해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

본 절차의 전반적인 목적은 척수를 현미경으로 최적으로 관찰하기 위해 제브라피쉬 배아를 박리하고 고정하는 것입니다. 이는 먼저 미세 박리를 통해 난막을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 난막 잔해를 제거하고 피펫을 사용하여 배아를 슬라이드 위에 옮기는 것입니다.

다음으로, 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 과잉 액체를 조심스럽게 제거한 후, 마운팅 매질을 첨가합니다. 마지막 단계는 배아 포커(embryo poker)로 슬라이드 위의 배아 방향을 잡고 커버스립을 덮는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경 또는 명시야 현미경을 사용하여 분열 후 세포체의 분포와 발달 중인 축삭의 궤적을 관찰합니다.

이 방법은 패턴 형성, 분화 및 축삭 유도의 책임 메커니즘은 무엇인가와 같은 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신경계 발달의 많은 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 발달 중인 근육과 같은 다른 조직에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 실험을 시작하기 전에 현미경 하에서의 박리 과정이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

피펫 팁을 파스퇴르 피펫에 접착제로 고정한 다음, 피펫 팁에 낚싯줄을 접착제로 붙여 배아 포커(embryo poker)를 제작합니다. 배아 해부를 시작하려면, PBS가 채워진 35 millimeter 페트리 접시에 수정 후 24시간이 경과한 제브라피쉬 배아를 최대 30마리까지 넣습니다.

해부 현미경 하에서, 핀셋으로 배아의 머리를 고정하는 동시에 곤충 핀을 사용하여 난황을 끌어냅니다. 그다음 배아 포커를 사용하여 배아를 난황 찌꺼기가 많지 않은 페트리 접시의 부분으로 옮깁니다. 이어서 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 최대한 적게 흡입하면서 배아를 빨아들입니다.

그 다음, 슬라이드 위에 배아를 최대 21개까지 조심스럽게 피펫으로 옮깁니다. 배아에 닿지 않도록 주의하며 실험용 와이프로 과잉 액체를 조심스럽게 닦아낸 후, 배아 위에 마운팅 용액 한 방울을 첨가합니다. 다음으로, embryo poker를 사용하여 배아들을 2~3줄로 측면이 보이도록 정렬합니다.

이제 커버 슬립의 각 모서리에 바셀린을 소량씩 바릅니다. 바셀린이 발린 면이 아래로 향하도록 커버 슬립을 돌려 배아 위에 올립니다. 바셀린은 과도한 압착으로 인해 배아가 손상되는 것을 방지하는 역할을 합니다.

필요한 경우, 20에서 100 µL 범위의 피펫을 사용하여 마운팅 용액이 커버슬립에 닿을 때까지 커버슬립의 각 모서리를 가볍게 두드립니다. 커버슬립 옆에 마운팅 용액을 더 추가하고, 추가된 용액이 커버슬립 아래로 스며들게 합니다. 이제 실험실용 와이프로 커버슬립 주변을 완전히 닦아냅니다.

커버슬립에 압력을 가하지 마십시오. 이는 배아에 손상을 줄 수 있습니다. 적절히 세척되어 해당 부위가 건조하고 바셀린이나 마운팅 매질이 묻어 있지 않은 상태여야 합니다. 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 마무리합니다. 제브라피쉬 배아를 마운팅한 후, oak sac 신장 부위 위쪽의 여러 HEMI 세그먼트를 시각화하였습니다.

이 그림은 제브라피쉬 배아의 복측 척수에서 NK X 6.1의 발현을 보여줍니다. 수정 후 24시간에 NK X 6.1 mRNA는 척수의 대략 복측 절반에 분포합니다. 전구세포 도메인 내에서, 전구세포는 척수의 내측 부분에서 발견되는 바닥판의 존재로 인해 분열 후 세포와 구별됩니다.

DIC 광학으로 관찰한 모습입니다. 개별 세포들이 명확하게 구분되며, 발현 세포와 비발현 세포 사이의 경계가 뚜렷하게 나타납니다. 전구 세포의 세포 주기 종료는 유전자 발현의 변화와 함께 일어납니다.

이 이미지는 분열 후 뉴런에서의 robo three 발현을 보여줍니다. robo 수용체 가족은 Axon guidance 수용체로, 이들의 발현을 통해 분열 후 뉴런의 정확한 수를 측정할 수 있습니다. 더 외측의 초점 평면에서는 바닥판(floor plate)과 전구세포 구역(progenitor zone)이 나타나지 않음에 유의하십시오.

측면으로 고정된 배아에서 보이는 것과 같이 운동 신경 축삭을 표지하는 znp one 면역형광 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경을 사용하였습니다. 운동 신경세포는 수정 후 24시간에 척수 복측으로 나와 주변의 발달 중인 근육 조직에 분포하게 됩니다. 이 기술을 완전히 숙달하고 적절히 수행한다면 30분 내에 완료할 수 있습니다.

이 실험 과정을 수행할 때, 세심한 미세절제술(microdissection)을 통해 조직의 온전함을 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마운팅 및 현미경 시각화를 위해 제브라피시 배아의 난황을 제거하는 미세절제술 기법의 사용법을 충분히 이해하게 될 것입니다.