Name: 지방 조직 면역 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 지방 조직 면역 세포 분리 방법을 통해 대식세포와 T 세포를 분리하고 유세포 분석으로 정량하는 기술을 익히세요. 이 방법은 비만과 면역대사 질환 연구에 필수적입니다.

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JSO는 NIH 루스 L. 키르 NRSA (F32 DK091040)에 의해 지원됩니다, AK는 미국 당뇨병 협회 (7-10-MI-05)에서 박사후 원정대에 의해 지원되며, AHH는 미국 심장 협회 설립 탐정 수상에 의해 지원됩니다 (12EIA8270000). 유동 세포 계측법 실험은 VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스에서 수행 하였다. VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스는 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (DK058404)에 의해 지원됩니다.

1. 시약 및 소모품 앞서 실험 프로토콜을 시작하려면 다음 시약을 준비 : <ol><li> 70 % 에탄올 </li><li> 1X PBS </li><li> 1X DPBS은 (칼슘과 마그네슘 제외) 0.5 % BSA가 첨가 </li><li> FACS 버퍼 : 1X DPBS (칼슘과 마그네슘 제외), 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % FCS </li><li> ACK 버퍼 : 150 MM의 NH 4 망할 CIA, 10 MM KHCO 3, 물에 0.1 밀리미터 나 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li></ol> 2. 지방 조직의 수확 및 준비 <ol><li> 각 기관에 특정한 IACUC 승인 된 절차에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 철저하게 70 % 에탄올로 모피 젖은. </li><li> 검상 돌기 프로세스의 수준 (흉골의 하부)에서 절개를하고 모든 주요 혈관을 절단되지 않도록주의, 심장을 노출 흉강을 엽니 다. </li></ol> 참고 :이 시점에서만큼 진동판이 그대로 유지하는 것도 도움이 그 것이다가능한 혈액을 허용하고 흉강에서 흘러 관류하는 흉곽의 오른쪽의 노치를 잘라합니다. <ol start="4"><li> 혈액을 허용하고 순환 시스템을 탈출하기 위해 관류하는 우심방 클립. </li></ol> 참고 : AT 비만 쥐, 과도한 심낭을 처리 할 때 심장에 대한 액세스를 허용하기 위해 제거해야 할 수도 있습니다. <ol start="5"><li> 집게와 함께 마음을 잡고 조심스럽게 정점을 통해 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 천천히 15 ML 멸균 PBS와 마우스를 붓는다. </li></ol> 참고 : 폐 작성하고 확장하기 시작하면 혈류의 속도를 줄입니다. <ol start="6"><li> 복강을 열고있는 성선 조직을 피하기 위해주의를 사용하여 perigonadal 지방 패드를 제거합니다. </li><li> 지방 패드를 배치하는 것은 0.5 % BSA가 첨가 2 ML 1X DPBS을 (마그네슘 또는 칼슘없이) 포함 얼음에 보트를 달아 정밀한 조각으로 AT를 말하다. </li></ol>참고 : 당 AT의 양을 제한 1.2 g에 배를 무게. AT의 양이 1.2 g을 초과하는 경우, 두 개의 무게 보트 사이에 균등하게 나눕니다. <ol start="8"><li> 얼음에 샘플 AT 유지하고 0.5 % BSA, 10 MM 염화칼슘 2, 4 MG / ML 콜라, 유형 II와 보충 1X DPBS로 구성된 샘플을 당 ML 콜라 다이제스트 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 3. 콜라게나 소화 <ol><li> 균질를 따르고, 1 ML의 DPBS (0.5 % BSA) 3 ML 콜라 II 다이제스트 솔루션 보트의 무게를 세척하여 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 20 분 37 회전 흔드는 (200 RPM) ° C에서 균질 품다. </li><li> 얼음에 원뿔 튜브와 장소에 10 ML의 DPBS를 (0.5 % BSA)를 추가합니다. </li><li> 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 여러 번 균질 씹다, 새로운 50 ML 원뿔 관에 100 μm의 필터를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 4 &amp; D에서 10 분 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기예를 들어, C. </li><li> 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛 3 ML ACK 버퍼에 적혈구의 오염을 용해합니다. </li><li> 4시 10 분 500 XG에 12 ML의 FACS 버퍼와 원심 분리기 세포 현탁액을 추가 ° C. </li><li> FACS 버퍼에서 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛. </li></ol> 참고 : 세포 펠렛은 50 ML 원뿔 튜브의 바닥을 커버하는 경우, 0.5 ML 외과 버퍼를 사용 인치 resuspend을하는 방법에 많은 FACS 버퍼에 대한 가이드로 세포 펠렛의 크기를 사용하고, 그렇지 않은 경우 0.25-0.5에 resuspend을 ML. <ol start="9"><li> 장소 얼음 샘플 및 혼합 40 μL FACS 버퍼 50 μL 판 블루 용액 (0.2 %), 10 μL 세포 현탁액으로 세포 계수에 대한 각 시료 1:10으로 희석 분주을 준비합니다. </li><li> 판 블루 배제에 따라 가능한 세포를 계산하고 5-10 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도로 세포 현탁액을 희석. </li></ol> 4. 세포 표면 항원 염색 <oL&gt; <li> 0.5 μg/10 6 세포의 최종 농도 항 - 마우스 CD16/CD32 항체 (FC 블록)을 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 전송 샘플 (≥ 10 6 세포) 12 X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브. 현금 지급기와 T 세포를 분석하면 별도의 튜브를 준비하고, 필요한 보상 및 수정 형광 뺀 (FMO) 컨트롤을 수용하기 위해 튜브의 적절한 수를 준비하는 여분의 세포를 결합합니다. </li></ol> 참고 : 예를 들어, F4/80 및 CD11b, 다음과 같은 보상 및 FMO 컨트롤에 따라 현금 인출기의 비율을 정량화 할 때하는 준비를해야합니다 : - 흠 (세포) - DAPI 또는의 propidium 요오드화 물의 (PI) 단일 얼룩 (세포, 단계 5.1까지 생존 염료를 추가하지 마십시오) - F4/80 APC 얼룩 하나 (세포 나 보상 비즈) - CD11b FITC (얼룩 단일 세포 또는보상 비즈) - FMO 1 (셀) : 쥐 IgG2a κ 이소 타입 제어 APC + CD11b FITC + 생존 염료 (단계 5.1에 추가) - FMO 2 (셀) : F4/80 APC + 쥐 IgG2b κ 이소 타입 제어 FITC + 생존 염료 (단계 5.1에 추가) <ol start="3"><li> (시약 및 재료의 표 참조) 적절한 농도에서 형광 - 복합 일차 항체 및 / 또는 이소 타입의 컨트롤을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 빛과 부화에서 샘플을 보호합니다. </li><li> 4시 5 분 500 XG에 2 ㎖의 FACS 버퍼와 원심 분리기 세포 현탁액을 추가 ° C. </li><li> 2 ㎖ FACS 버퍼에서 가만히 따르다 뜨는을 Resuspend SVF 세포 펠렛. </li><li> ≥ 400 μL FACS 버퍼에 5 ° C에서의 분, 및을 Resuspend SVF 세포 펠렛을 위해 세포 현탁액 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 35 μm의 셀 스트레이너 관 정상을 갖춘 12 X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 샘플을 전송합니다.</li><li> 4에 빛 및 저장 샘플로부터 보호 ° C를 FACS 분석까지. </li></ol> 참고 : 최적의 결과를 세포 immeadiately 분석해야하지만,이 프로토콜 FACS 분석을 성공적으로 4 ℃에서 1-2 시간 동안 FACS 버퍼에 저장된 라벨 세포에서 수행되었다 세포는 저장 시간이 증가하도록 수정해야 할 경우, 레이블이 세포는 FACS 분석을하기 전에 24 시간 동안 4 2 % 파라 포름 알데히드 ° C로 고정 할 수 있습니다. 항체 회사라는 세포가 1 주일로 저장할 수 있습니다하는 것이 좋습니다 있지만, 이것은이 절차의 컨텍스트 내에서 테스트되지 않았습니다. 5. FACS 분석 <ol><li> 이전 FACS 분석에 죽은 / 라이브 셀 차별을 허용하도록 샘플 및 적절한 컨트롤에 생존 염료를 추가합니다. </li></ol> 참고 : 많은 가능성 염료 상업적으로 사용할 수 있지만, DAPI 및 PI는 여기 / 방출 교수에 따라 추천형광 - 복합 항체의 레스가 사용되고있다. DAPI와의 propidium 요오드화물은 0.2 밀리그램 / ML의 최종 농도에서 각각의 샘플에 추가됩니다. <ol start="2"><li> 관심의 세포 인구 (들) 규모가되도록 측면 산란 (SSC) 앞으로 분산 형 (FSC)를 조정하는 실험 샘플과 같은 조직에서 고립 된 흠없는 대조군 샘플, 바람직 세포를 사용합니다. </li></ol> 참고 : SVF 세포 AT의 분석을 위해, 그것은 SSC는 리니어 스케일에 FSC 대 로그 스케일로 표시하는 것이 좋습니다. 종종 매우 크고 세분화되어 현금 인출기를 분석 할 때 SSC에 대한 로그 스케일의 사용은 특히 중요합니다. <ol start="3"><li> 분석되고 셀 (들)의 유형에 따라 초기 빛의 산란 문을 그리고 흠없는 세포까지 (약 10 2)를 중심으로 단일 매개 변수 히스토그램의 왼쪽에 위치하도록 광전 튜브 (PMT)는 게인 조정 해당 채널. &lt;/ 리&gt; </ol> 주 : 림프구와 대 식세포 (또는 다른 골수 세포) 때문에자가 형광의 차이에 개별적으로 분석하는 것이 좋습니다. <ol start="4"><li> 멀티 컬러 보정을 수행하는 하나의 스테인드 컨트롤이나 항체 캡처 보상 비즈를 사용하고 있습니다. </li></ol> 참고 : 보상 구슬의 사용이 권장되지만, 각 항체의 호환성을 보장해야합니다. 예를 들어, 보상 비즈 고립 된 세포가 적절한 하나의 얼룩 제어를 얻기 위해 요구되는 경우에 토끼 항체와 교차 반응하지 않을 수 있습니다. <ol start="5"><li> 수정 FMO 컨트롤에 따라 실험 게이트를 설정합니다. </li><li> 그 인구의 보급에 따라 이벤트의 해당 번호를 수집하고 실험 데이터를 기록하는 흐름 cytometer에 설정합니다. </li><li> 수출 FCS 데이터를 오프라인 분석을 위해 파일. 흐름 cytometr 가능한 많은 프로그램이 있습니다Y 데이터 분석. 우리는 Cytobank, investigatores 인터넷 액세스 18와 함께 모든 컴퓨터에서 그림을 저장하고 분석 데이터 및 생성 할 수있는 웹 기반의 플랫폼을 권장합니다. 또한, Cytobank 데이터 공개에 액세스 할 수 있도록하거나 공동 작업자에 대한 액세스를 제한 할 수있는 기능을 제공합니다. </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

비만의 신진 대사 결과에서 면역 체계의 역할에 대한 관심의 증가는 AT의 면역 세포를 특성화 유동 세포 계측법의 광범위한 사용하게되었다. 정확한 프로토콜은 자신의 경험과 장비를 사용할 기준으로 실험실 사이에 다를 수 있지만, 중요한 단계는 콜라 소화, 차등 원심 분리하고, 세포 표면 항원 라벨 (가) 있습니다. 본 문서의 목적은 AT 및 / 또는 유동 세포 계측법을 수행하는 작업에 대한 경험을 가진 수사관 SVF AT의 분리에 대한 자세한 프로토콜과 실용적인 가이드를 제공하는 것입니다. 모든 실험 기법으로, 또는 현저하게 원하는 결과에 영향을 미치지 않을 수도 있습니다 많은 차이가 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로, 프로토콜 상세한 여기에 시간, 자원, 세포 수율 및 세포 생존 능력 사이의 가장 효율적인 균형을 나타냅니다. 예를 들어, 우리는 그 증가를 발견했습니다콜라게나 비슷한 농도에서 교원질 II 소화 기간을만큼 60 분 셀룰러 수율에 영향을 거의 미치지있다, 따라서 우리...

역사적으로, 지방 조직 (AT)는 에너지 균형에 대한 응답으로 신축 지질 스토리지의 불활성 기관으로 조회되었습니다. 우리는 지금 AT 적극적으로 직접 먹이 행동과 조직의 포도당 항상성에 영향을 미치는 호르몬의 숫자를 분비 동적 내분비 기관을 나타내는 것을 알 수 있습니다. 또한, 지난 10 년 동안 각막 혈관 분획 (SVF)뿐만 아니라 항상성에 그들의 공헌 AT에 거주하는 면역 세포의 다양한 인구에 대한 증가하는 감사가있다. 1964 1 Rodbell에 의해 설명 된 지방 세포와 SVF는 콜라게나 다이제스트를 사용하여 AT를 분리하는 기능은 차등 원심 분리에 의해 따랐다. 콜라게나 II는 대부분 지방 세포의 인슐린 수용체 1의 보수에 의한 지방 세포와 SVF 분리하는 데 사용됩니다. AT의 초기에, 효소 분획은 주로 adipo을 연구하기 위해 고용되었다신진 대사를 cyte 및 preadipocytes를 분리 할 수​​ 있습니다. 더 최근에, 흐름 cytometers의 광범위한 가용성과 상업적으로 이용 가능한 형광 - 복합 항체의 계속 증가와 함께이 기술은 면역 세포 AT의 특성을 촉진했다. AT 염증 면역 세포의 존재가 이전에이 설명되어 있었지만, 와이즈 버그 등으로 정액 논문. 그리고 쑤 하였다. 출판은 2003 년에 염증성 사이토 카인을 분비하고 AT 별 및 조직 인슐린 저항성 3,4와 연관 비만 식세포 AT의 축적 (현금 인출기)을 문서화하는 첫번째이었다. 이러한 관찰은 연구의 새로운 분야의 기초 최근에, &quot;immunometabolism,&quot;10 신조어로 제공하고 돌기 세포 6, 비만 세포 7, T 세포 8 등 다양한 면역 세포 인구를, 연루 연구에 의해 미행 당하고있다 -10, B 세포 11, NKT 세포 12, 호산구 13, 및 호중구 비만 관련 인슐린 저항의 개발에 14,15. 이 문서의 목적은 SVF AT의 세포를 분리하고 현금 인출기의 특성 및 유동 세포 계측법을 통해 T 세포 AT에 사용되는 콜라 다이제스트 기술에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 AT 마우스에 최적화되어 있지만, 시청자는 16 AT 인간이 기술의 최적화에 대한 광범위한 세부 정보를 제공하는 우수한 기사를 읽고 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 문서의 대상은 제한된 경험 AT 마우스 작업 및 유동 세포 계측법을 수행하기에 수사관을 포함합니다. 시간과 자원을 가진 세포 수율과 생존의 균형을위한 몇 가지 실제적인 고려 사항은 면역 세포 인구 AT 특성화뿐만 아니라 최적의 유동 세포 계측법 컨트롤로 표시됩니다. 우리의 프로토콜뿐만 아니라, 독자 referr 있습니다적절한 컨트롤과 보상 17를 포함하는 유동 세포 계측법의 기술적 측면의 일부 훌륭한 토론 바수 등.의 최근 조브 기사에 에드.

<table><tbody><tr><td>DPBS(Ca 또는 Mg 없음) 10 x 500ml</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>안정 스택 20 마이크로리터</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>20 마이크로리터 필터 팁</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>안정 스택 250 마이크로리터 팁</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>1000 마이크로리터 팁</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>1000 마이크로리터 필터 팁</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>250 마이크로리터 필터 팁</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC 블록</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>fisher 100mn 스트레이너</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>중간 무게 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>다진 가위</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>필터 상단 FACS 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10ml 피펫 케이스 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>라운드 바닥 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V 바닥 플레이트</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>전사 벌브 피펫</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>접착 매트</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr>세포 <tr><td>배양 원심분리기</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td><td></td></tr><tr><td>어댑터</td><td>Sorvall</td><td>75003723</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>농도 : 0.5 - 1 &mu; g / 10 6 세포</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 F4 / 80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>형광 접합체 : APC 농도 : 0.2 &mu; g/ 106 세포 이소타입 제어 카탈로그 번호: 17-4321</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>형광단 접합체: FITC 농도: 0.5 &mu; g/ 106 세포 이소타입 제어 카탈로그 번호: 11/1/4031</td></tr><tr><td>아르메니아 햄스터 안티-마우스 CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>형광단 접합체: PE 농도: 0.8 &mu; g/ 106 셀 이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: Dec-88</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 MGL1/2</td><td>R& D 체계</td><td>FAB4297P</td><td>Fluorophore 켤레: PE 농도: 0.1 & g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 CD206</td><td>R& D 체계</td><td>FAB2535P</td><td>Fluorophore 켤레물: PE 농도: 0.1 & g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC108P</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CCR2</td><td>R& D 체계</td><td>FAB5538P</td><td>Fluorophore 켤레물: PE 농도: 0.1 &mu; g/ 106 셀 이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: IC013P</td></tr><tr><td>아르메니안 햄스터 안티-마우스 TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>형광단 접합체 : APC 농도 : 0.2 &mu; g / 10 6 세포 동종 제어 카탈로그 번호 : 553956</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>형광 단 접합체 : PE-Cy7 농도 : 0.8 &mu; g / 10 6 세포 Isotype 제어 카탈로그 번호 : 552784</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>Fluorophore conjugate : Alexa Fluor 700 농도 : 0.2 &mu; g/ 106 셀 아이소타입 컨트롤 카탈로그 번호: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">표 1. 재료 및 시약 목록.</td></tr></tbody></table>

지방 조직 면역 세포의 분리

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

비만 설치류와 인간의 지방 조직의 증가 식세포 침윤 (AT)의 발견은 로컬 및 전신 인슐린 저항 면역 세포 공헌에 대한 관심 강화하게되었다. 엎드려서 비만 AT 다른 면역 세포 집단의 분리 및 정량 지금 immunometabolism 실험실에서 일반적으로 활용 기법, 아직 극도의주의를 얻을 데이터가 안정적이고 해석되도록 기질 혈관 세포의 분리 및 유동 세포 계측법 분석을 모두 수행해야 . 이 비디오에서 우리는, 말하다 소화와 면역 세포가 풍부한 기질 혈관 부분을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 항체 라벨 식세포와 T 림프구 방법과 유동 세포 계측법 실험에서 그들에 제대로 게이트하는 방법을 보여줍니다. 저지방 먹이 엎드려서 고지방 먹이 비만 쥐에서 대표 유동 세포 계측법 플롯이 제공됩니다. 이 분석의 중요한 요소는 어떻게 항체를 사용하는 것입니다대 식세포 AT 자연 autofluorescent중인 채널뿐만 아니라, 적절한 보상 컨트롤의 사용 형광 없습니다.

차등 원심 분리 한 다음 AT의 콜라 소화 저지방 (지방에서 10 % 킬로 칼로리) 또는 높은 지방 (지방 60 %의 킬로 칼로리) 다이어트 (LFD 및 HFD을 공급 수컷 C57BL/6J 마우스의 부고환 지방 패드에서 SVF를 분리하는 데 사용되었다 각각) 16 주. SVF의 세포는 다음 FACS 분석을 통해 가능한 ATM 기기 (그림 1)과 T 세포 (그림 2) AT 비율을 정량화하는 형광 - 복합 일차 항체로 표지 하였다. 빛의 산란, 쌍으로 차별과 생존 게이트 등의 초기 게이트는 그림 1A와 2A에 묘사되어 있습니다. 이 그림 2A의 초기 빛의 산란 게이트 autofluorescent 골수 세포를 포함하여 방지하기 위해 림프구 인구로 제한됩니다 것을 강조해야한다. 수정 FMO를 사용하는 예제는 그림 1B에 묘사되어 실험 게이트를 설정하는 제어합니다. 이 예에서, F4/8...

지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

이 절차의 전반적인 목표는 지방 조직 면역 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 표피 지방 패드를 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 지방 조직을 콜라겐 분해 효소로 소화합니다.다음으로, 지방 조직 기질 혈관 분획을 차등 원심분리를 통해 분리합니다. 마지막 단계에서 지방 조직 면역 세포는 fluoro four conjugated primary antibody로 표지됩니다. 궁극적으로, 지방 조직에 존재하는 생존 가능한 대식세포와 T 세포의 비율은 유세포 분석으로 정량화할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 Alyssa Hasty입니다. 오늘은 지방 조직에서 면역 세포를 분리하고 정량화하는 방법을 보여 드리겠습니다. 이 방법은 유전적 약리학적 또는 영양 조작에 따라 지방 조직의 면역 세포 집단이 어떻게 변화하는지와 같은 면역 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.오늘 이 절차를 시연할 사람은 아리안 케네디(Arian Kennedy)와 젭(Jeb), 또는 제 연구실의 박사후 연구원들입니다. 안락사된 동물의 털을 에탄올 70%로 충분히 적신 후 시포이드 돌기 수준으로 절개하고 흉강을 열어 심장을 노출시키며 주요 혈관이 절단되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 혈액과 perfu eight이 순환계를 빠져나갈 수 있도록 우심방을 클립합니다.그런 다음 집게를 사용하여 심장을 잡고 정점을 통해 좌심실에 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 이제 15ml의 멸균 PBS로 마우스를 천천히 관류합니다. 그런 다음 복막강을 열고 생식선 조직이 생기지 않도록 주의하여 송골 생식선 지방 패드를 제거합니다.0.5%BSA가 보충된 마그네슘과 칼슘이 없는 DPBS가 2밀리리터인 얼음 위의 유청 보트에 지방 패드를 넣은 다음 지방 조직을 미세한 조각으로 다집니다. 이것은 다지기가 완료되면 지방이 어떻게 보여야 합니다. 이제 다진 지방 조직 균질액을 15 밀리리터 원추형 튜브에 붓습니다.BSA가 보충된 DPBS 1ml로 webo를 헹구고 세척액을 원뿔형 튜브에 붓습니다. 다음으로, WHE 보트를 3ml의 콜라겐 분해 효소 용액으로 헹구고 세척액을 튜브에 붓습니다. 회전식 셰이커에서 200RPM과 섭씨 37도에서 20분 동안 균질한 것을 배양합니다.그런 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 10ml의 BSA 보충 DPBS를 균질액에 추가합니다. 다음으로, 분해된 균질산물을 여러 번 반복하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 100마이크로미터 필터를 통해 세포 현탁액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브에 통과시킵니다.세포를 회전시킨 후, 스내트(snat)를 디캔팅한 다음 기질 혈관 분획 세포 펠릿(stromal vascular fraction cell) 펠릿 내에서 오염된 적혈구를 이(腨)로 만듭니다. 3밀리리터의 CK 버퍼가 있습니다. 팩스 버퍼를 빠르게 추가하여 A CK 버퍼를 중화합니다.세척 및 펠릿 재준비 후 셀을 팩스 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 trian blue exclusion에 의해 생존 가능한 세포를 계수하고 세포 현탁액을 5-10 곱하기 10의 최종 농도로 밀리리터당 6개의 세포로 더 희석합니다. 얼음 위에서 10분 동안 6개 세포에 대해 10-10μm의 최종 농도로 anti-US CD 16, CD 32 FC 차단 항체를 세포를 배양하여 염색을 시작합니다.그런 다음 세포를 6개의 분취량에 대해 10보다 크거나 같은 크기로 나누고 분취량을 12 x 75mm 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 필요한 보상과 변형된 형광에서 하나의 대조군을 뺀 값을 수용할 수 있도록 적절한 수의 튜브에 여분의 세포를 결합합니다. 그런 다음 fluoro 4 conjugated primary antibodies 및 isotype control을 적절한 농도의 적절한 튜브에 추가합니다.섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 샘플을 배양한 후, 샘플을 2밀리리터의 팩스 버퍼로 두 번 세척하고 400마이크로리터 이상의 팩스 버퍼에 펠릿을 현탁시켜 두 번째 세척 후 35마이크로미터 셀 스트레이너 튜브 상단이 장착된 새로운 12 x 75mm 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 샘플을 옮깁니다. 분석 직전에 살아있는 사세포 구별을 위한 생존 다이를 적절한 샘플에 추가합니다. 그런 다음 stained negative control을 사용하여 측면 산점도를 로그 스케일로 조정하고 전방 산점도를 선형 스케일로 조정합니다.다음으로, 분석 중인 세포의 유형에 따라 초기 광 산란 게이트를 그리고 광전자 증배관 게인을 조정하여 염색되지 않은 세포가 적절한 채널에 대한 두 표시의 경향을 대략 중심에 둔 단일 매개변수 히스토그램의 맨 왼쪽에 오도록 합니다. 항체 포획 보상 비드를 사용하여 다색 보상을 수행한 다음 이전에 준비된 수정된 형광에서 1 대조군을 뺀 값을 기반으로 실험 게이트를 설정합니다. 마지막으로, 관심 모집단의 유병률에 따라 적절한 수의 이벤트를 수집하고 실험 데이터를 기록합니다.이 첫 번째 일련의 밀도 플롯에서, 소변 표피 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획 세포는 지방 조직 대식세포의 식별을 위해 F 4 80 및 CD 11 B에 대해 염색되었습니다. 이 처음 세 개의 패널은 광 산란, 이중선 판별 및 생존 가능성 게이트를 포함한 초기 게이팅 전략을 보여줍니다. 다음 두 패널에서는 실험 게이트를 설정하는 데 사용되는 제어 1개를 뺀 대표적인 변형 형광을 관찰할 수 있습니다.이 예에서, F 4 80 및 CD 11 B 항체는 자가형광 및 비특이적 결합을 설명하기 위해 적절한 isotype control로 대체되었습니다. 그런 다음 실행 가능한 F 4, 80 CD, 11 B, 양성 지방 조직 대식세포를 식별하기 위해 사분면 게이트를 그렸습니다. 그런 다음 저지방 및 고지방 사료 마우스에서 분리된 F, 4, 80 양성 CD, 11 B, 양성 지방 조직 대식세포의 비율을 이러한 대표적인 밀도 플롯에 표시된 바와 같이 비교할 수 있습니다.이 다음 패널 시리즈에서, 초기 광 산란 게이트는 자가형광 골수성 세포를 포함하지 않기 위해 림프구 집단으로 제한되었습니다. 이 마지막 두 쌍의 패널에서, CD 4 개의 양성 및 CD 8 개의 양성 지방 조직 T 세포에 대한 대표적인 게이팅이 표시됩니다. 생존 가능한 지방 조직 림프구는 TCR R beta tcr에 대해 먼저 게이팅되었습니다.그런 다음 R 베타 양성 지방 조직 T 세포를 CD 4 및 CD 8 발현에 대해 게이트화했습니다. 그런 다음 고지방 및 저지방 사료 마우스의 지방 조직에서 분리된 TCR 베타 양성 T 세포와 CD 4개 양성 T 세포와 CD 8개 양성 T 세포의 비율을 비교할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 지방 조직 면역 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

학습하세요 지방 조직 면역 세포 분리 방법을 통해 대식세포와 T 세포를 분리하고 유세포 분석으로 정량하는 기술을 익히세요. 이 방법은 비만과 면역대사 질환 연구에 필수적입니다.

지방 조직 면역 세포의 분리

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