Name: 해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 배아의 해부 및 측면 장착 기법을 통해 척수 발달을 형광 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 축삭 유도 및 신경분화 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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스키드 모어 강사 개발 그랜트는이 원고의 준비 및 게시를 투자했습니다.

1. 태아를 설치 (예 : 면역 세포로 선정 시각화 기술, 완료되면, 현장 하이브리드 화에서, 등) <ol><li> 선택의 버퍼 (그림 1A)로 가득 35mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 버퍼의 선택은 라벨 절차를 기반으로합니다. 일반적으로 PBS 기반의 버퍼가 적합하다. </li><li> 해부 현미경 및 집게를 사용에서 다른 쌍 (그림 1B) 멀리 노른자를 당기는 동안 집게 일쌍으로 머리를 고정합니다. 또한, 부드럽게 노른자를 멀리 끌어 곤충 핀 홀더에 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 배아 포커 사용 노른자 파편 (그림 1C-D)의 여지가없는 페트리 접시의 부분에 배아를 이동 (낚시 줄 (0.41 mm 직경은) 모세관 또는 파스퇴르 피펫 하나에 붙어). </li><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능하고 g만큼 작은 액체 배아 대기음이라 고한다면, 슬라이드 (그림 1E)에 그들을 피펫. </li><li> 조심스럽게 실험실을 닦아 사용하여 물기를 멀리 심지. 배아과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 배아에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. 형광 라벨, 선택의 antifade 시약을 사용합니다. 비색 신호의 경우, 70 % 글리세롤 마운팅 매질로서 사용될 수있다. </li><li> 배아 포커를 사용하여 행 (그림 1 층)에있는 그들의 양쪽에 배아의 방향. </li><li> 커버 슬립 (그림 1G)의 각 모서리에 석유 젤리 또는 높은 진공 그리스의 하나 &quot;덩어리&quot;를 추가합니다. 이것은 과도한 압축에서 배아의 손상을 방지한다. </li><li> 배아 (그림 1H)의 상단에 커버 슬립 (아래 석유 젤리 쪽)을 놓습니다. </li><li> 부드럽게 (70 % 글리세롤 또는 반대로 페이드 장착 시약) 커버 슬립 (그림 1H)을 만지고 설치 미디어까지 각 모서리에 커버 슬립을 누릅니다. </li><li> 필요한 경우, 바로 옆에 COV에 피펫 팅 더 설치 미디어를 추가erslip, 20-200 ML의 범위에서 피펫을 사용. 그것은 아래에 심지됩니다. </li><li> 실험실을 사용하면 커버 슬립 주위에 완전히 깨끗하고 닦아냅니다. 이 배아를 손상시킬 수로, 커버 슬립에 압력을 적용 할 것이 확실합니다. 이 지역은 건조하고 그것에 더 석유 젤리 또는 설치 미디어가 없어야합니다. </li><li> 커버 슬립 (그림 1I)의 가장자리 주위에 밀봉 매니큐어를 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

더 경쟁하는 금융 이익은 저자 중 하나에 존재하지 않습니다.

척수 개발의 고정 된 제브라 피쉬 배아 보조 시각화 측면 장착. 난황 공의 제거를 통해, 뛰어난 현미경 이미징에 필요한 작동 거리가 감소된다. 초기 배아 인한 태아의 크기 및 조직의 취약성에 해부하기가 더 어렵 비록 우리의 대표적인 결과는, 그러나,이 기술은 이미 HPF (18)로 사용할 수있는, HPF (24) 단계로 제한되었다. 이 기술은도 24 HPF보다 오래된 배아에 적용 가능하다. 배아 지브라 피쉬의 광학적 선명도, 유전학 역방향 순방향 유전 화면을 수행 할 수있는 능력, 및 형질 전환 방법에 의해 원조, 몇개의 발생 과정을 조사 할 수있다. 이 BrdU의 안티 - 포스 포 히스톤 3월 4일부터 6일까지 및 인원, nkx, DBX, 그리고 olig의 FAMILIE에있는 신경 세포와 아교 전구 마커의 발현을 통해 패턴과 같은 마커를 신경 전구 세포의 유사 분열 지수를 포함의 1,4-6. 1,4,5,10 사용할 수 있습니다 (예 : 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 HUC / D)를 아교 세포 및 신경 세포의 결정을보고 시약. 신경 세포의 하위 차별화 섬, VSX, engrailed 및 GATA 유전자 1,4-6의 발현을 분석 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 축삭지도의 분석은 안티-아세틸 튜 불린, 3A10 및 ZNP-1 2,11,12 등의 항체를 통해 가능하다. 다른 척추 동물 모델 시스템 (마우스와 병아리)는 그대로 태아의 모든 개발 축 만 제브라 피쉬의 허가 동시보기, 척수 개발을 연구하는 데 사용하고 있지만. 이 방법의 명백한 제한은 라이브 영상을 배제하는, 배아가 고정되어 있다는 것입니다. 실제로, 신속한 배아 죽음 노른자 결과 (또는 손상)의 제거는, 따라서,이 기술을 이용하여 살아있는 배아의 작동 거리를 감소시키는 것이 가능하지 않다. 그러나, 높은 배율 척수 공동라이브 배아 RD 이미징이 가능합니다. 라이브 영상 중에 노른자를 보존하기 위하여, 태아는 시료 및 커버 슬립 사이에 더 큰 공간을 제공하는 오목 슬라이드에 배치 될 수있다. 또한, 여러 개의 22mm X 22mm 커버 슬립은 현미경 슬라이드에 x 1의 3 중 하나를 슬라이드에 접착 할 수있다. 커버 슬립 위에 놓인 coverslip에 대해 &quot;다리&quot;역할을합니다. 배아는 HPF (18)보다 오래된 경우 tricaine은 이동을 방지하기 위해 배아를 마취하기 위해 사용된다. 그대로 노른자와, 아가로 오스에 포함 된 라이브 배아로 작업 할 때 0.288 mm의 작동 거리가 24 HPF에서 deyolked 배아 필요하지만, 3.3 mm의 작동 거리와 현미경 렌즈는 충분하다. 또한, deyolked 배아에서 파생 된 이식편 문화 플라즈마 응고 고정화 기술 (13)를 사용하여 시각화 할 수있다. 다양한 세포 집단은 GFP, mCherry 또는 photocon 같은 유전자에 의해 코딩 형광 단백질을 이용하여 관찰 할 수있다vertible 염료 카에데 (몇 가지 이름을). 또한, 키메라 배아 내에서 형광 표지 된 세포는 또한이 방법 (14)에 볼 수 있습니다. 달 동안 안정 일관된 설치 기술 개발 및 세포 생물학을위한 중요한 도구입니다. 이 간단한 기술은 다른 실험적인 시도 사이의 비교를 용이있게 재현. 또한, 행 배아의 정렬은 쉽게 나중에 분석을 위해 특정 배아의 식별을 허용합니다.

제브라 피쉬의 척수의 시각화는 여러 가지 요인에 의해 억제된다. 인해 피개 somites의 두께 및 척수의 내부 위치에, 꽤 긴 작동 거리를 높은 해상도 셀룰러 요구된다. (신경의 초기 단계 여전히 존재) 노른자 볼이 더 필요한 작동 거리를 증가하고, 쉽게 커버 슬립의 압력에 의해 손상된다. 또한, 손상 노른자에서 파편은 조직의 명확한 시각화를 금지합니다. dorso - 복부 (DV) 축 단면이 가능하지만, 그들은 쉽게 전후방 (AP) 축 1에 동시 시각화를 허용하지 않습니다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 배아는 슬라이드에 해부 및 장착되어있다. 이 절차는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 제브라 피쉬 배아는 쉽게 측면이 AP 축 시각화를 용이하게 위쪽으로 향 거짓말. 노른자 균형의 두 번째 제거내가 필요한 작동 거리를 감소하고, 파편을 제한합니다. 셋째,이 설치 절차는 형광 및 명 시야 현미경을 모두 할 수 있습니다. 넷째, 장착 된 배아는 장기 표본 시각화 수 있도록, 4 ° C에서 달 동안 안정. 마지막으로, 개발의 진행은 그 전방 세그먼트에서 발생이 후방 세그먼트보다 더 성숙. 무대 일치 척추 hemisegments이 배아를 비교하고 있는지 확인하기 위해, 위에있는 체절 조직은 가이드로 사용됩니다. 예를 들어, 열 번째 가장 후방 체절 무대 일치 배아의 발달에 상응하는 10 번째 척추 hemisegment을 덮는다. 그대로 배아이 설치 절차는 somites을 쉽게 식별 할 수 있습니다. 우리는 개발 척수 축삭지도의 메커니즘을 연구하는 유전학과 유전자 노크 다운 기술을 사용합니다. 특히, 우리는 robo2, robo3 및 DCC가 Commissural 차 ASCE에 필요한 것으로 확인nding (COPA) 축삭 길 찾기. 여기에 설명 된 설치 절차를 사용하여, 우리는 복부 성장, 중간 선 교차점, 접합면의 폭, 지느러미와 전방 성장 2,3를 검사 할 수 있었다. 이 절차는 또한 마운팅 DV 또는 척수의 AP 패터닝에 적용될 수있다. 우리는 척수의 DV의 패턴에서 하류로 Wnt 이펙터의 서로 다른 역할을 확인하려면이 절차를 사용했습니다. 이 실장을 사용하여, 우리는 단일 세포 수준에서 DV 마커의 해상도를 획득하고, 변화된로 Wnt 신호 수신 4,5의 결과로서 분 패터닝 변화를 확인할 수 있었다. 이 설치 절차는 또한 안티 - 포스 포 3 BrdU의 라벨 (전구 확산) 차별화 (5)를 통해 유사 분열 지수 계산을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>페트리 접시 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont Forceps #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Cover glass </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td>any grocery store</td><td> <</td><td></td></tr><tr><td>p>Loop Holders </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> 곤충 핀 </td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Nickel Plated Pin Holders </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Olympus 실체현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

제브라 피쉬의 척수는 여러 가지 이유로 신경계 연구에 대한 효과적인 조사 모델입니다. 우선, 유전 형질 전환 유전자 녹다운 방식은 신경계 발달 근본적인 분자 메커니즘을 조사하는 데에 이용 될 수있다. 둘째, 발달 동기 배아의 큰 클러치는 큰 실험 샘플 크기를 제공합니다. 셋째, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도는 전구, 아교 세포 및 신경 세포의 인구를 시각화하는 연구를 허용합니다. 제브라 피쉬 배아 투명하지만, 시험편 두께는 효과적인 미세 시각화를 방해 할 수있다. 그 이유 중 하나는 척수와 상부의 체절 조직의 탠덤 개발이다. 또 다른 이유는 아직 초기 신경의 기간 동안 존재하는 큰 노른자 공입니다. 이 문서에서는, 우리는 미세 절제 및 체절 조직을 둘러싼 유지하면서 미세한 시각화 할 수 있습니다 수정 배아의 노른자의 제거를 보여줍니다. 우리 ALS오 제브라 피쉬 배아의 반영구적 설치를 보여줍니다. 이 조직의 3 차원 성을 유지로서 이것은 dorso - 복부 및 전후방 축에 신경 발달의 관찰을 허용한다.

셀룰러 패터닝, 분화 및 축삭지도 등의 각종 이벤트가 발달 기초 메커니즘을 해명 할 때, 그 조직의 컨텍스트 내에서 세포를 시각화 할 수있는 것이 중요하다. PAX, nkx, 또는 DBX 가족 4 전사 인자의 발현 도메인의 복부 나 등의 변화와 같이 일반적으로 현재 Dorsoventral 패턴 결함. 때때로, 변경 사항은 몇 가지 세포 직경 4를 포함, 미묘한있을 수 있습니다. 단면 분석은 이러한 유형의 분석을 허용한다. 그러나, 약한 신호 또는 AP의 축에 수직하지 않은 단면을 가진 시약은 해석을 제한 할 수 있습니다. 또한, 단면 분석을 쉽게 변경이 AP 축에서 지속 여부를 고려하고, 저온 유지 장치의 가용성에 의존하지 않습니다. 이 제한은 척수의 측면보기로 우회한다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, mRNA의 nkx6.1은 D이다전구 도메인 내, 24 시간 후 수정 (HPF)에서 척수의 약 복부 반 istributed. 전구 세포는 척수의 중간 부분에서 발견되는 바닥 플레이트의 존재로 인해 포스트 유사 분열 세포로부터 구별 가능하다. DIC 광학과 횟수, 각각의 세포는 명확히 구별하고, 발현 세포와 nonexpressing 간의 정의 된 경계가 분명하다. 전구 세포주기 출구는 유전자 발현의 변화에​​ 의해 수반된다. 예를 들어, 모든 사후 유사 분열 신경 세포는 면역 세포 화학 1,5와 감지 할 HUC / D를 표현한다. 섬, GATA, 및 VSX의 가족을위한 mRNA의 프로브는 각 척수 hemisegment 6 내에서 일관된 위치와 번호를 특정 후 유사 분열 신경을 레이블. 또, 로보 제품군에서와 축삭지도 수용체 postmitotic 뉴런의 제한된 인구 (그림 2C)를 표현 <suP&gt; 2,7,8. 배아의 측면 마운팅 후 유사 분열 뉴런의 정확한 계산을 할 수 있습니다. 유사 분열을 계속 조상은 항 - 포스 히스톤 3 면역 세포뿐만 아니라 B​​rdU의 라벨로 정량화 할 수있다. 또한, 세포 죽음은 TUNEL 라벨 4-6으로 평가 될 수있다. 24 HPF에서 다음 postmitotic 뉴런의 축색 돌기는 다양한 방법으로 시각화하고, 단일 세포 수준에서 구별 할 수있다 : 지느러미 측면 오름차순 (도라), Commissural 차 오름차순 (COPA), Commissural 보조 오름차순 (코사), 복부 세로 내림차순 (초원), Kolmer-Agdur (KA), Commissural 두 갈래 / 세로 (COB / L), 원주 오름차순 (CIA), 원주 내림차순 (CID), 유니 폴라 Commissural 내림차순 (UCoD), Rohon - 수염 (RB), 운동 신경원 ( M) 9. 축삭은 지느러미, 복부, 전방 및 후방 방향으로 뉴런에서 확장. 그들은 지점, 지느러미 모두에게 중간 선을 통과하고, 종료및 복부 척수. 공 초점 레이저 주사 현미경을 결합 할 때, 이러한 다양한 세포 행동은 면역 세포와 같은 GFP 2 등의 유전자 인코딩 형광 단백질을 이용하여 가로 방향으로 장착 된 배아에 분명하다. 도 2D에서, ZNP-1 면역 세포가 개발 운동 신경원을 레이블로 사용되었다. 운동 신경원은 주변 개발 근육을 신경을 분포시키다 배쪽으로 척수를 종료합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. 해부 및 제브라 피쉬 배아의 마운트 측방. (A)를 면역에 대한 처리 한 후, 현장 하이브리드 화 등으로, 배아는 35mm 페트리 (0.5 % 트리톤 X-100과 PBS) PBT 가득 접시 또는 PTW (PBS로 배치됩니다 0.1 % 트윈 -20). 노른자구슬 (YB)가 명백하다. (B) 난황을 조심 해부이어서 배아의 머리를 고정에 의해 제거된다. (C) 배아 포커 (낚시 줄이 파스퇴르 피펫에 붙어) 별도의 배아와 노른자 파편 (D)에 사용된다. 청소 배아는 현미경 슬라이드 (E)에 피펫 팅 (F) 정렬됩니다. (G) 석유 젤리가 커버 슬립의 모서리에 적용됩니다. (H) 커버 슬립이 장착 매체의 배아 위에 부드럽게 배치됩니다. (I) 매니큐어는 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> 강한&gt; 그림 2. 길 찾기 유전자 발현 패턴과 축삭의 분석은 옆으로 제브라 피쉬 배아를 장착. 24 HPF에서 zebrafish의 배아 (A) 그리기. BD에서, 난황 확장 위의 약 네 hemisegments은 (박스 영역) 시각입니다. (B) nkx6.1은 바닥 플레이트 (FP)를 포함 복부 척수로 표현된다. (C) robo3은 postmitotic 뉴런 (PMN)로 표현된다. 바닥 판 및 전구 영역이 더 많은 측면 초점면에서 분명하지 않습니다. B에서 C는, 척수는 화상의 왼쪽에 브래킷에 의해 경계된다. (D) 공 초점 현미경은 배쪽으로 척수를 종료 모터 축삭 레이블 이미지 ZNP-1 면역에 사용되었다. 모든 이미지에서 앞쪽은 왼쪽에 있으며 등쪽이 다. 40X 긴 작동 거리, 침수 (NA 0.8) 렌즈 (3.3 mm)를 사용 하였다.oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

본 절차의 전반적인 목적은 척수를 현미경으로 최적으로 관찰하기 위해 제브라피쉬 배아를 박리하고 고정하는 것입니다. 이는 먼저 미세 박리를 통해 난막을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 난막 잔해를 제거하고 피펫을 사용하여 배아를 슬라이드 위에 옮기는 것입니다.다음으로, 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 과잉 액체를 조심스럽게 제거한 후, 마운팅 매질을 첨가합니다. 마지막 단계는 배아 포커(embryo poker)로 슬라이드 위의 배아 방향을 잡고 커버스립을 덮는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경 또는 명시야 현미경을 사용하여 분열 후 세포체의 분포와 발달 중인 축삭의 궤적을 관찰합니다.이 방법은 패턴 형성, 분화 및 축삭 유도의 책임 메커니즘은 무엇인가와 같은 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신경계 발달의 많은 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 발달 중인 근육과 같은 다른 조직에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 실험을 시작하기 전에 현미경 하에서의 박리 과정이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.피펫 팁을 파스퇴르 피펫에 접착제로 고정한 다음, 피펫 팁에 낚싯줄을 접착제로 붙여 배아 포커(embryo poker)를 제작합니다. 배아 해부를 시작하려면, PBS가 채워진 35 millimeter 페트리 접시에 수정 후 24시간이 경과한 제브라피쉬 배아를 최대 30마리까지 넣습니다.해부 현미경 하에서, 핀셋으로 배아의 머리를 고정하는 동시에 곤충 핀을 사용하여 난황을 끌어냅니다. 그다음 배아 포커를 사용하여 배아를 난황 찌꺼기가 많지 않은 페트리 접시의 부분으로 옮깁니다. 이어서 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 최대한 적게 흡입하면서 배아를 빨아들입니다.그 다음, 슬라이드 위에 배아를 최대 21개까지 조심스럽게 피펫으로 옮깁니다. 배아에 닿지 않도록 주의하며 실험용 와이프로 과잉 액체를 조심스럽게 닦아낸 후, 배아 위에 마운팅 용액 한 방울을 첨가합니다. 다음으로, embryo poker를 사용하여 배아들을 2~3줄로 측면이 보이도록 정렬합니다.이제 커버 슬립의 각 모서리에 바셀린을 소량씩 바릅니다. 바셀린이 발린 면이 아래로 향하도록 커버 슬립을 돌려 배아 위에 올립니다. 바셀린은 과도한 압착으로 인해 배아가 손상되는 것을 방지하는 역할을 합니다.필요한 경우, 20에서 100 µL 범위의 피펫을 사용하여 마운팅 용액이 커버슬립에 닿을 때까지 커버슬립의 각 모서리를 가볍게 두드립니다. 커버슬립 옆에 마운팅 용액을 더 추가하고, 추가된 용액이 커버슬립 아래로 스며들게 합니다. 이제 실험실용 와이프로 커버슬립 주변을 완전히 닦아냅니다.커버슬립에 압력을 가하지 마십시오. 이는 배아에 손상을 줄 수 있습니다. 적절히 세척되어 해당 부위가 건조하고 바셀린이나 마운팅 매질이 묻어 있지 않은 상태여야 합니다. 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 마무리합니다. 제브라피쉬 배아를 마운팅한 후, oak sac 신장 부위 위쪽의 여러 HEMI 세그먼트를 시각화하였습니다.이 그림은 제브라피쉬 배아의 복측 척수에서 NK X 6.1의 발현을 보여줍니다. 수정 후 24시간에 NK X 6.1 mRNA는 척수의 대략 복측 절반에 분포합니다. 전구세포 도메인 내에서, 전구세포는 척수의 내측 부분에서 발견되는 바닥판의 존재로 인해 분열 후 세포와 구별됩니다.DIC 광학으로 관찰한 모습입니다. 개별 세포들이 명확하게 구분되며, 발현 세포와 비발현 세포 사이의 경계가 뚜렷하게 나타납니다. 전구 세포의 세포 주기 종료는 유전자 발현의 변화와 함께 일어납니다.이 이미지는 분열 후 뉴런에서의 robo three 발현을 보여줍니다. robo 수용체 가족은 Axon guidance 수용체로, 이들의 발현을 통해 분열 후 뉴런의 정확한 수를 측정할 수 있습니다. 더 외측의 초점 평면에서는 바닥판(floor plate)과 전구세포 구역(progenitor zone)이 나타나지 않음에 유의하십시오.측면으로 고정된 배아에서 보이는 것과 같이 운동 신경 축삭을 표지하는 znp one 면역형광 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경을 사용하였습니다. 운동 신경세포는 수정 후 24시간에 척수 복측으로 나와 주변의 발달 중인 근육 조직에 분포하게 됩니다. 이 기술을 완전히 숙달하고 적절히 수행한다면 30분 내에 완료할 수 있습니다.이 실험 과정을 수행할 때, 세심한 미세절제술(microdissection)을 통해 조직의 온전함을 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마운팅 및 현미경 시각화를 위해 제브라피시 배아의 난황을 제거하는 미세절제술 기법의 사용법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

여기서, 우리는 척추 동물 분할의 라이브 연구를 가능하게, 제브라피시 후방 체축의 3-D 조직 배양에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 각성 모델은 축 신장, 형태항원 변형, 세포외 분해능 조직 수준 라이브 이미징에 대한 제어를 제공합니다.

얼룩말피에서 척추동물 세분화를 연구하는 3-D 꼬리 이식 문화

여기에서는 여러 제브라피시(Danio rerio) 유충 샘플을 정렬 및 동결 절제하고 공간 전사체 분석을 위해 단일 슬라이드에 수집하는 방법을 제시합니다.

Spatially Compact Arrangement of Larval Zebrafish Sections for Spatial Transcriptomic Analysis

학습하세요 제브라피쉬 배아의 해부 및 측면 장착 기법을 통해 척수 발달을 형광 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 축삭 유도 및 신경분화 메커니즘 연구에 필수적입니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

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