골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

이 절차의 전체적인 목적은 Gold Cox 염색 기법을 사용하여 생애 초기 촉각 자극 이후 뉴런에서 나타나는 형태학적 변화를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생후 3일부터 생후 21일까지 하루 세 번 촉각 자극을 실시합니다. 두 번째 단계는 동물들이 분석 대상 연령에 도달했을 때 관류를 실시하고 뇌를 Goldy cos 용액에 보관하는 것입니다.

다음으로, Aome를 사용하여 뇌를 절편화합니다. 마지막 단계는 GOGI 공동 염색 기법을 사용하여 뇌를 함침시키는 것입니다. 최종적으로, GOGI 공동 절차는 개별 뉴런을 시각화하는 데 사용되며, 이를 통해 형태학적 변화를 분석할 수 있습니다.

Goy Cox 기법의 장점은 뉴런의 구조를 정량화하고 이를 행동 결과와 상관시킬 수 있다는 점입니다. 촉각 자극이 이러한 질환의 행동적 및 해부학적 회복 모두에 효과적인 것으로 나타났으므로, 이 기법의 영향은 발달 장애 분야까지 확장됩니다. 이 방법은 쥐의 신경 해부학적 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 다른 모델 생물 및 인간의 뇌 조직에도 적용될 수 있습니다.

경험 의존적 가소성에 대한 이해를 돕기 위해, 동물들은 출생 후 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 12시간 광-암 주기로 사육됩니다. 각 암컷 쥐는 새끼들과 함께 개별 사육됩니다. 핸들링과 관련된 추가적인 스트레스를 방지하기 위해, 새끼 쥐들은 P3부터 촉각 자극을 받습니다.

아침 촉각 자극 세션 전에 새끼 쥐의 무게를 측정한 후, 새끼 쥐를 홈 케이지에 넣은 상태로 별도의 테스트실로 이동시킵니다. 홈 케이지를 24 °C로 설정된 가열 패드 위에 놓습니다. 촉각 자극 준비가 되면, 어미 쥐를 홈 케이지에서 꺼내어 먹이와 물이 제공된 임시 케이지에 넣습니다.

어미 쥐와 임시 케이지를 사육실에 둡니다. 그다음, 단단한 판을 사용하여 홈 케이지를 두 개의 구역으로 나눕니다. 그런 다음 각 배란기 새끼 쥐의 절반을 무작위로 배정하여 촉각 자극을 가하고, 나머지 절반은 대조군으로 사용합니다.

그룹을 구분하기 위해 새끼 쥐의 뒷다리와 꼬리에 유성 마커로 표시를 하고, 촉각 자극군 새끼 쥐들은 케이지의 한쪽에, 대조군 새끼 쥐들은 반대편에 둡니다. 부드러운 깃털 먼지떨이와 같은 도구를 사용하여 타이머를 15분으로 설정합니다. 촉각 자극군의 모든 새끼 쥐를 동시에 15분 동안 연속적으로 브러싱합니다.

새끼 쥐들은 보통 서로 뭉쳐서 깊은 수면 주기에 들어간 것처럼 보이므로, 모든 새끼 쥐를 한 번에 자극하기가 매우 쉽습니다. 새끼 쥐들이 성장함에 따라 활동성이 증가하며, 일부는 걷거나 주변을 탐색하기도 합니다. 세션 동안 돌아다니는 새끼 쥐들은 다시 그룹으로 옮겨 각 개체가 동일한 자극을 받을 수 있도록 합니다.

15분 동안의 촉각 자극 후, 어미를 케이지로 돌려보내고 케이지를 번식실로 다시 운반합니다. 이 과정을 하루에 세 번 반복합니다. 마지막 촉각 자극 세션 후 19일이 지나면, 새끼를 어미로부터 이유시킵니다. 새끼들은 같은 성별의 이유된 다른 동물 5~6마리와 함께 케이지에 수용하며, 실험 대상 연령에 도달할 때까지 표준 사육 조건 하에서 쥐들을 방해하지 않고 둡니다.

동물이 100일령에 도달했을 때 시료를 수집합니다. 안락사 및 심장 내 관류 후 뇌를 적출합니다. 이때 소뇌가 손상되지 않도록 주의합니다.

뇌를 Goldy Cox 용액 20 milliliters가 채워진 불투명한 Nalgene 병에 넣고 14일 동안 보관합니다. 14일 후, 용액을 30% sucrose 용액으로 교체합니다. 절편 제작 전까지 뇌를 sucrose 용액에 2~5일 동안 보관합니다.

찢어짐이나 불균일한 절단을 방지하기 위해 Sano 아크릴 접착제로 절단 스테이지에 고정하기 전 뇌의 수분을 닦아내고, 뇌 전체가 스테이지에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 다음으로, Vibram 저장조에 6% sucrose 용액을 절단 날이 잠길 때까지 채웁니다. Vibram의 속도와 진폭을 5로 설정하십시오.

뇌를 200 micron 두께의 절편으로 자르고, 이를 2% 젤라틴 처리된 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 관심 있는 모든 절편을 수집할 때까지 절편이 마르지 않도록 주의하십시오. 습기를 머금은 거즈 페이퍼로 압력을 가해 절편을 슬라이드에 밀착시킵니다.

슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 습도 챔버에 최소 12시간, 최대 4일을 초과하지 않게 보관하십시오. 염색 절차를 시작하려면 12개의 유리 염색 접시에 라벨을 붙여 준비하십시오. 먼저, 슬라이드를 증류수에 1분 동안 담급니다.

다음으로, 슬라이드를 수산화암모늄에 넣고 30분 동안 암소 보관합니다. 증류수에서 1분간 추가 처리한 후, 슬라이드를 Kodak Fix에 넣고 빛을 차단한 상태로 30분 동안 둡니다. 슬라이드를 다시 한번 증류수에 넣은 다음, 농도가 단계적으로 높아지는 알코올 용액 시리즈를 사용하여 탈수 처리합니다.

마지막 알코올 세척 후, 슬라이드를 1/3 용액에 15분 동안 담급니다. 마지막으로, 슬라이드를 hemo D에 15분 동안 담급니다. 준비가 되면 paramount를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 덮고, 현미경으로 관찰하기 전에 슬라이드를 공기 중에서 건조시킵니다.

발달 과정 중 촉각 자극을 받은 쥐의 Golgi Cox 염색된 파라메탈 뉴런(parametal neuron)의 대표 사진입니다. 확대 사진은 말단 수지상 돌기에 있는 수지상 돌기 가시(dendritic spines)를 보여줍니다. 왼쪽의 밝은 이미지는 대조군 쥐의 사진이며, 오른쪽의 어두운 이미지는 촉각 자극을 받은 쥐의 사진입니다.

이 그래프는 발달 과정 동안 촉각 자극을 받은 성체 쥐와 그렇지 않은 성체 쥐의 CG 3 영역 뉴런에서 나타나는 평균 정단 및 기저 수지상 돌기 복잡성을 나타냅니다. 이 절차를 따르면, 추가적인 질문이 생겼을 때 뇌 전체를 염색해 두었으므로 동일한 뇌 조직으로 돌아가 해당 질문에 대한 답을 찾을 수 있다는 장점이 있습니다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 연구자들이 머리 외상이나 다른 형태의 신경학적 손상 이후 치료법으로서 촉각 자극의 유용성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 기술은 뇌 외상 및 발달 장애의 치료 가능성을 탐구하려는 신경과학 연구자들에게 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 새끼 쥐에게 촉각 자극이라는 풍부한 경험을 제공하는 방법과 개별 뉴런 및 시냅스를 시각화하는 수단에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.