엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

이 절차의 전반적인 목표는 바코드가 부착된 다중화된 DNA 라이브러리를 사용하여 종양 조직 세포의 암 관련 유전자에서 체세포 돌연변이를 식별한 다음 대규모 병렬 염기서열분석을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 보존된 종양에서 분리된 DNA 단편에 바코드 염기서열분석 어댑터를 결찰하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 279개의 종양 유전자 및 종양 억제 유전자의 모든 단백질 코팅 엑손을 보완하는 맞춤형 비오틴화 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화입니다.

세 번째 단계는 캡처된 라이브러리에서 바코드가 지정된 풀의 대규모 병렬 시퀀싱을 수행하는 것입니다. 마지막 단계는 279개의 표적 유전자에 대한 암 관련 변형에 대한 염기서열 데이터를 검색하는 것입니다. 이 절차는 염기서열 돌연변이, 작은 삽입, 작은 결실, 복제 수 변경 및 선택적 구조적 변경을 나타낼 수 있습니다.

따라서 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 일반적인 돌연변이와 희귀 돌연변이 모두에 대한 전체 엑손을 조사할 수 있을 뿐만 아니라 복제 수 손실 및 이득과 같은 추가 게놈 변형을 식별하고 이종 샘플에서 더 높은 감도를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다양한 암 유형에서 주요 동인 돌연변이는 무엇인지, 임상 표본의 이러한 돌연변이가 표적 치료에 대한 결과 또는 반응과 상관관계가 있는지와 같은 암 유전체학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 돌연변이가 전향적으로 식별되고 환자가 적절한 치료법 및 임상 시험을 안내하는 데 사용될 수 있기 때문에 암의 진단 및 치료로 확장됩니다.

비드에서 DNA를 세척하고 피하는 동안 필요한 주의 기술로 인해 꿀벌 청소 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 최종 수리 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플당 50마이크로리터가 되도록 적절한 부피를 혼합합니다. 각 순식 DNA의 50마이크로리터를 ID 6웰 플레이트의 별도 웰로 분취합니다.

그런 다음 준비된 말단 보수 마스터 믹스 50마이크로리터를 각 반응에 추가하고 플레이트를 섭씨 20도에서 30분 동안 열순환기로 배양하여 반응을 세척합니다. 먼저, 각 샘플에 200마이크로리터의 AMP pure XP 비드를 추가하고 멀티 채널 파이펫터를 사용하여 전체 부피를 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 실온에서 15분 동안 청소합니다. 투명해지면 비드를 방해하지 않도록 주의하면서 대부분의 상층액을 부드럽게 제거하고 버립니다. 일부 액체는 우물에 남아 있을 수 있습니다.

그런 다음 갓 준비한 200%에탄올 80마이크로리터를 각 샘플에 부드럽게 넣고 플레이트를 실온에서 30초 동안 배양합니다. 조심스럽게 피펫으로 에탄올을 제거하고 한 번 더 세척을 반복합니다. 다음으로, 모든 알코올이 빠져나갈 때까지 접시를 실온에서 건조시킵니다.

이제 건조된 비드를 44.5마이크로리터의 멸균수에 다시 현탁시킵니다. 마지막 배출로 각 샘플을 피펫을 통해 10회 부드럽게 흘려보냅니다. 우물 측면에 붙어 있는 구슬을 모두 헹굽니다.

이제 실온에서 2분 동안 물에 매달린 구슬을 배양한 다음 우물이 깨끗해질 때까지 5분 동안 자기 스탠드로 이동합니다. 마지막으로, 샘플을 포함하는 각 웰에 42마이크로리터의 투명한 상등액을 새 웰로 부드럽게 옮깁니다. 이제 샘플은 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.

먼저 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에서 D 테일링 마스터 믹스를 준비합니다. 준비된 DA 테일링 마스터 믹스 8마이크로리터를 말단 복구된 DNA의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 반응을 청소하기 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 열순환기에서 플레이트를 배양합니다.

이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 두 배의 부피로 사용하고 Resus가 33.75마이크로리터의 멸균수에 비드를 매달아 마무리합니다. 이 시점에서 샘플은 최대 일주일 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 계속하려면 반응당 15 마이크로리터에 대한 ligation 마스터 믹스를 준비하십시오.

D tail DNA를 포함하는 각 웰에 15마이크로리터의 ligation master mix를 추가합니다. 다음으로, 적절한 25 마이크로 몰 1.25 마이크로 리터를 추가합니다. 다음 플렉스 바코드 어댑터.

각각에 대해 각 샘플은 별도의 바코드 어댑터를 받아야 합니다. 어댑터가 로드되면 섭씨 20도에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 이제 50마이크로리터의 비드를 사용하여 어댑터 후 결찰 세척을 수행하고 샘플을 50마이크로리터의 멸균수에 재현탁합니다.

그런 다음 23마이크로리터의 물로 마무리하는 두 번째 청소 과정을 수행합니다. 이 시점에서 샘플은 최대 일주일 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 다음 단계는 ice thaw, 범용 및 인덱스 올리고뉴클레오티드 차단제, CCAP easy library, con TNA two X hybridization buffer 및 hybridization component를 포함하는 nimble gen capture components에 대한 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 각 샘플을 라이브러리 증폭

A. 이제 라이브러리 준비에 사용된 특정 바코드 어댑터 서열에 해당하는 인덱스 올리고뉴클레오티드 차단제의 1밀리몰 풀을 준비합니다. 각 차단제 1마이크로리터를 결합하고 10초 동안 함께 와류로 만듭니다.새로운 1.5밀리리터 튜브에서 밀리리터당 1밀리그램의 conte A 5마이크로리터, 범용 차단제 2마이크로리터 및 차단제 풀의 2마이크로리터로 구성된 포획 혼합물을 준비합니다. 24개의 바코드가 있는 라이브러리를 단일 반응으로 풀링합니다.

총 1-3마이크로그램의 풀링된 바코드 염기서열 라이브러리를 캡처 믹스에 추가합니다. 20게이지 이하의 바늘을 사용하여 캡에 15-20개의 구멍을 뚫고 섭씨 60도의 DNA 진공 농축기에서 혼합물이 완전히 마를 때까지 진공 청소기로 혼합물을 청소합니다. 다음으로, 혼성화 완충액과 혼성화 성분 A.Cover에 있는 구멍을 테이프로 덮고 10 초 동안 표본을 와류로 섞으십시오.

그런 다음 10초 동안 최대 속도로 혼합물을 원심분리합니다. 이제 섭씨 95도에서 혼합물을 잠시 배양하여 DNA를 변성시킵니다. 그런 다음 0.2 밀리리터 PCR 스트립 튜브에서 실온에서 최대 속도로 10초 동안 원심분리하고, 2.25 마이크로리터의 ccap easy library capture probe를 동일한 부피의 멸균 뉴클레아제가 없는 물에 혼합합니다.

그런 다음 원심분리기 반응에서 튜브에 혼합하고 피펫 팁을 통해 총 부피를 10회 부드럽게 흐릅니다. 이제 0.2 밀리리터 튜브를 섭씨 47도의 열 순환 장치에서 48-96시간 동안 배양합니다. 열 순환기의 뚜껑 온도를 섭씨 57도로 유지하여 증발을 방지하고 며칠 후 반응 온도를 안정화합니다.

포획된 DNA의 세척 및 회수 단계를 사용합니다. 그런 다음 변형된 Roche 민첩한 세대 프로토콜을 사용하여 큐비트 고감도 분석을 사용하여 증폭된 캡처된 DNA를 정량화하여 캡처된 DNA 마무리를 증폭합니다. 12개의 종양 정상 쌍을 포함하는 24개의 바코드 염기서열 라이브러리의 한 풀을 279개의 암 유전자 프로브를 사용하여 캡처하고 2 x 75로 염기서열 분석했습니다.

HighSeq 2000 플로우 셀 종양 및 정상 라이브러리의 단일 레인에 대한 염기쌍 판독은 2:1 비율로 풀링되었습니다. IGV 이미지는 폐암에서 EGFR 엑손에서 염기서열 커버리지의 특이성을 보여주며, 회색 막대는 고유한 염기서열 판독을 나타냅니다. 오른쪽의 이형접합 T two G 돌연변이가 판독값의 24%에서 나타났으며, 이는 체세포 L 8 58 R 아미노산 치환임을 나타냅니다.

정상 폐 조직의 판독 결과 중 어느 것도 이 TTA G 돌연변이를 보여주지 않았고, 결장직장암 종양에서 일부 indels, 정상 쌍은 PC에서 체세포 프레임시프트 삽입 또는 7개 염기쌍의 체세포 프레임시프트 결실을 보여주지 않았습니다. TP 53에서는 종양 정상 쌍 사이에서도 복제 수 변화가 관찰되었습니다. 각 데이터 포인트는 279개의 표적 유전자에서 단일 엑손을 나타냅니다.

복제 수 증가 및 손실은 종양 염기서열의 증가 및 감소에서 추론됩니다 적용 범위 일단 숙달되면 이 기술은 공유 라이브러리 준비의 경우 6시간 30분 내에 완료할 수 있으며 적절하게 수행되면 포획 혼성화의 경우 48-96시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 분석을 수행하는 것은 데이터 분석에 혼란을 줄 수 있으므로 라이브러리 준비 중에 오염 물질에 주의하는 것이 매우 중요하지만, 이 절차에 따라 Sanger 염기서열분석 및 단편 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 의심스러운 변형을 어떻게 검증할 수 있습니까? 이 동영상을 시청한 후에는 바코드가 있는 DNA 라이브러리를 준비하고 이러한 풀링된 라이브러리에서 Exxon 캡처를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.