Name: 쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 쥐 장내 신경 전구 세포의 양이 세포 이동을 정량화하는 ex vivo 분석법을. 형광 현미경으로 성장 인자에 따른 세포 이동 패턴을 관찰하여 말초 신경계 형성 메커니즘을 이해하는 데 활용합니다.

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우리는 이미지 처리 및 분석 조언 데니스 워드 컨트리의 .. 감사합니다, 데이비드 W. Silversides 그의 실험실에서 Gata4p [5킬로바이트-GFP 마우스 라인이 생성되었습니다. 필론 실험실에서 연구를 CIHR, NSERC, FRQS 및 FRQNT에 의해 투자된다.

윤리 문 마우스를 포함하는 실험은 의학 연구에 사용 된 동물의 관리 및 조작을위한 동물 보호 지침의 캐나다 협의회 다음을 수행 하였다. 동물의 조작을 포함하는 프로토콜은 몬트리올 퀘벡 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (위원회 (CCT) Institutionnel 드 보호 데 Animaux, 참조 번호 0512-R3-650-0513). 1. 콜라겐 젤의 제조 조직 문화 후드에서 멸균 방식으로 작업 할 수 있습니다. <ol><li> 표준 항생제 등을 포함한 5 배 DMEM (이글의 수정 필수 매체)를 준비합니다. 20 ㎖의 물에 DMEM 분말과 탄산 수소 나트륨의 0.925 g의 3.37 g을 녹인다. 0.22 μm의 필터를 통해 전달하여 소독. 무균 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 멸균 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 25 ㎖의 2.5 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </li><li> 얼음에서 800 μl를 혼합완전한 배 DMEM 600 ㎕의 1 N NaOH를 17 ㎕의 콜라겐 I 용액 (0.02 N 아세트산, 필터 소독에 3.77 ㎎ / ㎖). 3 ㎖의 최종 부피로 멸균 수로 희석. 믹스 관련 성장 인자를 포함합니다. 우리는 일반적으로 장내 NCC 마이그레이션을 자극하는 10 NG / ㎖에서 GDNF를 사용합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 단일 행의 각 웰 예금 480 μL. 거품을 피하십시오. 나머지 행은 세포 이동의 다른 성장 인자의 효과를 테스트하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 콜라겐은 37 ℃에서 멸균 배양기에서 1 시간 이상을 중합하자 </li></ol> 2. 동물 (16)의 해부 <ol><li> 교배를 설정하고 다음 날 아침에 질 플러그를 확인합니다. 일 E0.5는 질 플러그가 발견되는 일 정오되는 여성을 격리하며 E12.5 12 시까 지 일을 기다려야. </li><li> 이소 플루 란으로 임신 한 쥐를 마취 및 CO 2 흡입에 의해 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. 복부의 리프트친척 및 해부 가위로 복부에 구멍을 엽니 다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS (인산염 완충 식염수)로 채워진 유리 페트리 접시에 자궁을 제거합니다. 각각의 배아 주입 사이트를 분리하기 위해 가로 방향으로 개별 deciduum의 부종과 자궁을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 다른 유리 페트리 접시에 따로 따로 각 주입 사이트에서 작동합니다. 해부 현미경 하에서 자궁 근육층을 제거하는 미세 집게를 사용한다. </li><li> 배아를 나타 내기 위해 내장 난황과 양막을 엽니 다. 그들이 개발 창자 고리로 연결되었다는로, 태반 / 내장 난황에 배아를 결합하는 혈관을 절단하는 경우주의하십시오. </li><li> 목에서 배아의 머리를 절단. </li><li> 그냥 어두운 붉은 색, 간 이상, 태아의 복강에 닫힌 집게를 삽입하고 복부 구멍에 횡단 구멍을 만들기 위해 (압력을 적용 중지) 자체의 집게가 열려하자. 향해 열린 집게를 아래로 당겨완전히 복부를 열 수있는 배아의 뒤쪽 끝. </li><li> 간 뒤에 결합 조직을 잡고 (콜론 항문에 부착) 내장을 파괴하지 않도록주의하고, 복부 밖으로 내장을 빼냅니다. </li><li> 배아의 나머지 부분에서 용기를 무료로 결장을 잘라. 컷 콜론의 임의의 위치에서 할 수있다. 이후의 꼬리 부분을 예약. </li><li> 맹장의 결합 조직, 내장의 다음 나머지를 애타게. 그렇게하는 동안 장내 상처하지 않도록주의하십시오. </li><li> 약간의 위험이있는 경우에는 간, 위 (소장의 주동이의 끝)뿐만 아니라 mesonephros 성기 능선을 버려야. </li><li> 소장을 분리합니다. 또, 대장을 잘라 내지 않도록주의하십시오. 지금부터, 창자 조직의 rosrrocaudal 방향은 주동이의 끝에 존재하는 날카로운 곡선을 사용하여 추적 할 수 있습니다. EM 전에 가능한 한 짧은 시간 동안 실온에서 PBS에 소장 남기기침구 (단계 3.3 참조). </li><li> 마지막으로, 정확하게 배아 발달의 단계를 결정하기 위해 각각의 배아에 대한 꼬리 somites의 수를 기록한다. </li></ol> 3. 배아 창자의 단면 <ol><li> 배아 해부 진행하기 전에 100 ㎖의 PBS (인산염 완충 식염수)에 1.5 g 아가로 오스를 녹여 50 ℃로 유지 </li><li> 부어 삽입 금형에 용융 아가로 오스 (예를 들어, 약 1 / 4 튜브 벽의 절제하는 길이 절단 된 2 ML의 microcentrifuge 관을 폐쇄). 아가로 오스는 약 42 ~ 45 ° C의 열을 식히, 그것은 터치에 약간 따뜻해야한다. </li><li> 다만 아가로 오스 응고하기 전에 배아 소장을 포함 (이것은 집게 팁으로 평가 될 수 있으며, 주변에 36 ~ 38 ° C 발생)을. 접힌 주동이의 말에 집게로 장을 들고, 금형의 길이를 따라 아가로 오스를 통해 매우 천천히 잡아 당깁니다. 이것은 바로 아가 세트 동안 창자를 유지하는 데 도움이됩니다. T 릴리스즉시 이동하고 저항하기 시작 실행합니다. 창자의 주동이의 - 꼬리 방향을 확인합니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 설정 한 보장하기 위해, 냉장고 2-3분에 금형을 넣어. </li><li> (열린 에펜 도르프 튜브 밖으로 밀어) 금형에서 아가로 오스를 꺼내. 블레이드, 소장에 수직 커트를하고, 양쪽 끝에서 초과 아가로 오스를 꺼내. </li><li> 진동 블레이드와 마이크로톰의 금속 무대에서 아래로 차단 아가 소장 /의 주동이의 끝을 붙입니다. 소장 / 아가로 오스 블록의 측면에 여분의 아가로 오스를 낸다. </li><li> 진동 마이크로톰 챔버의 금속 단계를 탑재합니다. 필요에 따라서는 소장 (따라서 블레이드에 수직) 가능한 한 수직 스테이지의 각도를 조정한다. 얼음처럼 차가운 PBS로 표본을 커버. 버퍼 표면에서 몇 mm까지 마이크로톰 블레이드를 가져옵니다. </li><li> 해당 전자를 보장 꼬리 가장 소장의 200 ㎛ vibratome 가로 컷을 만드는ACH 아가로 오스 조각은 전체 장 섹션이 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. 장내 외​​식 문화 <ol><li> 부드럽게 잘 각각의 중앙을 향해 한 조각을 배치, 집게로 콜라겐 젤에 갓 잘라 소장 / 아가로 오스 조각 평면을 예금. </li><li> 이식편 중 NCC의 마이그레이션을 할 수 있도록, 습도 5 % CO 2 분위기에서, 37 ° C 3 일간 배양한다. </li><li> 집게 매우 부드럽게 콜라겐 겔 떨어져 소장 / 아가로 오스의 조각을 가져 가라. 아래의 젤이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 세포의 이동 패턴이 교란되지 않도록하기 위해 후속 배양 및 세척 단계에서 직접 콜라겐 겔을 만지지 마십시오. 실온에서 잘 1 시간 당 (PBS에서) 4 % PFA (파라 포름 알데히드)의 500 μL로 수정합니다. </li><li> 물론 당 DAPI 500 μL (4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌) 솔루션 (PBS에서 5 ㎍ / ml)로 정착을 교체하고 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 잘 배 각각의 세척5 분 동안 PBS 500 μL와. </li><li> 각 웰 내의 콜라겐 겔에 포함 된 형광 세포 (GFP 및 DAPI 채널)의 사진. </li></ol> 5. 이미지 분석 우리는 이식편 배양 한 후 생성 된 이미지를 처리하고 정량화 ImageJ에 17를 광범위하게 사용했다. <ol><li> 형광 세포 사진과 같은 배율에서 마이크로 미터 슬라이드 이미징에 의해 시작합니다. (직선 도구를 사용하여) 픽셀 1 미크론의 길이를 측정한다. </li><li> (/ 설정 규모를 분석, 픽셀 / 마이크론의 입력 번호) 규모를 설정합니다. </li><li> 각 GFP의 형광 사진을 위해, 8 비트 그레이 스케일 (Image/Type/8-bit)로 이미지 형식을 변경합니다. </li><li> 신호 (이미지 / 조정 / 밝기 / 명암 ​​대비)의 강도를 조정합니다. </li><li> 필요 (프로세스 / 배경 빼기, 롤링 볼 반경을 조정)하면 배경 잡음을 뺍니다. </li><li> 세포와 세포 덩어리 (이미지 / / 임계 값을 조정), 강조하기 위해 임계 값을 설정합니다N 덩어리 (공정 / 진 / 유역을) 분할하는 분수령을 적용합니다. </li><li> 관심 영역 (ROI)을 지정하고 세포 수의 통계를 생성하는 입자를 분석 (입자 분석 / 분석, 설정 크기 최소 남아있는 픽셀을 제외). </li><li> 의 Feret의 직경 (설정 / 측정 분석)를 포함하는 측정 옵션을 설정합니다. </li><li> 그룹의 ROI와의 Feret의 직경을 결정하기 위해 전체로 측정, 세포의 확산의 표시 (/ 도구 / ROI 관리자 / 더 / 또는 다음 ROI 관리자 추가 / ROI 관리자 / 측정 분석). </li></ol>

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</ol>

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우리는 우리의 생체 이식편 배양 기술은 정확하게 GDNF의 존재에 장내 NCC 이주 가능성을 정량화하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이러한 정확한 정량이 크게 11,12,15 이전에 설명 된대로, 200 ㎛ 두께의 vibratome 창자 부분을 사용하는 대신 대략적인 크기의 큰 조각에 의해 촉진된다. 사실, 이것은 우리가 재현성이 높은 환경에서 세포의 적절한 수와 함께 작업 할 수 있습니다. 참고로, 이식편 슬라이스가 절단되는 소장의 꼬리 - 대부분의 영역 내에서 형광 장내 NCC의 균일 한 분포는 하나의 창자 (그림 1A)에서 여러 부분의 분석을 할 수 있습니다. 또한, 장내 NCC와 축삭이 모두 문화 기간 말에 같은 분석 (11), 외식의 철수에 조직을 종료 할 수 있습니다 우리가 철새 NCC에 독점적으로 초점을 맞출 수 있다는 없습니다. 가장 중요한 단계는하...

신경 능선 세포 (NCC)의 배아를 개발하는 동안 많은 유도체를 형성하는 척추 동물에 고유 한 과도 세포 유형입니다. 이 세포 집단이 아닌 신경 외배엽 1에 인접한 신경 판의 경계에서 발생한다. neurulation 동안, 성형 신경관의 등쪽 가장자리를 따라 신경 판의 장소 NCC의 굽힘. NCC는 분리하는 멀리 신경 튜브에서 마이그레이션, 상피 - 간엽 전환을 받고있다. NCC들은 전체 장용 신경계 (ENS)를 형성 소화관 장벽에 내장 신경 신경절의 상호 연결된 네트워크를 포함하는 다양한 배아 구조를 정착. 최근 2,3 리뷰, 많은 유전자는이 복잡한 구조의 개발에 참여하고있다. ENS의 대부분은 (즉, 미래의 후뇌 / 척수 경계 정도) 미주 신경 튜브에서 NCC의 원래의 작은 수영장에서 파생 4.이 신경 전구 세포는 쥐의 배아 일 (E) 9.0 주위에 foregut에 도달 약 e15.0 전체 배아 창자를 식민지 때까지 용기의 중간 엽에서 꼬리 쪽 마이그레이션 할 수 있습니다. 대장의 신경 전구 세포의 작은 부분 집합은 최대 맹장 4 반대 방향으로 후방 창자 침입 성례 NCC에 의해 제공됩니다. 미주와 성례의 두 NCC가 필요 여러 마이그레이션, 핵 확산, ENS의 완전한 형성을 보장하기 위해 생존과 분화 촉진 단서.을 이와 관련, 동물 모델 - 특히 유전자 변형 생쥐는 - 여러 가지 중요한 세포 외 리간드의 식별 수단이되었습니다 GDNF (아교 세포 유래 신경 영양 인자), 엔도 텔린-3, 뉴로-3, BMP에 (뼈 형태 형성 단백질), 네트 린에게 뿐만 아니라, 음과 인도의 고슴도치 (쉬와 IHH) ~ 10. 이들 중, (형질 전환시 재 배열) 티로신 키나제 횡단 수용체 RET을 통해 신호 GDNF는 번째로 인식되고배아 창자 및 내 매력과 NCC의 지침에 대한 전자의 가장 중요한 통로. GDNF는 창자의 중간 엽에서 분비 및 RET (11, 12)을 표현 장내 NCC, 직접 chemoattractive 인 시공간으로 제어 rosrrocaudal 구배를 형성한다. 다른 기능 사이에, ENS는 장 벽에 부드러운 근육과의 상호 작용을 통해 소화 기관 내에서의 움직임을 조절한다. Hirschsprung의 질병에있는 장 결과의 말단 부위에있는 신경 중추의 부재 : 영향을받는 부분의 토닉 수축 막힘, 소화 물질의 상류 축적과 창자와 복부의 거대한 팽창에 이르게한다. Hirschsprung 병은 약 5,000 정상 출산을 발생합니다. 장내 NCC의 rostro - 꼬리 이주 패턴은 Hirschsprung의 질병의 원인에 대한 주요 기여 요인이 될 것으로 생각됩니다. NCC와 B의 마지막 부분을 마이그레이션하는 소스의 결장, 먼정착 할 owel는 ENS 형성의 결함에 가장 민감하다. 장내 NCC 마이그레이션에서의 중요한 역할에 따라, GDNF / RET 신호의 중단 Hirschsprung의 질병 (13)의 주요 알려진 유전 적 원인이다. [5킬로바이트-GFP 14 Gata4p 이름 - - 철새 NCC는 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시되는 더 나은 NCC와 ENS 개발을 연구하기 위해, 우리는 유전자 변형 마우스 라인을 생성합니다. 우리는 다음에 지금과 같은 GDNF 등의 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성의 정확한 정량화 할 수 있습니다 다른 그룹 11,12,15에서 출판 작업에서 적응 생체 세포 이동 분석을, 완성.

<table><tbody><tr><td>DMEM 분말</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>생명공학 등급</td></tr><tr><td>Steriflip 진공 여과 시스템(0.22 미크론)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>고품질</td></tr><tr><td>등급 콜라겐 I</td><td>BD 생명과학</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>10 N 재고에서 희석한 후 멸균 여과</td></tr> 된 <tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24웰 플레이트</td><td>BD 생명과학</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>바이오샵</td><td>AGA001</td><td>생명공학 등급</td></tr><tr><td>수술용 칼날</td><td>깃털</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>모든 목적용 인스턴트 크레이지 글루 펜</td><td>크레이지 글루</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V 진동 블레이드 마이크로톰</td><td>써모 사이언티픽</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">특정 시약 및 장비 표.</td></tr></tbody></table>

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

신경 능선 세포 (NCC)는 등의 신경관에서 유래 및 개발 척추 동물의 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 과도 다 능성 세포 집단이다. 말초 뉴런 및 아교를 제공 할뿐만 아니라, NCC는 멜라닌 세포뿐만 아니라 부교감 얼굴 골격의 대부분을 생성한다. NCC 마이그레이션 및 차별화 신경 튜브 및 지역에 별개의 세포 외 신호에 대한 노출을 따라 자신의 축 원점의 조합에 의해 제어된다. 세포 외 리간드의 이러한 기여는 장용 신경계 (ENS), 복잡한 상호 연결 (다른 것들 사이에) 로컬로 제어하는​​ 신경 중추의 네트워크 창자 근육 운동과 장 운동의 형성시에 특히 분명하다. 꼬리 패션에 주동이의 - - 미래의 창자의 전체 길이를 ENS의 대부분은 정착하기 위해 긴 여행을 수행 NCC의 작은 초기 수영장에서 파생됩니다. 로 알려진 몇 가지 신호 전달 경로 중장내 NCC의 식민지에 영향을 미치는, GDNF / RET 신호가 가장 중요한 것으로 인식되고 있습니다. 사실, 창자의 중간 엽으로 RET 리간드 GDNF의 시공간으로 제어 분비 배아 창자 및 내 매력과 RET - 표현 장내 NCC의 안내를 주로 담당하고 있습니다. 여기, 우리는 GDNF 등 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성 정확한 정량화 할 수 찬란 NCC를 가진 유전자 변형 마우스 라인을 사용하고, 생체 세포 이동 분석에 대해 설명합니다.

다음과 같은 결과 (그림 1) 여기에 설명 된 기술로 얻을 수있는 대표입니다. 성장 인자 (즉, GDNF)의 사용은 GFP를 발현하는 장 이식편에서 그리고 콜라겐 겔에 장내 NCC (그림 2)의 이동을 자극한다. 일부 세포가 성장 인자의 부재하에 이식편 밖으로 나와 있지만, 이들은 주로 GFP-표지 아니며 패시브 엔트리를 나타낸다. 그것은이 조직이 여전히 크게 형광 세포에 의해 채워지며, 그렇지 않으면 아래 콜라겐 거짓말 세포를 숨기는 것 같은 결과를 기록하기 위해 콜라겐 겔에서 장내 조각을 제거 할 필요가있다. 이러한 결과의 정량화는 GDNF가있을 때 더 많은 세포가 콜라겐 겔 내에서 발견되는 것을 보여줍니다, 그리고 활동적인 이동은 (그림 3) 일어난다. 실제로, 수동 세포는 장 슬라이스의 직경 내에서, 어디 있나, 바로 외식에서 찾을 수 있습니다<html> 적극적으로 콜라겐 겔에 침입 EAS 세포가 떨어져 원래의 자...

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 다양한 성장 인자가 존재할 때 장 신경 전구세포의 이동 잠재력을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 형광 신경능세포(neuro crest cells)가 분포된 생쥐 배아의 소장을 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 진동 마이크로톰을 사용하여 소장을 200 micron 두께의 절편으로 만드는 것입니다.다음으로, 이 절편들을 성장 인자가 포함된 콜라겐 겔 위에 올려 배양합니다. 마지막 단계는 절편들을 벗겨내어 그 아래로 이동한 세포들을 확인하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 콜라겐 겔 내에서 세포가 이동한 패턴을 관찰합니다.이 방법은 말초 신경계 형성의 기초가 되는 다양한 신호 전달 경로 간의 상호작용에 대한 이해를 높이는 것과 같이, 발생 생물학의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 질전(vaginal plug)이 확인된 지 12일 후에 암컷 마우스를 안락사시키고 자궁을 적출하여 얼음이 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. 냉각된 PBS 상태에서 해부 현미경 하에 개별 자궁각 팽대부 사이를 가로로 절단하여 각 배아 착상 부위를 분리하고, 미세 핀셋을 사용하여 자궁의 근육층을 제거합니다.내장 난황낭과 양막을 절개하여 배아를 노출시킵니다. 배아를 난황낭과 연결하는 혈관들이 발달 중인 장과 얽혀 있으므로, 이를 절단할 때 주의하십시오. 다음으로, 암적색의 간 바로 위쪽 복강 내에 닫힌 포셉을 삽입한 후 포셉을 엽니다.이렇게 하면 복강에 횡단 개구부가 형성됩니다. 벌린 포셉을 배아의 후단 방향으로 당겨 복부를 완전히 엽니다. 복부가 열리면 간 뒤쪽의 결합 조직을 잡아 내장을 밖으로 끌어냅니다.장(intestines)이 손상되지 않도록 주의합니다. 결장(colon)의 임의의 위치를 절단하여 배아의 나머지 부분에서 내장을 분리합니다. 꼬리 부분은 나중에 사용하기 위해 남겨둡니다.소장의 머리쪽 끝부분이 손상되지 않도록 주의하며 맹장과 장의 결합 조직을 조심스럽게 떼어냅니다. 간과 위, 그리고 중신, 신장 및 생식 능선이 있는 경우 이를 절제하여 제거합니다. 마지막으로 맹장과 결장 및 남은 결합 조직을 절제하여 소장만을 분리합니다.이전과 마찬가지로 장을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 포매 전까지 소장을 상온의 PBS에 담가 두되, 시간은 최대한 짧게 유지하십시오. 목 부위에서 배아를 절단한 후, 배아 발달 단계를 정확히 결정하기 위해 꼬리 체절(tail somites)의 수를 기록하십시오.배아 해부 전, PBS 100 milliliters에 agros 1.5 grams를 녹여 50 degrees Celsius로 유지합니다. 2 milliliter 마이크로 원심분리 튜브를 세로로 잘라 튜브 벽의 약 4분의 1을 제거하여 임베딩 몰드를 준비합니다. 녹인 agros를 몰드에 붓고 손으로 만졌을 때 약간 따뜻한 정도가 될 때까지 식힙니다.준비가 되면, 포셉으로 접힌 주둥이 쪽 끝부분(rostral end)을 잡고 몰드 길이를 따라 agarose를 통해 매우 천천히 끌어당깁니다. 이는 장을 곧게 유지하는 데 도움이 됩니다. agarose가 굳어 조직이 움직임에 저항하기 시작하면 즉시 조직을 놓아주고, 장의 주둥이 쪽 방향(rostral orientation)을 계속 확인하십시오. 다음으로, 몰드를 냉장고에 2~3분 동안 넣어 완전히 굳힙니다.고정되면 몰드에서 agros를 제거하고, 장과 수직이 되도록 양 끝의 불필요한 agros 부분을 잘라냅니다. agros 블록의 두측(rostral end)을 마이크로톰의 금속 스테이지에 접착시키고 모든 면의 과잉 agros를 다듬습니다. 그다음, 금속 스테이지를 진동 마이크로톰 챔버에 장착합니다.필요한 경우, 장이 가능한 한 수직이 되도록 스테이지의 각도를 조정합니다. 마이크로톰 칼날을 완충액 표면에서 수 밀리미터 아래로 내리기 전에 시료를 얼음처럼 차가운 PBS로 덮습니다. 준비가 되면, 소장 말단 부위를 200 micron 두께로 횡단 절단합니다.각 농아(agro) 슬라이스에 완전한 장 단면이 포함되었는지 확인합니다. 갓 절단한 슬라이스를 미리 준비된 콜라겐 젤 위에 조심스럽게 올립니다. 신경능세포(neuro crest cells)가 외배엽(eggplants) 밖으로 이동할 수 있도록 각 웰의 중앙 부분에 슬라이스를 하나씩 배치하고, 3일 동안 배양합니다.이 시간이 지난 후, 핀셋을 사용하여 하단의 젤이 손상되지 않도록 주의하며 조심스럽게 슬라이스를 콜라겐 젤에서 떼어냅니다. 세포 이동 패턴이 흐트러지지 않도록, 이후의 배양 및 세척 단계 동안 콜라겐 젤을 직접 건드리지 않는 것이 중요합니다. 먼저, 웰당 500 µL의 4% PFA를 사용하여 상온에서 1시간 동안 세포를 고정합니다.다음으로, 고정액을 웰당 500 µL의 DPI 용액으로 교체하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 DPI 용액을 조심스럽게 제거하고, 각 웰을 500 µL의 PBS로 5분 동안 세 번 세척합니다. 마지막으로, 각 웰의 콜라겐 겔 내에 내포된 형광 세포를 촬영합니다.본 예시에서는 성장 인자를 사용하여 GFP를 발현하는 장 신경능 세포의 이동을 촉진하였습니다. 점선은 외식편의 대략적인 크기와 위치를 나타냅니다. 젤에서 분리하기 전, 장 외식편 외부로 이동하는 GFP 발현 세포의 수와 확산 정도는 처리하지 않은 조건에 비해 처리한 조건에서 유의하게 더 많은 것으로 나타났습니다.이 영상을 시청한 후, 성장 인자가 포함된 콜라겐 겔 위에 장 절편을 배양하여 장 신경 전구세포의 이동 잠재력을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현은 소설 아가로 오스 겔 기반 microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포 (NSCs)의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 이 기술은 인간의 신경 줄기 세포와 같은 세포 소스가 없어서 다른 포유 동물 세포 시스템에 쉽게 적응할 수 있으며, 시간을 주변의 차례가 중요합니다.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

여기 SCS는 확장 axons을 함께 개발 할 수 있습니다하는 Schwann 세포 (SC) 마이그레이션 분석을 설명합니다.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 중요한 단계입니다. 여기에 설명되는 프로토콜은 DNA / 작은 머리핀 RNA (shRNA를) nucleofection 및 설치류 출생 주동이의 철새 스트림에서 격리 neuroblasts와 3D 마이그레이션 분석을 사용하여 neuroblast 마이그레이션 후보 규제 기관의 역할을 조사 할 수 있습니다.

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 쥐 장내 신경 전구 세포의 양이 세포 이동을 정량화하는 ex vivo 분석법을. 형광 현미경으로 성장 인자에 따른 세포 이동 패턴을 관찰하여 말초 신경계 형성 메커니즘을 이해하는 데 활용합니다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

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