2013년 9월 25일
이 논문은 쥐의 새끼의 촉각 자극과 신경 세포의 형태의 후속 골지 - 콕스 염색에 대한 절차를 설명합니다. 촉각 자극은 가정용 먼지 떨이로 새끼를 쓰다듬어하여 주 산기 투여되는 긍정적 인 경험이다. 골지 - 콕스 염색은 전체 신경 세포의 시각화를 허용하는 신뢰할 수있는 절차입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 금 G Cox 염색 기술을 사용하여 생애 초기에 촉각 자극을 따르는 뉴런의 형태학적 변화를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 출생 후 3일째부터 출생 후 21일째까지 하루에 세 번 촉각 자극을 투여함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 동물이 탐구 연령에 도달하면 동물을 관류하고 뇌를 Goldy cos 용액에 저장하는 것입니다.
다음으로, Aome으로 뇌를 절단합니다. 마지막 단계는 GOGI co 염색 기술로 뇌를 함침시키는 것입니다. 궁극적으로 GOGI co 절차는 형태학적 변화를 분석할 수 있는 개별 뉴런을 시각화하는 데 사용됩니다.
Goy Cox 기법의 장점은 뉴런의 구조를 정량화하고 이를 행동 결과와 연관시킬 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 촉각 자극이 이러한 장애로부터 행동 및 해부학적 회복에 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에 발달 장애로 확장됩니다. 이 방법은 쥐의 신경 해부학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 모델 유기체 및 인간 뇌 조직에도 적용할 수 있습니다.
경험된 의존적 가소성에 대한 이해를 돕기 위해, 동물은 출생 후 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 12시간 밝은 어두운 주기로 유지됩니다. 각 암컷 쥐는 자손과 함께 개별적으로 수용됩니다. 취급과 관련된 추가 스트레스를 피하기 위해 새끼는 P 3부터 촉각 자극을 받습니다.
아침 촉각 자극 세션 전에 새끼의 무게를 잰 후 집 케이지에 있는 새끼를 별도의 검사실로 운반합니다. 섭씨 24도로 설정된 가열 패드에 가정용 케이지를 놓습니다. 촉각 자극을 받을 준비가 되면 집 우리에서 댐을 제거하고 음식과 물이 있는 임시 우리에 넣습니다.
댐과 임시 케이지를 사육장에 두십시오. 다음으로, 뻣뻣한 보드를 사용하여 홈 케이지를 두 반으로 나눕니다. 그런 다음 각 새끼의 새끼 중 절반을 무작위로 할당하여 촉각 자극을 받고 나머지 절반은 대조군 역할을 합니다.
뒷다리와 꼬리에 영구 마커를 표시하여 그룹을 구별하고 새끼를 케이지의 한쪽에 촉각 자극 그룹에 배치하고 다른 쪽에 새끼를 제어합니다. 먼지떨이와 같은 부드러운 깃털을 사용하여 타이머를 15분으로 설정합니다. 촉각 자극 그룹의 모든 강아지를 15분 동안 연속으로 동시에 빗질합니다.
어린 새끼 쥐는 일반적으로 함께 모여 깊은 수면 주기에 들어가는 것처럼 보이므로 한 번에 모든 새끼를 자극하는 것이 매우 쉽습니다. 새끼는 나이가 들면서 더 활동적이 되며 일부 새끼는 걷고 조사합니다. 세션 중에 방황하는 강아지를 그룹으로 이동하여 각 강아지가 동일한 자극을 받도록 합니다.
15분 동안 촉각 자극을 가한 후 어미를 케이지로 되돌리고 케이지를 사육실로 다시 운반합니다. 이 과정은 하루에 세 번 반복됩니다. 19일 동안 마지막 촉각 자극 세션 후 어미로부터 새끼를 젖을 떼고 새끼는 5-6마리의 다른 젖을 뗀 동성 동물과 함께 우리에 수용되며 쥐가 탐구 연령에 도달할 때까지 표준 주택 조건에서 방해받지 않고 방
치합니다.샘플은 동물이 생후 100일이 되면 수집됩니다. 안락사와 심장 내 관류 후 뇌를 추출합니다. 소뇌를 온전하게 유지하도록 주의하십시오.
20ml의 Goldy Cox 용액으로 채워진 불투명한 Nalgene 병에 뇌를 넣고 14일 동안 보관합니다. 14일 후 용액을 30% 자당 용액으로 교체하십시오. 절단을 위해 절편하기 전에 2-5일 동안 뇌를 자당 용액에 보관하십시오.
찢어지거나 고르지 않은 절단을 방지하기 위해 Sano 아크릴 접착제로 절단 단계에 고정하기 전에 뇌를 건조시키고 전체 뇌가 단계에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 다음으로, Vibram 저장소가 절단 블레이드를 덮을 때까지 6% 자당 용액을 채웁니다. Vibram의 속도와 진폭을 5로 설정합니다.
뇌를 200미크론 절편으로 자르고 절편을 2% 젤라틴 현미경 슬라이드에 놓습니다. 관심 있는 모든 섹션이 수집되었을 때 섹션을 섹션링하는 동안 섹션을 젖은 상태로 유지하십시오. 축축한 종이로 압력을 가하여 슬라이드에 섹션을 누릅니다.
슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 최소 12시간 동안 습도 챔버에 보관하지만 4일을 넘지 않도록 합니다. 염색 절차를 시작하려면 12개의 유리 염색 접시에 라벨을 붙이고 준비합니다. 먼저 슬라이드를 증류수에 1분 동안 담급니다.
다음으로, 슬라이드를 수산화암모늄에 넣고 30분 동안 어두운 곳에 보관합니다. 증류수에 1분 더 담근 후, 차광과 함께 슬라이드를 Kodak Fix에 30분 동안 놓습니다. 일련의 등급이 매겨진 알코올 용액에서 탈수하기 전에 슬라이드를 증류수에 한 번 더 놓습니다.
마지막 알코올 세척 후 슬라이드를 세 번째 용액에 15분 동안 넣습니다. 마지막으로 슬라이드를 헤모 D에 15분 동안 놓습니다. 준비가 되면 파라마운트를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 놓고 슬라이드를 자연 건조시킨 후 현미경으로 검사합니다.
다음은 발달 중에 촉각 자극을 받은 쥐의 Golgi Cox 염색 파라메탈 뉴런의 대표적인 사진입니다. 확대된 사진은 말단 수상돌기의 수지상 가시를 보여줍니다. 왼쪽의 밝은 이미지는 대조군의 쥐이고 더 어두운 이미지는 촉각 자극을 받은 쥐의 이미지입니다.
이 그래프는 발달 중에 촉각 자극을 받았거나 받지 않은 성체 쥐의 CG 3개 영역에 있는 뉴런의 평균 정점 및 바슬러 수상돌기 복잡성을 나타냅니다. 이 절차를 따름으로써, 우리는 추가적인 질문을 하고 싶을 때, 뇌 전체를 염색한 것이고, 그래서 다시 돌아가서 같은 뇌 조직을 사용하여 그 질문에 답할 수 있다는 이점을 얻을 수 있다. 이러한 기술을 개발함으로써 우리는 연구자들이 두부 외상 또는 기타 형태의 신경 손상 치료 요법으로 촉각 자극의 유용성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 기술은 신경 과학 연구자들이 뇌 외상 및 발달 장애를 치료할 수 있는 잠재력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 촉각 자극의 풍부한 경험과 개별 뉴런과 시냅스를 시각화하는 수단을 강아지에게 제공하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
본 연구는 흰쥐 새끼의 촉각 자극 절차와 후속 뉴런 형태의 Golgi-Cox 염색을 설명합니다. 촉각 자극은 태아 기간 동안 시행되며, Golgi-Cox 염색은 전체 뉴런의 시각화를 가능하게 합니다.
Understanding how early-life experiences induce stable neuronal changes is critical for de-risking neurodevelopmental drug targets. Tactile stimulation as a controlled environmental variable enables mechanistic interrogation of experience-dependent plasticity, supporting target validation in CNS disorders. Golgi-Cox staining provides quantitative morphological readouts that correlate structural changes with functional outcomes, enhancing predictive confidence in preclinical models.
This workflow supports early discovery through target validation, where tactile stimulation serves as an environmental modulator and Golgi-Cox staining delivers structural endpoints for assay development and screening cascades.