Name: 대규모 유전자 넉다운에 C. 엘레 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 dsRNA 먹이 라이브러리를 이용한 대규모 RNAi 스크리닝 방법으로 유전자 기능을 효율적으로 연구하세요. 이 기술은 신경과학 및 유전학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 MH097163의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원되었다. 일부 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40-OD010440)에 의해 투자 된 CGC에 의해 제공되었다.

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 C.에 대형 화면을 수행하기 위해 시판하는 dsRNA 수유 라이브러리를 사용하는 프로토콜을 기술했다 엘레. 우리는 라이브러리를 복제하고 효과적으로 사용하는 모든 지침을 제공합니다. 우리는이 방법은 동물의 조직에서 다른 여러 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별 할 수 있다는 것을 보여준다. 우리가 여기에서 설명하는 표현형 (UNC, EGL, 그리고 DPY) 쉽게 관찰 할 수 있지만,이 프로토콜은 거의 모든 생물학적 과정에 필요한 유전자를 검색에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 웜 (25) 신경 전달에 필요한 유전자를 확인하기 위해 프로토콜을 사용 해왔다. 동물 dsRNA를 표현 박테리아에 공급하면 (일반적으로 P0 스크린, F1 화면에 대한 6~7일을위한 3 일)은, 그들은 먹이 판에서 제거하고 행동 표현형에 대한 검사를 할 수 있습니다. 플라스미드 손실 : ...

C. 역사적으로, 유전 화면 엘레 DNA 내에 무작위 돌연변이를 만들 에틸 메탄 술폰산 등의 화학적으로 돌연변이 동물을 처리하여 수행되었다. 돌연변이 동물의 자손 또는 grandprogeny는 그 전시에게 원하는 이상 표현형을 격리됩니다. 표현형의 원인에 대한 책임 돌연변이 후 노동 집약적 매핑 절차를 통해 또는 돌연변이 벌레의 전체 게놈을 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 이 그들이 모두 이득 함수 지점 기능 상실 표현형을 초래할 수 웜 게놈 내의 영구 병변을 생성 같은 화학적 돌연변이 스크린을 수행하는 많은 장점이 있지만 매핑 절차가 느리고 비싸다. 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi)가 중요한 생물 학적 과정에 관련된 유전자를 확인하는 다른 방법을 제공합니다. 이 방법에서, 내생 유전자의 코딩 서열과 일치하는 dsRNA는 웜에 도입된다.dsRNA에이 가이드가 파괴 1을 대상으로 일치하는 내생의 mRNA를 찾아 바인딩하는 역할을 소형 (21 ~ 22 염기) RNA를 생성하기 위해 생체 내에서 처리된다. 이 절차는 비교적 빠른이지만 dsRNA에 오히려보다 DNA의 mRNA를 표적으로하기 때문에, 단지 환원의 기능 표현형이이 방법을 사용하여 관찰된다. 동물에 dsRNA에 도입 dsRNA를 3 동물을 담가, 또는 dsRNA에 4을 표현하는 동물 박테리아를 공급함으로써, dsRNA에 2의 직접 주입에 의해 달성 될 수있다. 동물의 대부분의 세포는 SID-1, dsRNA에 5를 가져올 수있는 횡단 채널을 표현하는 이러한 전달 방법의 각 조직 최저 효과를 일으킬 수 있습니다. 원래시 개별 유전자의 발현을 녹다운하는 역 유전학 방식으로 사용이 급전 라이브러리의 개발은 지금은 대규모 유전자 스크린을 허용한다. 시판하는 dsRNA 라이브러리는 BA를 포함모든 C의 55 % 또는 87 % 중 하나를 나타내는 cterial 클론 elegans의 유전자 6, 7. 불행하게도, 대규모 dsRNAi 공급 화면은 종종 변수 최저 효율 8-10 결과. RNAi에 의한 최저의 절대 레벨이 쉽게 측정되지 않지만, 대형 화면에서 관찰 감소 최저 효율은 RNAi에 의해 열화를 피할 잔류 유전자 특이의 mRNA에 의해 발생되어야한다. 이것은, 차례로, 이러한 화면에 동물에 공급하는 dsRNA 박테리아 플라스미드 손실의 직접적인 결과 일 수있다. 넉다운 효과를 먹인 동물 (11)를 제어하기 위해 비교 될 때 (있는 경우)이 아이디어를지지, 동물은 박테리아의 50 % 만이 표적 유전자의 dsRNA에 대하여을 표현하는, 세균의 혼합물을 공급 극적으로 감소 보여준다. C. 대부분의 유전자로 dsRNAi 화면을 수행 할 때 유전자 최저의 정도는 중요한 문제가됩니다 엘레 haplosufficient이며, 따라서 유전자의 발현은 적어도 50 %의 t에 의해 감소되어야O 기능 상실이 12 표현형의 원인이됩니다. 우리는 대형 스크린을 수행하기 이전에 발행 된 먹이 프로토콜을 사용하고 다른 사람 8-10에서보고 같은 변수 최저의 효과를 발견했다. 가능한 원인에 대한 검색, 우리는 화면에서 동물에 공급되는 박테리아의 약 60 %는 dsRNA에 플라스미드를 잃은 것으로 나타났습니다. 우리는 극적으로 감소 또는 제거 플라스미드 손실을 크게 최저 효율을 향상 도서관 복제 및 검사 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 C.에서 대형 스크린을 수행하기에 적합 엘레하고 시판하는 dsRNA 라이브러리 중 하나 하나를 선별하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 화면 동안 동물에 공급되는 박테리아의 본질적으로 100 % dsRNA에 인코딩 플라스미드를 유지하고 검사를 모든 조직의 기능 표현형의 강력하고 고도로 침투 손실이 발생할 수 있음을 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>96-well Falcon flat bottom plate </td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>멸균</td></tr><tr><td>접착 호일</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 옴니플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 깊이 96-웰 폴리프로필렌 Masterblock</td><td>USA Scientific</td><td>5678-0285</td><td></td></tr><tr><td>딥 웰 플레이트용</td> 오토클레이브 뚜껑 <td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50ml 콤비팁</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>개별 포장</td></tr><tr><td>Reservoir</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>오토클레이브 12</td></tr><tr><td>웰 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>개별 포장</td></tr><tr><td>dsRNA 공급 라이브러리</td><td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>스토어 -80 &deg; C</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린은</td><td></td><td></td><td>배송에 2-4주를 허용합니다 <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>웜 플레이트</td></tr><tr>용<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Brayer roller</td><td>USA Scientific</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211; kel 96-pin replicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>가능한 마이크로쉐이커</td><td>Thomas Scientific</td><td>1231A93</td><td>3 mm 궤도</td></tr><tr><td>12 채널 다채널 피펫 (0.5-10 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12채널 멀티채널 피펫 (30-300 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>리피터 플러스 수동 피펫터</td><td>USA Scientific</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; c. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsrna를 먹이는 라이브러리 사용

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

dsRNA에 표현 벌레 박테리아를 먹이로 RNA 간섭 C. 유전자의 기능을 평가하는 유용한 도구이다 엘레. 유전자의 작은 숫자가 최저 대상 때이 전략은 잘 작동하는 동안, 대규모 공급 화면은 자신의 유틸리티를 제한하는 변수 최저 효율을 보여줍니다. 우리는 이전에 출판 된 RNAi의 최저 프로토콜을 해체하고 감소 최저의 기본 소스는 동물에 공급되는 박테리아에서 dsRNA를 코딩하는 플라스미드의 손실에 기인 할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 크게 줄이거 나 효율, 높은 처리량 최저를 달성하기 위해 플라스미드 손실을 제거하는 dsRNA에 먹이 프로토콜을 개발했습니다. 우리는이 프로토콜은 C의 아래 강력한 재현 노크를 생산 것을 보여 엘레 신경 등 다양한 조직 유형, 유전자, 그리고 대형 화면에 효율적으로 최저를 허용합니다. 이 프로토콜은 시중에서 dsRNA에 먹이를 사용도서관은 도서관을 복제하고 dsRNA에 화면을 수행하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 프로토콜은 정교한 장비의 사용을 필요로하지 않으며, 따라서 어떠한 C. 의해 수행 될 수있다 실험실 엘레 간스.

P0의 최저 표현형은 dsRNA에 세균을 표현하는 동물 먹이를 2 ~ 3 일 후에 나타나기 시작합니다. 일부 초기 표현형은 유충의 체포와 치사를 포함하고있는 모든 공급 우물 2 ~ 3 %가 관찰되어야한다. 이 같은 표현형은 F1 세대의 동물에서 관찰됩니다. 부화에 실패 F1 계란의 존재는 또 다른 일반적인 F1 표현형, 그리고 함께,이 세 가지 표현형은 F1 화면에있는 우물의 약 10 %에서 관찰됩니다. 우리는 P0과 F1 표현형 모두 조직 유형의 다양한 표현 몇개의 유전자 녹다운의 효과를 조사하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 신경 조직에 최저의 효과를 테스트하고 싶었 기 때문에, 우리는 에리-1을 사용, 우리의 스크린에서 LIN-15B의 돌연변이. 에리-1 및 LIN-15B의 돌연변이는, RRF-3의 돌연변이와 함께, RNAi의 8,13,14에 향상...

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

이 절차의 전체적인 목표는 박테리아 dsRNA 피딩 라이브러리를 사용하여 C. elegans에서 대규모 RNA 간섭 스크리닝을 수행함으로써 유전자 발현을 억제하는 것입니다. 이는 먼저 dsRNA 라이브러리에서 박테리아 클론을 배양함으로써 달성됩니다. 플라스미드 소실을 방지하는 성장 조건 하에서, 각 기본 라이브러리 플레이트를 복제하는 것으로 시작하여, 96-웰 복제 라이브러리 플레이트를 이용해 agar omni 플레이트 위에 박테리아의 일시적인 스톡을 생성합니다.이러한 옴니 플레이트의 박테리아를 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 벌레 먹이 플레이트 표면으로 옮깁니다. 라이브러리의 각 박테리아 클론은 하나의 C. elegans 유전자를 넉다운시키기 위해 표적화하는 고유한 D-S-R-N-A 인코딩 플라스미드를 보유하고 있습니다. 두 번째 단계는 동기화된 벌레를 먹이 플레이트 위에 배치하는 것입니다.다음으로, 벌레를 20 °C의 가습 챔버에서 며칠 동안 배양합니다. 벌레가 박테리아를 섭취함에 따라 유도된 DS RNA가 동물의 장 내로 방출되며, 이후 주변 조직으로 확산되어 전신적인 녹다운 효과를 일으킵니다. 마지막 단계는 먹이를 섭취한 동물을 관찰하여 유전자 특이적 녹다운으로 인해 나타나는 표현형 효과를 확인하는 것입니다.이러한 표현형 분석은 연구 대상이 되는 생물학적 과정에 중요한 유전자를 식별하는 데 사용됩니다. 벌레 생식선에 이중 가닥 RNA를 미세 주입하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 처리량이 높다는 점입니다. 피딩 라이브러리를 사용하면 단 몇 주 만에 거의 모든 sea elgin 유전자의 생물학적 기능을 조사할 수 있습니다.대부분의 C. elegans 유전자가 반접합 충분성(haplo sufficiency)을 가지기 때문에, 많은 연구실에서 이러한 넉다운(knockdown) 방식에 어려움을 겪어 왔습니다. 따라서 기능 상실 표현형을 유도하기 위해서는 RNA 넉다운을 통해 유전자 발현을 50% 이상 감소시켜야 합니다. 강력한 유전자 넉다운을 보장하려면, 벌레에게 먹이는 모든 박테리아가 이중 가닥 RNA 플라스미드를 발현하는 것이 매우 중요합니다.플라스미드 소실 결정 절차를 시작하려면, 각 관련 단계에서 설명한 대로 소량의 박테리아 샘플을 채취하여 450 µL의 멸균수에 첨가하십시오. 이 희석된 샘플 100 µL를 사용하여 멸균수로 추가 연속 희석을 수행하십시오. 희석 단계

large-scale-gene-knockdown-c-elegans-using-dsrna-feeding-libraries-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을...

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

RNAi는 예쁜꼬마선충 연구자들이 사용할 수 있는 강력한 유전 도구입니다. 이 동영상은 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 기생충을 처리하는 방법을 소개합니다.

액체 배양에서 RNAi 공급: 예쁜꼬마선충에서 유전자 발현을 knockdown하는 고처리량 방법

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

Metagenomic 도서관 대규모 화면

배우세요 C. elegans에서 dsRNA 먹이 라이브러리를 이용한 대규모 RNAi 스크리닝 방법으로 유전자 기능을 효율적으로 연구하세요. 이 기술은 신경과학 및 유전학 연구에 필수적입니다.

대규모 유전자 넉다운에

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