은 dsRNA에 세균을 표현하는 동물 먹이를 2 ~ 3 일 후에 나타나기 시작합니다. 일부 초기 표현형은 유충의 체포와 치사를 포함하고있는 모든 공급 우물 2 ~ 3 %가 관찰되어야한다. 이 같은 표현형은 F1 세대의 동물에서 관찰됩니다. 부화에 실패 F1 계란의 존재는 또 다른 일반적인 F1 표현형, 그리고 함께,이 세 가지 표현형은 F1 화면에있는 우물의 약 10 %에서 관찰됩니다. 우리는 P0과 F1 표현형 모두 조직 유형의 다양한 표현 몇개의 유전자 녹다운의 효과를 조사하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 신경 조직에 최저의 효과를 테스트하고 싶었 기 때문에, 우리는 에리-1을 사용, 우리의 스크린에서 LIN-15B의 돌연변이. 에리-1 및 LIN-15B의 돌연변이는, RRF-3의 돌연변이와 함께, RNAi의 8,13,14에 향상...

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

이 절차의 전체적인 목표는 박테리아 dsRNA 피딩 라이브러리를 사용하여 C. elegans에서 대규모 RNA 간섭 스크리닝을 수행함으로써 유전자 발현을 억제하는 것입니다. 이는 먼저 dsRNA 라이브러리에서 박테리아 클론을 배양함으로써 달성됩니다. 플라스미드 소실을 방지하는 성장 조건 하에서, 각 기본 라이브러리 플레이트를 복제하는 것으로 시작하여, 96-웰 복제 라이브러리 플레이트를 이용해 agar omni 플레이트 위에 박테리아의 일시적인 스톡을 생성합니다.이러한 옴니 플레이트의 박테리아를 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 벌레 먹이 플레이트 표면으로 옮깁니다. 라이브러리의 각 박테리아 클론은 하나의 C. elegans 유전자를 넉다운시키기 위해 표적화하는 고유한 D-S-R-N-A 인코딩 플라스미드를 보유하고 있습니다. 두 번째 단계는 동기화된 벌레를 먹이 플레이트 위에 배치하는 것입니다.다음으로, 벌레를 20 °C의 가습 챔버에서 며칠 동안 배양합니다. 벌레가 박테리아를 섭취함에 따라 유도된 DS RNA가 동물의 장 내로 방출되며, 이후 주변 조직으로 확산되어 전신적인 녹다운 효과를 일으킵니다. 마지막 단계는 먹이를 섭취한 동물을 관찰하여 유전자 특이적 녹다운으로 인해 나타나는 표현형 효과를 확인하는 것입니다.이러한 표현형 분석은 연구 대상이 되는 생물학적 과정에 중요한 유전자를 식별하는 데 사용됩니다. 벌레 생식선에 이중 가닥 RNA를 미세 주입하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 처리량이 높다는 점입니다. 피딩 라이브러리를 사용하면 단 몇 주 만에 거의 모든 sea elgin 유전자의 생물학적 기능을 조사할 수 있습니다.대부분의 C. elegans 유전자가 반접합 충분성(haplo sufficiency)을 가지기 때문에, 많은 연구실에서 이러한 넉다운(knockdown) 방식에 어려움을 겪어 왔습니다. 따라서 기능 상실 표현형을 유도하기 위해서는 RNA 넉다운을 통해 유전자 발현을 50% 이상 감소시켜야 합니다. 강력한 유전자 넉다운을 보장하려면, 벌레에게 먹이는 모든 박테리아가 이중 가닥 RNA 플라스미드를 발현하는 것이 매우 중요합니다.플라스미드 소실 결정 절차를 시작하려면, 각 관련 단계에서 설명한 대로 소량의 박테리아 샘플을 채취하여 450 µL의 멸균수에 첨가하십시오. 이 희석된 샘플 100 µL를 사용하여 멸균수로 추가 연속 희석을 수행하십시오. 희석 단계 사이마다 용액을 충분히 혼합하십시오.각 희석액 100 µL를 LB 및 LB AMP 플레이트에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 100개에서 500개 사이의 세균 콜로니가 형성된 LB 플레이트를 확인하십시오. 해당 플레이트와 동일한 세균 희석액이 포함된 대응 LB AMP 플레이트의 콜로니 수를 측정하십시오. 다음 식을 사용하여 플라스미드 소실률을 결정하십시오.플라스미드를 포함하지 않는 박테리아의 비율은 LB 플레이트의 콜로니 수에서 LB amp 플레이트의 콜로니 수를 뺀 후, 이를 LB 플레이트의 콜로니 수로 나누고 100을 곱하여 계산합니다. 플라스미드 손실은 고농도의 carbonic sellin에서 박테리아를 배양함으로써 방지할 수 있습니다. 효과적인 knockdown을 위해, 동물에게 급여하기 전 플라스미드 손실 여부를 확인하고 플라스미드 손실이 15% 미만인 경우에만 계속 진행하십시오. -80°C 냉동고에서 중복 라이브러리 플레이트를 꺼내는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 배양물이 여전히 냉동된 상태에서 호일 씰을 제거하십시오.플레이트의 플라스틱 커버를 교체하고, 중복 라이브러리 플레이트를 평평한 표면에 놓아 실온에서 30분 이내로 해동합니다. 96핀 복제기를 멸균합니다. 이를 에탄올 용액에 담근 후 에탄올을 태워 제거합니다.분젠 버너를 사용하여 핀을 코팅합니다. 불꽃이 꺼질 때까지 기다린 후 이 과정을 반복합니다. 깨끗한 레플리케이터의 핀은 매 사용 전 증류수로 헹구고 멸균해야 합니다.멸균된 복제기를 해동된 중복 플레이트의 웰에 넣고, 이를 사용하여 배양액을 부드럽게 섞습니다. 소량의 배양액이 복제기의 핀에 부착됩니다. 중복 플레이트의 웰에서 복제기를 조심스럽게 꺼내어 옴니 플레이트 표면에 핀 부분이 아래로 향하도록 조심스럽게 놓습니다.한천 표면을 뚫지 않도록 주의하십시오. 레플리케이터의 핀에 있는 박테리아가 한천 표면으로 옮겨갈 수 있도록 레플리케이터를 옴니 플레이트 표면에 3~4초 동안 올려둡니다. 고체 배지에서 플라스미드 손실을 방지하기 위해, 배지에는 2 mg/mL가 포함되어 있습니다.탄산화. 복제기를 제거하고 소량의 박테리아 배양이 한천에 흡수되도록 합니다. 두 플레이트의 복제가 모두 완료되면.다음 날 아침, omni 플레이트를 뒤집은 상태로 37 °C에서 15~18시간 동안 배양합니다. 이 omni 플레이트는 96-well 액체 배양물 접종에 사용하거나 4 °C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다. 벌레 먹이용 박테리아는 omni 플레이트의 박테리아를 사용하여 액체 배양물로 준비합니다. 리피트 피펫과 50 mL combi 팁을 사용하여, 2 mL 튜브 각각에 박테리아 성장 배지 1 mL를 분주합니다.96-웰 플레이트의 딥 웰(deep well)을 준비하고, 리플리케이터를 멸균한 후 박테리아 콜로니가 포함된 옴니 플레이트 표면에 배치하여 핀들이 96개의 박테리아 콜로니 각각에 접촉하도록 합니다. 리플리케이터를 옴니 플레이트 표면에서 딥 웰 플레이트로 조심스럽게 이동시키되, 성장 배지에 완전히 잠길 때까지 핀이 딥 웰의 벽면을 긁지 않도록 주의합니다. 이후 박테리아가 성장 배지로 떨어져 나가게 합니다.딥웰 플레이트의 내벽을 따라 사각형 모양으로 레플리케이터를 천천히 움직입니다. 이때 용액이 튀어 웰 사이에 교차 오염이 발생하지 않도록 주의하십시오. 각 96웰 딥웰 배양 플레이트에는 두 개의 대조군이 포함되어야 합니다.예상되는 녹다운(knockdown) 및 표현형에 대한 양성 대조군으로 DS RNA를 발현하는 박테리아와 음성 대조군으로 빈 DS RNA 벡터를 포함하는 박테리아를 준비합니다. 멸균된 접종 루프를 사용하여 양성 대조군 플레이트에서 단일 웰로 분리된 콜로니를 채취하여 딥 웰 플레이트(deep well plate)의 빈 웰에 접종합니다. 접종한 웰의 위치를 기록합니다.음성 대조군에 대해서도 동일하게 반복합니다. 딥웰 플레이트를 마이크로 쉐이커 위에 평평하게 놓고 37°C에서 650 RPM으로 밤새 흔들어 줍니다. 배양액을 밤새 배양한 후, 96 딥웰 플레이트의 박테리아를 12개로 옮깁니다.공급 플레이트로의 분주는 한 번에 4개 웰씩 수행할 수 있습니다. 12채널 멀티채널 피펫의 세 번째 채널마다 피펫 팁을 장착하십시오. 딥웰 플레이트에서 150 µL의 박테리아 배양액을 취하여 12웰 공급 플레이트의 4개 웰 표면에 분주하십시오.이동 과정에서 한천 표면을 뚫지 않는 것이 중요한데, 이는 벌레가 한천 속으로 파고 들어가 DS RNA를 발현하는 박테리아를 섭취하지 않게 되기 때문입니다. 4개의 웰을 한 세트로 이동시킨 후, 피펫 팁 4개를 새 멸균 피펫 팁으로 교체하고 급이 플레이트의 다음 4개 웰에 접종하십시오. 접종된 플레이트는 박테리아가 한천으로 흡수될 수 있도록 실온의 어두운 곳에 세워서 하룻밤 동안 보관하십시오. 이후 feeding screen을 위해 L1 단계에서 성장이 억제된 C. elegans 유충을 DS RNA 급이 플레이트로 이동시키기 전에 준비하십시오.이전에 준비한 L1 단계 정지 유충의 농도를 결정해야 합니다. 정지된 L1 유충이 들어 있는 삼각 플라스크를 섞어 개체들을 고르게 분산시킵니다. 그다음 10 µL의 aliquot을 취해 씨앗을 뿌리지 않은 6 cm NGM 플레이트 위에 한 방울씩 떨어뜨립니다.플레이트 중앙에 네다섯 방울을 떨어뜨립니다. 피펫의 모든 배지가 완전히 배출되었는지 확인하십시오. 피펫 팁의 끝을 사용하여 벌레 현탁액 방울들을 넓게 펴서 플레이트의 지름 전체에 걸쳐 하나의 연속된 액체 선을 형성합니다.해부 현미경을 사용하여 액체 라인의 한쪽 끝부터 시작하여 액체가 플레이트에 흡수되어 동물이 흩어지기 전까지 다른 쪽 끝까지 모든 동물의 수를 셉니다. 이때 동물을 하나도 놓치지 않도록 해부 현미경의 초점을 지속적으로 조정해야 할 수도 있습니다. 이 계수 절차를 10 µL의 별도 분주액 3회에 대해 반복하여 worm 현탁액 µL당 평균 worm 수를 결정하고, 이 숫자를 삼각 플라스크에 직접 기록합니다.급이 스크리닝을 시작하려면, L1 정지 유충 현탁액과 멸균수를 사용하여 mL당 2000마리의 벌레가 포함된 용액을 준비합니다. 각 12-웰 급이 플레이트에는 동물의 균일한 분포를 보장하기 위해 충분히 혼합된 이 벌레 현탁액 120 µL가 필요하며, 파이펫팅을 위해 동물들을 멸균 리저보어로 옮깁니다. 팁이 세 번째 위치마다 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여, 벌레 용액 10 µL를 급이 플레이트의 박테리아 잔디 위에 직접 옮깁니다.웜이 아가로 파고들어가 D-S-R-N-A를 발현하는 박테리아를 섭식하지 않을 수 있으므로, 아가 표면을 뚫지 않도록 주의하십시오. 공급 플레이트의 매 두 줄마다 웜 용액을 옮긴 후, 웜이 빠르게 가라앉으므로 저장조 내의 웜 용액을 부드럽게 흔들어 다시 섞어주십시오. 초기에 해부 현미경으로 몇 개의 웰을 확인하여 각 웰에 20 to 30마리의 웜이 들어갔는지 확인하십시오. 모든 공급 플레이트에 웜을 옮긴 후, 플레이트를 세운 상태로 20 °C 인큐베이터 내의 습도 유지 상자에 보관하십시오. 다음 날 웜 현탁액이 플레이트에 흡수되면 플레이트를 뒤집어 20 °C 습도 유지 상자에 다시 넣으십시오.이 플레이트의 동물들은 3일 후에 P0 표현형을 관찰하고, 6일 후에 다시 F1 표현형을 관찰할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 egg L 30, dumpy 17, PAT 10, 그리고 on four의 4가지 유전자에 대한 넉다운을 테스트하는 데 사용되었습니다. egg L 30과 on four는 신경계에서 발현됩니다. Pat 10은 체벽 근육에서 발현되며, dumpy 17은 표피 세포에서 발현됩니다.음성 대조군으로서 RNAi에 대한 민감도가 향상된 Erie one Lin 15 B 돌연변이체를 스크리닝에 사용했습니다. 벌레에게는 예상대로 dsRNA를 발현하지 않는 빈 PL 44 40 플라스미드를 포함하는 박테리아를 먹였습니다. 빈 플라스미드를 포함하는 박테리아를 먹인 RIE one Lin 15 B 개체에서는 어떠한 형태학적 또는 행동적 결함도 나타나지 않았습니다.이 사진은 정상적인 신체 자세를 통해 알 수 있듯이 자유롭게 움직이는 동물들을 보여줍니다. 검은색 화살표는 성체 초기의 동물 위치를 나타냅니다. 흰색 화살표는 산란된 알 집단의 위치를 나타냅니다.이 비디오 클립에서는 벌레의 정상적인 행동이 나타나 있습니다. egg L 30은 G-단백질 서브유닛 G alpha Q의 C. elegans 오솔로그(ortholog)를 인코딩합니다. L1 단계의 eri-1 lin-15B 유충에게 egg L 30 dsRNA를 발현하는 박테리아를 먹였을 때, 유충은 성체로 성장하였으나 운동 능력과 산란 행동에서 뚜렷한 결함이 관찰되었습니다. 3일 후, egg L 30에 대한 dsRNA를 섭취한 개체의 100%가 마비되었으며 산란을 할 수 없었습니다.이 사진은 모든 동물이 마비된 동물에게서 전형적으로 나타나는 경직된 외형을 띠고 있음을 보여줍니다. 플레이트에 산란된 알이 완전히 없다는 점 또한 주목해야 합니다. Dumpy 17은 sea의 큐티클 형성에 필요한 콜라겐 단백질을 인코딩합니다.Elgan 및 dumpy 17 null 돌연변이체는 야생형 동물보다 길이가 짧고 몸집이 더 큽니다. 본 실험에서 dumpy 17 dsRNA를 투여한 P0 동물에서는 형태학적 결함이 관찰되지 않았습니다. 그러나 이 그림에 표시된 F1 동물의 98%에서 dumpy 표현형이 나타났습니다.화살표로 표시된 개체를 포함하여 야생의 성체 동물들은 패널 A의 검은색 화살표로 표시된 성체 동물보다 길이가 짧고 더 뚱뚱하다는 점에 유의하십시오. 짧고 뚱뚱한 P zero 동물들이 없다는 것은 dpy-17 유전자 기능이 적절한 신체 형태 형성을 위해 초기 유충 단계에서 필요함을 나타냅니다. pat-10은 칼슘과 결합하는 4개의 EF hand motif를 포함하는 체벽 근육 troponin CA 단백질을 인코딩합니다.본 연구에서는 Pat 10 DS RNA를 섭취한 Erie one Lin 15 B 동물의 100%가 3일 이내에 마비되었으며 알을 낳지 못해 치사 표현형이 나타나는 것이 관찰되었습니다. 동물들이 마비되었음에도 불구하고, 화살표로 표시된 머리 근처의 박테리아가 제거된 것으로 알 수 있듯이 먹이 섭취를 위해 머리 근육은 여전히 움직일 수 있다는 점에 유의하십시오. four는 복측 신경삭 운동 뉴런에서 발현되는 homeo domain 단백질로, 적절한 시냅스 입력에 필요합니다. four는 이전의 DS RNA 섭취 전략에 저항성이 있는 것으로 입증되었기 때문에 본 연구에서 테스트 유전자로 선택되었습니다.본 연구 결과, 라이브러리 조제 과정에서 생성된 4종의 dsRNA 발현 박테리아를 섭취한 동물의 62%가 야생형 동물과 비교하여 운동 행동 결함이 나타났습니다. 야생형 동물은 머리 부분을 자극했을 때 사인곡선 운동을 하며 자유롭게 후진하는 반면, unc-4 null 돌연변이체는 후진하지 않고 몸을 강하게 수축시켜 등쪽 굴곡(dorsal flexor)을 일으키며, 이는 종종 매우 심해져 동물의 머리와 꼬리가 닿아 몸이 말린 상태가 됩니다. 이 표는 테스트한 4가지 유전자 각각에 대해 dsRNA를 섭취했을 때 null 유사 표현형을 보이는 동물의 비율을 나타내며, 각 녹다운(knockdown) 실험마다 100마리의 동물을 조사하였습니다. 이러한 결과는 dsRNA의 성공적인 구현을 위한 플라스미드 유지의 중요성을 입증합니다.간섭 스크리닝을 통해 모든 조직에서 강력하고 투과성이 높은 기능 상실 표현형을 관찰할 수 있습니다. 벌레에게 먹이는 모든 박테리아가 dsRNA를 발현하게 되면, 숙련된 한 사람이 약 두 달 만에 전체 피딩 라이브러리를 스크리닝할 수 있습니다. 처리량을 높이기 위해, 피딩 스크리닝에서는 각 박테리아 클론을 한 번만 테스트합니다.라이브러리의 1차 스크리닝에서 확인된 모든 유전자는 재시험을 거칩니다. 유전자가 양성 히트로 확정되기 위해서는 3회 반복 실험 모두에서 원하는 표현형이 관찰되어야 합니다. 그 후 세균으로부터 플라스미드를 정제하고 서열을 분석하여 인코딩된 유전자의 정체를 확인합니다.유전자가 식별되면, 사용 가능한 L 돌연변이체가 있는지 확인하여 주문하고, 해당 유전자에 대한 추가적인 특성 분석을 수행하기 전에 원하는 표현형이 나타나는지 테스트합니다.

large-scale-gene-knockdown-c-elegans-using-dsrna-feeding-libraries-to

Research

연구

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