의 얼굴 이식는 Xenopus laevis의 태아

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 xenopus Levi 배아 사이에 극도의 전방 도메인 또는 EAD 안면 조직을 이식하는 것입니다. 이는 먼저 서로 다른 유전적 배경을 가진 기증자와 수혜자 배아에서 EAD 조직을 제거함으로써 이루어집니다. 다음으로, 공여자 배아의 EAD Explan을 수혜 배아의 얼굴에 삽입한다.

마지막 단계에서, 이식된 배아는 관찰을 위해 수정 후 60-70시간 동안 유지됩니다. 궁극적으로, 명시야 및 형광 현미경 검사를 사용하여 이식된 동물의 c 두개안면 발달 변화를 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 C 두개안면 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 구강 발달에 필요한 새로운 신호가 극단적인 전방 영역에서 상승하는 것과 같은 C 두개안면 기형에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

팁은 비교적 단단해야 하지만 절삭 공구로 사용할 수 있을 만큼 좁아야 합니다. 그런 다음 분젠 버너에 불을 붙이고 유리 목초지 피펫의 끝을 화염의 파란색 부분에 놓고 피펫을 회전시켜 팁이 녹고 구멍이 완전히 밀봉되어 닫힌 둥근 끝을 형성하도록 합니다. 유리 브리지를 만들려면 긴 표준 패턴 집게를 사용하여 3mm x 3mm 크기의 커버 슬립 유리 덩어리를 조심스럽게 부수십시오.

그런 다음 덮개 조각을 잡고 핀셋으로 미끄러지고 네 모서리가 모두 부드러워지고 아래쪽으로 구부러져 작은 유리 돔을 형성할 때까지 유리를 화염 속에 넣습니다. 다음 줄에는 빨간색, 흰색 또는 노란색 모델링 점토가 있는 60mm 플라스틱 페트리 접시입니다. 그리고 접시에 3%phi를 채웁니다.

0.5 XMBS 솔루션을 호출합니다. 그런 다음 파이프 애완 동물 도구인 화염 목초지를 사용하여 실험 48시간 전에 20기 배아체의 깊이에 대해 40-60개의 얕은 2-3mm 함몰부를 만듭니다. 암컷 개구리에서 알을 얻어 체외에서 수정시킵니다.

그런 다음 배아에 뚜껑이 있는 막, GFP mRNA 및 기타 메시지를 주입한 후 19-20기에 도달할 때까지 48시간 동안 섭씨 15도에서 보관합니다. 이식 실험 당일에는 형광 현미경을 사용하여 균일하고 밝은 형광을 보이는 주입된 배아를 선택합니다. 70% 에탄올이 함유된 수술 표면 실체 현미경 및 도구를 닦은 후 5번 45 듀몬트 집게를 사용하여 실체 현미경으로 선택한 각 배아의 Vitale 막을 제거합니다.

그런 다음 팁이 절단된 플라스틱 눈금이 매겨진 전달 피펫을 사용하여 숙주 배아를 작동 접시로 이동합니다. 배아를 공기의 물 계면에 만지지 않도록 주의하십시오. 배아의 뒤쪽이 아래로 향하게 하여 점토 함몰부에 삽입하고 집게를 사용하여 각 배아 기저 주위의 점토를 부드럽게 닫아 머리가 함몰부에서 튀어나오도록 합니다.기증자 얼굴을 먼저 제거하려면 당겨진 바늘 중 하나를 시멘트샘 왼쪽에 있는 배아의 머리에 충분히 깊숙이 삽입하여 배아 외부에서 머리를 통해 앞창자로 통과

바늘을 머리의 왼쪽에서 오른쪽으로 튕겨 시멘트 샘의 전체 너비를 가로질러 깨끗하게 자릅니다. 그런 다음 시멘트샘의 왼쪽 경계에 있는 절단 시작 부분에 바늘을 놓고 바늘이 왼쪽 눈 아래쪽에 도달할 때까지 바늘을 위쪽으로 튕겨 시멘트샘의 왼쪽 경계에서 왼쪽 눈 아래쪽까지 수직 절단을 만듭니다. 그런 다음 바늘을 시멘트샘의 오른쪽 경계에 놓고 바늘이 오른쪽 눈 바닥에 닿을 때까지 바늘을 위쪽으로 튕겨 시멘트샘의 오른쪽 경계에서 오른쪽 눈 아래쪽까지 수직 절단을 만듭니다.

그런 다음 조직을 완전히 절제하려면 왼쪽 눈 아래쪽에서 오른쪽 눈 아래쪽으로 바늘을 튕겨 조직을 자유롭게 하는 수평 절단을 만듭니다. 이제 절제 조직을 바늘 끝에 부드럽게 밀어 넣고 완충액을 통해 숙주 배아가 들어 있는 접시 부분으로 들어 올립니다. 방금 시연된 숙주 배아에서 조직을 절제하고, 숙주 EAD 엑스플란을 버리고, 결과 숙주 전체에 공여자의 엑스플랜을 삽입한다.

기증자 조직이 올바른 위치에 있고 조심스럽게 완전히 삽입되면, 미리 준비된 유리 브릿지 중 하나를 배아의 얼굴 위에 올려 이식을 제자리에 고정하고, 브릿지의 끝을 점토에 삽입하여 안정화합니다. 수술 후 배아는 2-3시간 동안 실온에서 방해받지 않고 방치됩니다. 그런 다음 이식이 치유되면 배아의 유리 다리와 배아 바닥 주변의 점토를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 플라스틱 눈금이 매겨진 전사 피펫을 사용하여 배아를 함몰부에서 부드럽게 진공 청소기로 청소합니다. 배아를 적절하게 표시된 페트리 접시에 옮기고, 절반은 겐타마이신이 보충된 깨끗한 0.1 XMBS로 채워져 배아가 40기에 도달할 때까지 며칠 동안 섭씨 15-18도에서 배아를 성장시킵니다. MBS 용액을 매일 교체하고 형광을 통해 이식된 조직을 관찰하여 엑스플랜이 제자리에서 치유된 상태로 유지되는지 확인합니다.

이식된 조직은 방금 시연된 바와 같이 이식 후 숙주 머리에 완전히 삽입되어야 하며, 이식이 성공하기 위해서는 숙주 개구부에 올바른 크기여야 합니다. EAD 조직은 어떤 식으로든 머리에서 돌출되어서는 안 되며, 이는 부적절하게 배치된 설명의 두 이미지에서 볼 수 있습니다. 또한, 얼굴 이식은 여기에 표시된 것처럼 기증자 신체에서의 위치를 기준으로 회전해서는 안 됩니다.

몇 시간 후에 이식된 조직과 주변 얼굴이 치유되어야 하며, 다음 날까지 배아가 이 이미지에 표시된 예와 같이 나타나야 합니다. 방금 시연된 형광 현미경 검사는 치유 과정에서 이식이 제자리에 남아 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 42단계에서 이식된 대조 조직은 입에 기여하고 형광 녹색을 유지합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 한 배아에서 다른 배아로 EAD 조직을 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

EAD의 어떤 배아층 또는 영역이 안면 발달에 가장 중요한지 확인하기 위해 이 방법의 사용을 촉진합니다.