쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장 신경 전구 세포의 이동 가능성을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 형광 신경 지각 세포로 채워진 쥐 배아, 소장을 해부함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 진동하는 마이크로톰을 사용하여 200미크론 두께의 장 조각을 만드는 것입니다.

다음으로, 이 조각은 성장 인자를 함유한 콜라겐 젤 위에 배양됩니다. 마지막 단계는 그 아래에 있는 이동하는 세포를 드러내기 위해 슬라이스를 벗겨내는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사법은 콜라겐 겔 내에서 세포가 이동하는 패턴을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 말초 신경계의 기저에 있는 다양한 신호 경로 간의 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 제공하는 것과 같은 발달 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.질 마개를 발견한 후 12일 후에 암컷 쥐를 안락사시키고 자궁을 제거한 후 자궁을 얼음으로 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. Cold PBS는 개별 부기 사이의 자궁을 가로로 절단하여 해부 현미경으로 각 배아 착상 부위를 분리하고 가는 집게를 사용하여 자궁의 근육층을 제거합니다.

내장 난황 자루와 양막을 열어 배아를 드러냅니다. 혈관을 절단할 때, 발달 중인 장과 얽혀 있는 난황 자루에 배아를 결합할 때 주의해야 한다. 다음으로, 닫힌 겸자를 짙은 붉은색 간 바로 위의 복강에 삽입하고 열리도록 합니다.

이것은 복강에 횡단 개구부를 만듭니다. 열린 겸자를 배아의 뒤쪽 끝을 향해 아래로 당겨 복부를 완전히 엽니다. 일단 열리면 간 뒤의 결합 조직을 잡고 내장을 빼냅니다.

내장이 부러지지 않도록 주의합니다. 배아의 나머지 부분에서 내장을 분리하기 위해 아무 위치에서나 결장을 절단하십시오. 꼬리 부분은 나중을 위해 예약하십시오.

맹장에서 결합 조직을 떼어낸 다음 창자가 소장의 배부 끝에 상처를 입지 않도록 조심스럽게 작업합니다. 간과 위뿐만 아니라 중위, 네프로 및 생식기 융기(있는 경우)를 잘라냅니다. 마지막으로, 맹장과 결장, 그리고 남아 있는 결합 조직을 잘라내어 소장을 분리한다.

이전과 마찬가지로 장을 긁지 않도록 주의하십시오. 소장을 PBS에 삽입하기 전에 가능한 한 짧은 시간 동안 실온에 두십시오. 목에서 배아를 절단한 후 배아 발달 단계를 정확하게 결정하기 위해 꼬리 솜털의 수를 기록합니다.

배아 해부를 진행하기 전에 PBS 100ml에 1.5g의 아그로스를 녹이고 섭씨 50도를 유지합니다. 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 세로로 절단하여 튜브 벽의 약 1/4을 절제하여 임베딩 몰드를 준비합니다. 녹인 아그로스를 틀에 붓고 만졌을 때 약간 따뜻해질 때까지 식힙니다.

준비가 되면 접힌 배의 끝을 집게로 잡고 곰팡이의 길이를 따라 아그로를 통해 매우 천천히 당깁니다. 이것은 장을 곧게 유지하는 데 도움이 되며, 어그로 세트는 조직이 움직이지 않기 시작하자마자 조직을 방출하고 장의 배변 방향을 추적하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 금형을 냉장고에 2-3분 동안 넣어 완전히 굳힙니다.

설정이 완료되면 곰팡이에서 아그로스를 제거하고 양쪽 끝에서 여분의 아그로스를 다듬어 장에 수직으로 자릅니다. 아그로스 블록의 로스트랄 끝을 마이크로톰의 금속 스테이지에 붙이고 모든 면에서 여분의 아로스를 다듬습니다. 다음으로, 진동하는 마이크로톰 챔버에 금속 스테이지를 장착합니다.

필요한 경우 장이 가능한 한 수직이 되도록 스테이지의 각도를 조정하십시오. 마이크로톤 블레이드를 버퍼 표면 아래 몇 mm까지 내리기 전에 얼음처럼 차가운 PBS로 표본을 덮습니다. 준비가 되면 가장 작은 장의 200미크론 가로 절단을 만듭니다.

각 농업 조각에 전체 장 섹션이 포함되어 있는지 확인합니다. 갓 자른 조각을 미리 준비한 콜라겐 젤에 부드럽게 놓습니다. 신경 능선 세포가 가지에서 밖으로 이동할 수 있도록 각 웰의 중앙을 향해 한 조각을 놓고 3일 동안 조각을 배양합니다.

이 시간이 지나면 아래 젤이 손상되지 않도록 주의하면서 집게로 콜라겐 젤에서 조각을 부드럽게 떼어냅니다. 세포 이동 패턴이 방해받지 않도록 하려면 후속 배양 및 세척 단계에서 콜라겐 겔을 직접 만지지 않는 것이 중요합니다. 먼저 실온에서 1시간 동안 웰당 500마이크로리터의 4%PFA로 셀을 고정합니다.

다음으로, 정착액을 웰당 500마이크로리터의 DPI 용액으로 교체하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 DPI 용액을 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 PBS로 5분 동안 각 웰을 세 번 세척합니다. 마지막으로, 각 웰 내의 콜라겐 겔에 내장된 형광 세포를 촬영합니다.

이 예에서는 장 신경 지각 세포를 발현하는 GFP의 이동을 자극하기 위해 성장 인자를 사용했습니다. 점선은 익스플란의 대략적인 크기와 위치를 나타냅니다. 젤을 벗기 전에, 장 explan에서 이동하는 세포를 표현하는 GFP의 수 그리고 퍼짐은 대우된 대 치료되지 않은 상태에서 현저하게 더 중대한 것을 찾아냈습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 성장 인자를 함유한 콜라겐 젤 위에 장 절편을 배양하여 장 신경 전구 세포의 이동 가능성을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.