Name: 글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 글루타민산과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 기법을 통해 시냅틱 통합을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경과학에서 후시냅틱 신호 통합을 정밀하게 조사하는 데 활용됩니다.

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우리는 신중하게 원고를 읽는 한스 라이너 간척지, 마틴 마차부 워커 잭슨 감사합니다. , neurodegenerative 질병의 우수성 센터 (COEN, 저자는 국가 노스 린 - 웨스트 팔리 (SR), 전산 신경 과학 BMBF-Projekträger DLR 미국 - 독일어 협업 (SR CRCNS)의 연구 MIWF의 사역에 의해 제공되었다 자금을 받았다; SR) 및 본 교내 자금 지원 프로그램의 대학 (BONFOR, SR).

1. 시스템 요구 사항 <ol><li> 현미경 시스템 : 수상 돌기의 좋은 시각화 중요합니다. 가능한 경우, 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용합니다. 사파이어 초고속-펄스 레이저 (카멜레온 울트라 II, 코 히어 런트)와 높은 NA 목적 : 본 실험에서 우리는 티타늄을 갖춘 TRIM 범위 II, LaVision 바이오텍, 빌레펠트, 독일, 울티마 IV 시스템, 프레리 기술, 매디슨, 위스콘신 사용 (60X, 0.9 NA, 올림푸스) 우리는 패치 피펫을 통해 형광 염료로 가득했던 돌기를 시각화 수 있습니다. 사진 손상이 2 광자 스캔을 사용하여 덜 심각한 것으로 생각되지만, 레이저 전력을 감소 (조직에서 아래의 8 MW) 및 체류 시간 (아래 1 마이크로 초) 또는 가능한 한 많이. </li><li> 두 번째 가능성은 최대한 노출 시간을 줄이기 위해 인수 기적 넓은 필드 형광 광원 (LED 또는 형광 램프)을 유발하는 것입니다. 우리는 통합 된 광원 (TILLPho과 단색을 사용했습니다Dodt 대비 적외선 조명 (TILLPhotonics, Grafelfing에서, 독일)가 장착 된 자이스 Axioskop 2 FS 직립 현미경 토닉, Grafelfing에서, 독일). 우리의 실험에서 노출 시간을 밀리 일반적으로 10에서 최대였다. 30 밀리. </li><li> 2 채널 마이크로 이온 도입 시스템을 예를 들어 MVCS-C-02 (NPI 전자, 탐, 독일)의 빠른 용량 보정., 빠른 마이크로 이온 도입 앰프를 사용 뾰족한 이온 도입 미세 전극은 25 저항이 - MΩ 100 (결정적 팁 크기와 피펫 모양에 따라), 그리고 iontophoretic 앰프의 용량 보정이 최적으로 조정되어있는 경우 빠른 상승 시간은 달성 될 수있다. 이 빠른 보상 iontophoretic 피펫을 밀리 초 이하의 범위에서 간단하고 신속한 증상과 전류 펄스를 적용함으로써 1 ㎛ 13 아래에 자리 크기의 높은 공간 해상도를 가진 송신기를 배출 할 필요가 있습니다. 이온 도입 앰프 알 수 있습니다우리가 실험실에서 테스트하지 않은 여러 다른 회사에서 너무 없습니다. 이 장치는 정전 용량 보상 회로가 장착되어 있지 우리의 지식이다. </li></ol> 2. 솔루션을 준비합니다 <ol><li> 인공 뇌척수 (ACSF)과는 실험 설계에 필요한되는 내부 솔루션을 준비합니다. 필요한 내부 솔루션에 유일한 추가는 광학 기기에 따라 빨간색이나 녹색 형광 염료 (예 : 50-200 μM 알렉사 형석 488 또는 594 하이 드라 지드, Invitrogen 사)입니다. 정상 ACSF을 위해, 60 염화나트륨, 100 자당, 2.5 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 1 염화칼슘 2, 5 MgCl 2, 20 포도당 : MM의 해부에 사용할 수 ACSF 자당, 여기 예제 밀리미터에있는 패치 클램프 실험 해결책 : 125의 NaCl, 3 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 2.6 염화칼슘, 1.3 MgCl 2, 15 포도당. </li><li>모든 세포 솔루션을 지속적으로 (95 % O 2 5 % CO 2) Carbogenize. </li><li> 밀리미터, 예를 들어, 내부 솔루션을 준비 : 140 K-글루코 네이트, 7 KCl을, 5 HEPES-산, 0.5 MgCl 2, 5 포스 포 크레아틴 (phosphocreatine), 176 EGTA, 50과 - 200 μM 알렉사 488. </li><li> 글루타민산 염에 대한 마이크로 이온 토 포레 시스는 150 밀리미터 글루탐산과 솔루션을 준비하고 수산화 나트륨으로 7.0으로 산도를 조정합니다. 50 -200 μM 알렉사 형석 488 또는 시각화를위한 594 하이 드라 지드 (Invitrogen 사)를 추가합니다. </li><li> GABA의 이온 도입이 1 M GABA 솔루션을 준비하고 염산 15 5 산도를 조정합니다. pH가 GABA가 충전에 만 다음은 이온 도입하여 적용 할 수 있습니다. 솔루션의 낮은 pH는 GABA 전송 자체 16,17 영향을 미칠 수있는 세포 공간으로 배출 양해 바랍니다. 빛으로부터 GABA 솔루션을 보호하고 오래된 솔루션은 그 효과를 잃을 수 있기 때문에 자주 신선한 GABA 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 그것은 GABA 성 이벤트, 안녕을 확인하기 어려운 경우GH 염소 - 구동력 내부 솔루션은 KCl을을 떠나는하여 예를 들어, GABA 이온 도입이 작동하는지 확인합니다 GABA 성 이벤트를 시각화하는 데 도움이 될 수 있지만 생리적 원동력이 권장 될 수 시냅스 통합을 조사 할 수 있습니다. 작은 GABA 성 이벤트의 일반적인 탐지를 위해, 그림 88에 표시된 프로토콜은 도움이 될 수 있습니다. </li></ol> 3. 이온 도입 피펫을 당겨 테스트 <ol><li> 일반적으로, 오른쪽 피펫을 당기는 것은 어쩌면 조절 신경 전달 물질의 이온 도입을 달성하기 위해 가장 중요한 단계입니다. 세포 배양에 이온 도입을 사용할 때, 10 날카로운 미세 전극과 유사한 매우 미세한 전극을 가져올 수 있습니다. 그들은 각도 조직으로 낮출 때 심각한 조각에 패치 클램프 실험에서는, 그러나,이 매우 얇은 피펫은 불가능 깊은 수상 돌기에 도달하기 위해 만드는 조각 표면에 구부립니다. </li><li> 따라서, 그래서 아주 작은 팁 피펫을 잡아 그 없음 해당 없음eurotransmitter은 누설 할 수 있지만, 끝은 여전히 조직 (그림 2)에 침투 할만큼 충분히 단단해야합니다. 또는 P-97 풀러, 서터 악기 회사, 예를 들어, 150기가바이트 F 8P 클래스 피펫 (과학 제품, 호프 하임, 독일)와 수평 풀러 (예를 들어 DMZ-유니버셜 풀러, 이츠 - 악기 GmbH를, Martinsried, 독일 사용 , 가파른 각도 (그림 2 및 표 2)와 작은 오프닝뿐만 아니라 짧은 꼭지를 달성하기 위해 여러 당기는 단계 노바 토, CA). </li><li> 그것은 iontophoretic 피펫에게 10를 가져 오기 위해 석영 유리 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이들은 더 나은 기계적 성질을 가지고하고보다 신뢰할 수 있어야되지만 특수 레이저 풀러가 필요합니다. 그러나 일반적으로 패치 피펫을 당기에 사용되는 정상적인 유리 피펫, 좋은 결과를 얻을 수도 있습니다. </li><li> 처음 그들을 사용하기 전에 조직이없는 약실에있는 피펫 성능 및 저항 테스트시간은 글루타민산의 누설 때문에 조직을 해칠 수 있습니다. </li><li> 제대로 이온 도입 앰프를 설정합니다. 그런 신경 전달 물질과 염료 함유 용액에 피펫을 채우고 욕조 (ACSF)에 넣습니다. </li><li> 정전 용량 (그림 3)을 보상한다. 일반적으로 매우 날카로운 피펫은 무딘 것보다 더 높은 용량을 갖게됩니다. </li><li> 피펫의 저항을 확인하십시오 : 여기에 사용되는 마이크로 이온 도입 앰프는 피펫 저항을 측정하기위한 빌드에서 기능이 있습니다. 그것은 표준 오실로스코프 수집 소프트웨어와 컴퓨터에 연결된 A / D 보드를 모니터링 할 수있는 간단한 직사각형 테스트 펄스를 불러 일으킨다. 모양과 팁 크기에 따라 끝에서 25 사이의 저항이 있어야합니다 - MΩ 90. </li><li> 피펫 팁 밖으로 형광 염료가 누수 60X 또는 40X 물 침지 목표 및 형광 이미징 스위치로 가능하다면 팁에 초점, 확대 (글루의 경우 작은 양을 적용tamate) 또는 부정이 (GABA, 그림 4의 경우) (&lt;0.02 μA) 현재 유지합니다. 그 누설을 취소하는 데 도움이되지 않는 경우 피펫을 변경합니다. </li><li> 강한 단계 전류를 적용하거나 수동 트리거를 사용하여 용액을 피펫 밖으로 배출 될 수 있는지 확인하기 위해 형광 이미지의 끝을 모니터링 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 전류 펄스의 극성을 배출하도록되어 분자의 전하에 따라 있습니다. 글루 탐 산염을 추출하려면 그것은 음의 전류와 GABA 양의 전류 (그림 4)의 경우.입니다 </li><li> 염료와 송신기의 블록 배출이 높은 방출에게 현재 여러 번 적용하여 해제 할 수있는 피펫에 기포. </li><li> 거기에 눈에 띄는 누설하지 및 테스트 배출이 성공하면 함께 촬영 커패시턴스를 보상하고 실험을 시작합니다. </li><li> 주의 : 용량 보정이 피드백 회로에 의해 달성되기 때문에,이 회로는 오버 할 수 있고 또는 그것을 overcomp 경우 진동ensated. 부드럽게 커패시턴스 보상 다이얼 설정을 사용합니다. </li><li> 필라멘트 속성을 변경했을 수 있기 때문에 풀러의 안정성에 따라서, 때때로 수시로 풀러 설정을 조정하는 것이 필요하다. 일단 좋은 피펫을 설계하는 경우 그러나, 그것은 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. 따라서 끝난 후 실험 팁을 손상시키지 않고 밀폐 용기에 iontophoretic 피펫을 저장합니다. </li><li> 다음 실험은 신경 전달 물질의 용액을 피펫을 채울 경우, 팁을 취소하고 다음 속성 (예 : 저항) 변화에 크게 확인하는 몇 가지 강력한 배출 펄스를 적용합니다. 그런 다음 용량을 보정하고 다시 피펫을 사용합니다. 다른 신경 전달 물질의 솔루션을 하나의 피펫을 사용하지 마십시오. </li></ol> 4. 뇌 조각을 준비한다 <ol><li> 마이크로 이온 토 포레 시스를 처음 사용하는 경우 확실히 안정적으로 작동 풀러 프로그램을 수립 한 후 슬라이스를 준비합니다. </li> &lt;귀하의 기관 또는 지방 자치 단체의 동물 관리 지침에 따라 리&gt; 수행 마취 잘린 프로 시저. </li><li> 뇌의 제거 후, 차가운 얼음 ACSF 자당 (프로토콜 2.1 참조)로 전송할 수 있습니다. </li><li> 적절한 두께의 조각 (예를 들어, 300 μM)로 관심의 영역을 잘라. </li><li> 30 분 동안 35 ° C에서 ACSF 자당의 조각을 품어. 그 후, 실온에서 정상 ACSF을 포함 침수 보유 챔버로 전송. </li><li> 준비와 실험을 통해 95 % O 2, 5 % CO 2 조각을 둘러싼 ACSF을 carbogenize. </li></ol> 5. 전체 세포 녹음 설정 <ol><li> 전체 셀 모드를 설정 한 후, 오래 지속 위치를 피하기 위해, 패치 셀 전에 슬라이스 표면 근처 이미 이온 도입 피펫 (들)을 놓습니다. </li><li> 낮은 저항 패치 피펫 (3 - 5 MΩ)를 당겨, D로 채 웁니다너희는 내부 솔루션을 포함하고 피펫에 긍정적 인 압력 (30-60 밀리바)를 적용합니다. </li><li> 시각적 인지도를 아래에서 목욕 및 방법 세포 (적외선 dodt 대비 또는 두 개의 광자 그라데이션 대비 이미지)를 입력합니다. </li><li> 전압 클램프 모드에서 테스트 펄스 (예 : -10 MV, 20 밀리 초)을 피펫 저항을 모니터링 할 수 있습니다. 조직 오프셋 잠재력을 수정 만질 때. </li><li> 셀을 접근하고 부드럽게 명확하게 볼 수있다 &quot;보조개&quot;가 표시 될 때까지 그것으로 피펫 팁을 누릅니다. 60 mbar의 부정 압력을 -65 mV에서 막 잠재력을 전환 - 즉시 피펫의 압력을 해제, 40을 적용합니다. </li><li> 유지 전류가 100 펜실바니아 아래 값에 도달하면, 부정적인 압력을 놓습니다. </li><li> 기가 씰을 설정 한 후 (저항&gt; 1 GΩ), 피펫 또는 커패시턴스 보상 회로의 간단한 overcompensation에 짧은, 강한 흡입과 파열 막. </li><li> 어떤 모드에 따라 (전압 또는 전류 클램프)가 필요합니다실험 설계에 대해 적절하게 보상한다. </li><li> 최종 위치로 iontophoretic 피펫을 가지고 시작합니다. 성공적으로 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명이 필요한 경우, 18,19 사용할 수있는 몇 가지 훌륭한 지침이 있습니다. </li></ol> 6. Iontophoretic 피펫을 놓고 시냅스 Iontophoretic 잠재적를 생성 <ol><li> 일반적으로, iontophoretic 이벤트는 소마 또는 GABA 마이크로 이온 도입 축삭 초기 세그먼트 돌기 샤프트에서 글루타민산 마이크로 이온 도입 가시 돌기에서, 예를 들어, 원하는 실험에 따라 정의 된 위치에서 유발 될 수 있습니다. </li><li> 터치하지 않고 약 1 ㎛ 거리에있는 셀을 접근. 그 위치에 도달하면 그것은 더 신경 전달 물질이 유출되지 않고 피펫 용량을 정확하게 보상하는 것을 중요합니다. </li><li> 글루타민산 염과 셀을 접근하는 것은 iontophoretic pipett 가득 경우E는 세포막 전위의 검출 탈분극이 발생, 가능하면 현재 유지 조정하거나 피펫을 변경합니다. </li><li> 짧은 음의 전류 펄스를 적용 0에서 시작하고 (예 : 0.1-0.4 밀리 초, 0.01-1 μA 펄스) 체계적으로 전류를 증가시킨다. 이 iontophoretic 전류가 특정 실험에서 원하는 응답을 셋업 연상하는 범위에서 찾을 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 응답 검출이없는 경우, 피펫 수백 마이크로 미터를 들고 팁을 청소하는 (&gt; 0.1 μA) 강한 방출 전류를 적용한다. , 커패시턴스 보상을 조정 셀을 접근하고 다시 시도하십시오. </li><li> 응답이 아직없는 경우, 현재의 유지를 줄일 수 있습니다. 이 절차를 통제 신경 전달 물질의 방출을 일으킬 수 있기 때문에 다이얼 설정을 매우주의해야합니다. 따라서 지속적으로 막 잠재력에 각각의 변화를 감지 녹음을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 이 GABA 성 이벤트를 감지하기 어려운 경우에 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다n 내부 용액 조성물은 높은 염소의 항복 - 원동력. 이를 위해 염소를 감소 - 피펫 솔루션 파일 (. 프로토콜 2.6 절 참조) 농도를. 이 높은 구동력으로 인해 휴식 막 잠재력에 큰 GABA 성 이벤트가 발생합니다. </li><li> 또한, -100 MV에서 -48 MV (그림 88)에 막 잠재적 가능성의 결과로 긴 현재의 단계를 주입. 이 프로토콜과 염소가 - 원동력은 탈분극 GABA 반응을 일으키는 원인이 과분극 전위 증가합니다. </li><li> 그것은 사건의 GABA 성 특성을 결정하는 데 도움이 유발 사건의 반전 가능성을 결정하는 단계 전류 주입 프로토콜을 사용하는 것도 가능하다. GABA의 누설 글루타민산 누설보다 감지하기 어렵습니다. 이 경우, 입력 저항의 지속적인 모니터링은 GABA 가득 피펫에 접근 할 때 도움이 될 수 있습니다. 입력 저항이 감소하면, 현재 할 수있는 B를 유지E는 증가하거나 다른 피펫을 사용하여야한다. </li><li> 글루타민산 염 이온 도입에 대한 제어 실험, 우리는 글루타민산 누수로 인해 발생 될 수있는 지역의 칼슘 유입을 시각화하기 위해 피펫 용액에 200 μM OGB-1없이 EGTA를 사용하여, 칼슘 2 + 이미징 실험을 제안한다. </li><li> 일반적으로, 안정된 반응을 달성하는 것은 시간이 지남에 드리프트를 방지하기 위해 기계적으로 안정 피펫을 가지고하는 것이 매우 중요하다. 드리프트 온도 변화로 인해 발생할 수 있습니다, 그 때문에 측정 온도 드리프트를 방지하기 전에 적어도 반 시간 장비에 전환하는 것이 좋습니다. 피펫 홀더에 좋은 카트리지 씰을 사용하고 끝이 정말 고정되어 있는지 확인합니다. 홀더 자체는 또한 테프론 테이프로 고정 할 수 있으며, 또한, 또한 드리프트의 잠재적 인 소스입니다 headstage 또는 조작자의 케이블에는 장력이 없는지 확인합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 우리가 돌​​기에 시냅스 통합을 조사하는 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 토 포레 시스를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 성공적으로 체외에서 생체 9,20-22 다른 뇌 영역에서 글루타메이트와 GABA 성 시냅스 전달을 조사하는 데 사용되었습니다. 마이크로 이온 토 포레 시스는 60 년 이상에 사용되고 있습니다 만, 초기에 주로 로컬 느리거나 중간 척도 23 또는 셀 24에 물질의 microinjection을위한 신경 전달 물질과 약물을 적용하는 데 사용되었다. 마이크로 이온 토 포레 시스는 고 저항 전극 10,11위한 빠르고 용량 보상 장착되어 앰프의 도입 이후 돌기 통합을 공부에 특히 흥미있는 도구가되었다. 이 개선은 rese 시냅스 반응의 결과로 짧은 직사각형 iontophoretic 전류를 적용 가능하게되었다현실적으로 시냅스 이벤트 <...

중추 신경계의 뉴런은 얇은를내는 돌기 프로세스 1 시냅스 다양한 입력을받을 수 있습니다. 거기 흥분성 돌기 입력의 대부분은 글루타메이트 시냅스에 의해 매개된다. 이 시냅스는 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)의 시냅스 선형 통합의 결과, 공간적으로 분산 된 방식으로 활성화 할 수 있습니다. 시냅스가 동시에 돌기에 공간 근거리에서 활성화 된 경우 이러한 흥분성 입력은 위에 선형으로 통합 돌기 스파이크 2-5을 생성 할 수 있습니다. 또한, 흥분성 입력의 통합은 수지상 나무의 입력의 위치에 따라 달라집니다. 말초 술 지역에 도착 신호가 훨씬 더 감쇠 케이블 필터링 6에 의한 근위 입력보다. 해마에서 정점 술의 돌기에 먼 입력은 인접 dendri에 비해 다른 뇌 영역에 의해 생성되는TES 7. 흥미로운 질문은 따라서, 어떻게 시냅스 입력을 다른 돌기 구획에 의해 처리하고 돌기 통합은 여러 가지 방법으로 신경 세포의 발화에서 이러한 계층 입력의 영향을 조절합니다.합니다 기능적 속성, 수상 돌기의 형태 학적 특징뿐만 아니라, 입력의 위치와 클러스터링 결정적 글루타메이트 시냅스 8,9의 효능을 결정 또한 흥분성 입력, GABA 성 터미널에서 추가 금지 입력의 돌기 통합에 영향을주지 않습니다. 시냅스 통합의 서로 다른 측면을 이상적으로 돌기 도메인에 서로 다른 신경 전달 물질의 공간적 정의 응용 프로그램을 허용 신경 전달 물질의 마이크로 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 뉴런의 신호 통합을 조사하는 글루타민산 염과 GABA의 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 여기에서 보여줍니다. 이 응용 프로그램, 뾰족한위한집중 신경 전달 물질의 솔루션으로 가득 고 저항 피펫이 사용됩니다. 이 피펫은 신경 전달 물질 수용체가있는 세포의 외부 막에 가까운 위치에 있습니다. 수지상 가지의 좋은 시각화가 필요합니다. 이 최고의 패치 피펫을 통해 도입 된 형광 염료를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 매우 짧은 (&lt;1 밀리 초) 전류 펄스는 (10의 범위 - 100 NA) 청구 신경 전달 물질의 분자를 추출하는 데 사용됩니다. 이 짧은 펄스 및 효과적인 커패시턴스 보상, 시냅스 후 전위 또는 전류는 흥분성 입력의 위치를​​ 정확하게 알려진 의미 높은 시간적 및 공간적 정밀도로 유발 될 수 있습니다. 글루타민산 마이크로 이온 토 포레 시스 (그림 1 9) 여기에 표시된대로 6 μm의보다 작은 정의 된 반경에 시냅스를 활성화 할 수 있지만, 단일 시냅스 해상도 10-12에 도달 할 수도 있습니다. 하이네, M., 외 </eM&gt; 빠른 마이크로 이온 도입의 공간 해상도도 정기적으로 글루타메이트 13의 2 광자 uncaging을 달성 반점의 크기보다 작은 0.5 μm의 아래 사이즈를 발견 조정할 수 있습니다 것을 보여 주었다. 빠른 마이크로 이온 도입으로 두 개 이상의 iontophoretic 피펫을 사용하여 수지상 나무의 다른도 먼 장소에 배치 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 서로 다른 경로에서 포함 흥분성 이벤트의 통합을 조사 할 수 있습니다. 그것은 동시에 글루타민산 염과 GABA 채워진 iontophoretic 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이 방법으로 흥분성 입력 (에 경로, 오프 경로 억제)을 기준으로 서로 다른 위치에서 GABA 성 억제의 효과를 연구 할 수 있습니다. 또한, 특정 신경 도메인을 대상의 interneurons에 의한 억제 효과는 말초 돌기처럼, 소마 또는 축삭 14, GABA 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 배양 된 뉴런, 빠른 마이크로 이온 도입은 이전 inve 수있는 기회를 제공합니다더 자세한 10,11의 뉴런에서 단일 시냅스 분포와 시냅스 통신 초등학교 측면을 stigate. 이 문서에서 우리는 입력 위치 입력 강점과 타이밍, 단독으로 또는 상호 작용에의 의존에서 흥분성과 억제의 입력 시냅스 통합 조사를 허용 급성 뇌 조각에 사용하기 위해 글루타민산 염과 GABA 이온 도입을 설정하는 방법을 자세히 보여줍니다. 우리는 장점과 제한 사항이 기술을 어떻게 성공적으로 해결하는 방법을 가리 킵니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Material</td></tr><tr><td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II) and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td><td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>이광자 레이저 스캐닝 현미경 Ultima IV</td><td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ti:사파이어 초고속 펄스 레이저</td><td>카멜레온 울트라 II, Coherent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>60X 대물렌즈, NA 0.9</td><td>올림푸스</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop 2 FS 정립 현미경</td><td>TILLPhotonics, Gr&auml; felfing, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>모노크로메이터</td><td>TILLPhotonics, Gr&auml; felfing, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 이온 영동 시스템 MVCS-02</td><td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sutter puller P-97</td><td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 필라멘트 (150 GB F 8P)</td><td>Science Products, 호프하임, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 히드라지드</td><td>분자 프로브 생명 기술</td><td>A-10436</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>분자 프로브 생명 기술</td><td>A-10438</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>P9333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma 알드리치</td><td>S8282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6297</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7903</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma 알드리치</td><td>C5080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 알드리치</td><td>G7528</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-글루코네이</td><td>트 시그마 알드리치</td><td>G4500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES-acid</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H4034</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>포스포크레아틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>P7936</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>E3889</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글루타민산</td><td>시그마 알드리치</td><td>G8415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GABA</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5835</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>머크</td><td>1.09137.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>머크</td><td>1.09108.1000</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

글루타민산 염과 gaba의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

신경 과학의 근본적인 관심사 중 하나는 결국 축삭의 행동 잠재력의 신경을 출력한다 수지상 나무의 매우 복잡한 구조를 따라 흥분성과 억제 입력의 통합을 이해하는 것입니다. 신경 세포의 출력에 대한 특정 시냅스 입력의 다양한 공간적 매개 변수의 영향은 돌기 입력의 거리에 의존 감쇠, 공간적으로 분리 된 입력의 위치에 따라 상호 작용, 흥분 통합, 선형에 GABAergig 억제의 영향을 예를 들어, 현재 조사 중입니다 비선형 통합 모드, 그리고 더 많은. 글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입으로 정확하게 글루타메이트 흥분과 GABA 성 억제의 공간적 통합을 조사 할 수 있습니다. 중요한 기술적 요구 사항 중 하나를 트리거 형광 램프, 발광 다이오드 (LED), 또는 두 광자 SCA 있습니다조직의 중요한 사진 피해를 도입하지 않고 돌기 가지를 시각화하는 현미경을 nning. 또한, 높은 저항 피펫의 빠른 용량 보정을 허용하는 마이크로 이온 도입 앰프를 가지고하는 것이 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 송신기가 무의식적으로 실험 기간 동안 피펫에 의해 발표되지 않은 것입니다. 일단 설정되면,이 기술은 높은 신경 전달 물질 및 위치 특이성과 신뢰성 및 재현성 신호를 제공합니다. 글루타메이트와 GABA의 uncaging에 비해 빠른 이온 도입이 시야에 제한없이 같은 시간에하지만, 아주 먼 위치에서 두 송신기를 사용하실 수 있습니다. 이 축삭의 초점 전기 자극에 비해 장점도있다 : 마이크로 이온 도입으로 입력 사이트의 위치는 확실히 알려져있어 관심에만 신경 전달 물질이 방출되어 있는지 확인합니다. 그러나 그와 함께 마이크로 이온 도입 전용으로 간주되어야한다postsynapse이 활성화되고 신경 전달 물질 방출의 연접 양상이 확인되지 않습니다. 이 문서에서 우리는 뇌 절편 실험에서 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 보여줍니다.

이온 도입의 공간 확산을 결정하는 간단한 방법은 배출 글루타민산 염을 일정하게 유지하면서, 수상 돌기에서 단계적으로 iontophoretic 피펫을 철회하는 것입니다. 우리는 마이크로 iontophoretic 자극의 공간적 범위는 약 12 μm의 (그림 1 반경을 보여주는)의 직경이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 어떻게 이온 도입을 사용할 수 있습니다 조직에 깊은 것은 피펫의 강성에 따라 달라집니다. 그러나 여기에 사용되는 조각 (그림 2)에서 실험에 필요한 iontophoretic 피펫은 침투의 깊이를 제한하지 않습니다. 오히려 광학 시스템과 뇌 조각의 깊이 감소 해상도가 제한 요인이다. 좋은 품질의 녹음을 위해 더 송신기 피펫 밖으로 유출되지 않는 것이 중요합니다. 기준이 갑자기 될 경우 수상 돌기가 피펫 팁으로 접근 될 때 또는 갑자기 depolarisation가있는 경우 글루타메이트의 경우, 누출이 확인 될 수있다불안정 (그림 5).</st...

이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

본 절차의 전반적인 목표는 뉴런 수상돌기 수목의 매우 복잡한 구조를 따라 입력 신호들이 통합되어, 최종적으로 축삭에서 활동 전위라는 뉴런 출력으로 이어지는 과정을 이해하는 것입니다. 이를 위해 먼저 적절한 이온 투과성 피펫을 제작합니다. 두 번째 단계는 이온 투과성 피펫을 테스트하고 정전 용량을 정확하게 보정하는 것입니다.다음으로, 전체 세포 구성(whole cell configuration)을 설정합니다. 마지막 단계는 수지상 돌기에 접근하여 기록 중인 세포에서 시냅스 후 전위를 유도하는 것입니다. 궁극적으로, 빠른 미세 이온토포레시스(fast micro iontophoresis)를 통해 서로 다른 신경전달물질 시스템에 속할 수 있는 여러 입력의 통합 과정을 조사할 수 있습니다.이 방법은 억제성 및 흥분성 입력이 어떻게, 그리고 어떤 조건 하에서 통합되는지와 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 뉴런의 출력으로 이어질 수 있습니다. 제어된 신경전달물질 이온토포레시스를 위해 팁이 매우 작은 피펫을 제작하여 이 절차를 시작하십시오.수평 또는 수직 피펫 풀러를 사용하여 여러 번의 풀링 단계를 거치면 매우 미세한 팁을 제작할 수 있습니다. 하지만 팁은 조직 내부로 침투할 수 있을 만큼 충분한 강도를 유지해야 합니다. 그런 다음, 조직이 없는 챔버에서 피펫의 성능을 테스트하기 위해 이온 아포레틱 증폭기(ion aporetic amplifier)를 설정하십시오.피펫에 신경전달물질과 염료가 포함된 용액을 채웁니다. 그런 다음 이를 A CSF에 넣습니다. 이어서 증폭기를 사용하여 정전용량을 보정합니다.일반적으로 매우 날카로운 피펫은 정전용량을 정확하게 보정한 후, 끝이 뭉툭한 피펫보다 더 높은 정전용량을 갖습니다. 마이크로 이온토포레시스 증폭기의 내장 기능을 사용하여 피펫의 저항을 확인하십시오. 피펫의 저항은 25에서 90 MΩ 사이여야 합니다.그 후, 60배 또는 40배 수침 렌즈를 사용하여 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 형광 이미지 촬영 모드로 전환합니다. 형광 D가 피펫 팁 밖으로 유출되는 경우, 글루타메이트의 경우에는 작은 양의 양전하 유지 전류를, GABA의 경우에는 음전하 유지 전류를 인가합니다.그 방법으로 누출이 해결되지 않으면 피펫을 교체하십시오. 다음으로, 피펫에 강한 단계 전류(step current)를 인가하거나 수동 트리거를 사용하십시오. 피펫 팁의 형광

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 단일 피질 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소를 평가하는 방법을 보여줍니다. 전기 자극은 시냅스에서 글루타메이트 방출을 촉진합니다. 방출된 글루타메이트는 시간이 지남에 따라 감소하는 센서 단백질의 형광을 변경하여 방출 및 제거 효율을 나타냅니다.

Analyzing the Glutamate Release and clearance at a single neuroron synapse(마우스 뇌 절편의 단일 뉴런 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소)

이 비디오에서는 글루타메이트 산화효소로 코팅된 MEA(Multielectrode Array)를 마취된 마우스의 뇌 조직에 이식합니다. 글루타메이트 용액은 MEA가 글루타메이트 수치를 감지하는 세포 외 공간에 주입되어 성상세포의 글루타메이트 흡수를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

효소로 코팅된 미세전극 어레이를 사용한 In vivo 실시간 글루타메이트 모니터링

우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류의 전기 생리학 녹음에서 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 추정하는 분석 방법을 설명합니다.

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

우리는 뇌 조직의 이온 농도 측정을 위한 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극(이중 배럴 및 동심원)의 제조, 보정 및 특성을 보여줍니다. 그런 다음 이들은 쥐 해마 절편 준비에 사용되어 흥분 활동이 세포 외 칼륨과 나트륨 농도를 모두 변화시킨다는 것을 보여줍니다.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

이 논문은 신경전달물질 수용체의 발현을 정량화하는 방법과 광유전학 도구의 바이러스 전달과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 조합을 사용하여 식별된 시냅스 전후 요소로 시냅스에서 분석된 패턴을 설명합니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

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여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

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글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

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