Name: 옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 배우세요 바늘 주입법을 이용해 옥수수와 테오신테에 우스틸라고 성 실증을 접종하고 병해 저항성을 선별하는 방법을. 이 기술은 정확한 병원체 전달로 식물-병원체 상호작용 연구에 효과적입니다.

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에미르 이슬라모비치 박사에게 실험실과 온실 지원을 해주셔서 감사드립니다. 셰리 플린트-가르시아 박사에게 도주해 주신 것에 대해서도 감사드립니다.

1. 식물 재료의 성장
<ol><li>접종 및 스크리닝을 위해 식물 라인을 선택합니다. 2개의 옥수수 라인, 5개의 테오신테 라인, 그리고 미국 maydis에 대한 특징성이 없는 40개의 옥수수 x 테오신테 라인이 이 작품(표1)에사용되었다.</li>
	<li>실험용 식물종자(U. maydis 주입) 및 제어(물 주입) 바늘 주입 접종 실험. 각 플랜트 라인에 대해 이 작업을 수행합니다.</li>
	<li>작은 평지에 각 식물 라인에 대해 4 개의 씨앗 (복제)을 심고 손가락으로 토양으로 약 1/2 인치 씨앗을 밀어 토양으로 가볍게 덮음으로써(그림 1A 및 1B). 씨앗 위에 토양을 포장하지 마십시오. 씨앗을 심거나 씨앗 위에 토양을 포장하면 모종 출현에 문제가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>씨앗을 토양에 물을 넣습니다. 토양에 흠뻑 젖고 씨앗이 물을 뿌은 후 토양 아래에 남아 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>물을 마신 후, 수중 및 야간 환경이 28/20°C, 광기간 의 14/10 시간, 각각 500 μmol/m2 초   광합성 활성 방사선이 캐노피의 상단에 있는 성장 챔버에 놓는다. 낮과 밤의 상대 습도를 각각 약 70%와 90%로 유지합니다.</li>
	<li>실험 전반에 걸쳐 일치하는 성장 환경을 유지하기 위해 동일한 성장 챔버에 모든 식물을 유지합니다.</li>
	<li>10일 후, 식물을 성장 챔버로부터 제거하고 바늘 주입 접종 방법을 사용하여 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 식물을 접종한다. 참고 : 옥수수 식물은8-10을심은 후 7 일 동안 접종 할 수 있습니다. 그러나, 테오신테 식물은 7 일 후에 너무 작습니다. 따라서, 실험 내의 일관성을 위해 심기 후 10일 후에 옥수수와 테오신테 식물을 접종한다(2.12단계 참조).</li>
</ol>2. 바늘 주입 접종
<ol><li>라미나르 플로우 후드에서 모든 작업을 수행합니다. 냉동고 보관에서 미국 수지니스 글리세롤 주식을 제거하십시오. 미국 마디스 야생형 균주 1/2(짝짓기 형 a1b1) 및 2/9(짝짓기 형 a2b2, 동종 에 가까운 1/2) 감자 덱스트로스 한천(PDA) 플레이트에 멸균 루프 및 줄무늬 글리세롤 스톡을 사용한다. 균주를 별도로 유지합니다.</li>
	<li>PDA 플레이트를 30°C 인큐베이터에 2일 동안 배치합니다. 다른 생영양 병원균을 사용하는 경우 적절한 변형, 미디어 및 성장 조건을 사용합니다. 미국 의 수지 변형이 잘 성장하고 있는지 확인하기 위해 이틀 동안 병원균의 성장을 모니터링합니다. </li>
	<li>2일 후에 인큐베이터에서 PDA 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 좋은 병원균 성장을 가져야하며 단일 식민지(그림 2A)를포함해야합니다. 단일 식민지를 얻는 것이 중요합니다. 단일 식민지가 존재하지 않는 경우 낮은 농도에서 플레이트를 다시 행진.</li>
	<li>라미나르 플로우 후드로 모든 작업을 수행합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 PDA 플레이트의 각 변형에 대해 단일 콜로니를 선택합니다. 단일 콜로니가 들어 있는 이쑤시개를 감자 덱스트로스 국물(PDB)에 넣습니다. 2-3 문화가 있는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3ml PDB 배양을 30°C 인큐베이터/셰이커에 200rpm에 2일간 놓습니다. 문화의 성장을 보장하기 위해 이틀 동안 문화의 성장을 모니터링할 수 있습니다. 문화는 매우 흐린 나타납니다.</li>
	<li>인큐베이터/셰이커로부터 액체 배양을 제거하고 OD600의 농도를 측정하여 세포가 1.0(~1 x 107 셀/ml)의 OD로 성장되었는지확인한다.</li>
	<li>최종 30ml 배양량에 물을 사용하여 1 x 106 셀/ml의 최종 농도로 U. maydis 세포 현탁액 배양을 가져옵니다. 이러한 농도는 병원균 세포 현탁액 배양을 가진 식물의 좋은 감염을 일관되게 초래한다. 17
</li>
</ol>참고: 다양한 세포 현탁액 농도는접종18,19에필요한 적절한 세포 티터를 결정하기 위해 상이한 병원균 균주를 사용할 때 테스트되어야 한다. 세포 현탁액 배양에 대한 주어진 최종 농도는 소급을 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 병원체 세포 현탁액 배양의 적절한 농도는 좋은감염(그림 3A-E)으로식물 표현형을 시각화하여 검증되어야 한다.
<ol start="8"><li>접종 전에 두 개의 U. maydis 균주의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 하나의 병원균균을 사용하는 경우 2.9단계로 진행한다. 각 접종 실험에 대한 신선한 U. maydis 세포 현탁액 배양을 준비하고 2 일 후에 세포 현탁액 배양을 폐기하십시오.</li>
	<li>실험용 바늘 주입 접종의 경우, 세포 현탁액 배양을 주사기로 끌어서 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 3ml 주사기를 채우는 다.</li>
	<li>대조군 바늘 주입 접종의 경우, 물17로3ml 주사기를 채우는 다. 실험용 바늘 주입 접종에 동일한 절차를 사용하십시오.</li>
	<li>각 3ml 주사기의 끝에 0.457 mm x 1.3cm 피하 바늘을 부착합니다. 선택된 바늘 크기는 식물 조직에 최소한의 손상으로 식물 잎 사이에 세포 현탁액 배양을 전달할 것이다.</li>
	<li>바늘 주입접종(도 2B)에대비하여 심기 10일 후에 성장 챔버로부터 실험 및 제어 식물을 제거한다(1.7단계 참조).</li>
	<li>미국 메이디스 세포 현탁액 배양을 함유한 피하 주사바늘을 토양 선 바로 위에 90° 각도로 실험 식물의 줄기에 조심스럽게 삽입한다. 바늘이 줄기 한가운데에 들어야 삽입합니다. 줄기(도 2C)를통해 바늘을 밀어붙이지 마십시오.</li>
	<li>미국 의 약 100 μl을 가진 실험 식물을 주입하여 세포 현탁액 배양18,19. 이것은 모종의 높이에 따라 약간 달라집니다. 세포 현탁액 배양은 줄기를 통해 밀어 식물의 소용돌이로 이동합니다. 세포 현탁액 배양은 식물의 소용돌이에서 볼 수 있습니다. 3ml 주사기가 비어 질 때까지 각 개별 식물에 세포 현탁액 배양 100 μl을 계속 주입하십시오.</li>
	<li>주입 후 식물 줄기에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 지금 빈 3ml 주사기에서 바늘을 제거하고 물로 채웁니다. 바늘을 주사기에 다시 부착하고 바늘을 통해 물을 밀어 바늘 끝에 잡힐 수있는 식물 조직을 제거합니다.</li>
	<li>각 실험 플랜트에 대해 2.9-2.15단계를 반복합니다. 물을 주입하여 제어 식물에 대한 동일한 프로토콜을 따르십시오.</li>
	<li>접종된 실험 및 제어 식물을 다시 성장 챔버에 넣습니다. 식물 조직이 아닌 토양을 적시어 식물에 매일 물을.</li>
	<li>병원균 발달 및 식물 내성 반응을 감지하기 위해 매일 식물을 확인하십시오.</li>
</ol>3. 저항 반응 스크리닝
<ol><li>각 식물에 대한 저항 반응을 점수 및 기록 7, 10, 14, 및 21 일 사후 접종 (dpi) 1 5 저항 반응 등급 척도를 사용하여. 등급 척도의 수치 값이 증가함에 따라 질병 심각도가 증가합니다(표2). 1C(잎 클로로시스), 1A(잎 안토시아닌 생성) 또는 2(작은 잎 담즙) 저항 반응이 저항을 나타낸다. 3(줄기담), 4(기초담즙), 또는 5(식물사멸) 저항반응은 감수성을나타낸다(그림 3A-E 및 표 2)18,19.</li>
	<li>실험 및 제어 식물과 기록 저항 반응 등급을 모두 점수.</li>
	<li>실험 및 제어 식물의 저항 반응을 비교합니다. 1C, 1A 또는 2 저항 반응 등급을 가진 실험 식물을 선택합니다. 이 식물은 미국 maydis18,19에저항하는 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>전체 실험을 반복하여 식물 표현형을 확인합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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본 연구에서는 700개의 옥수수와 테오신테 식물의 줄기로 미국 의 균주를 전달하는 데 사용되는 바늘 주입 접종 방법이 성공적이었다. 또한, 개정된 질병 저항 등급 척도는 식물을 선별하고 병원체 발달을 검출하기 위해 사용되었다. 두 가지 방법을 모두 사용한 결과, 미국 메이디에 저항하는 식물 라인은 700개의 옥수수와 테오신테 식물 중 에서 확인되었으며, 이는 이제 질병 내성을 향상시키기 위한 사육 프로그램에서 결합및 테스트될 수 있다.
대부분의 접종 방법과 마찬가지로 동일한 라인에서 식물 간에 동일한 저항 표현형을 재현하는 능력이 필수적입니다. 또한, 동일한 저항 표현형은 적어도 두 개의 별도실험에서 관찰되어야 한다 20,21. 식물 표현형을 얻을 수 있는 능력은 내성이든 민감하든, 주로 식물 조직에 접근할 수 있는 병원균의 능력에 의해 결정되기 때문에, 각 접종을 떠나는 식물 사이에 병원균을 전달하는 접종 방법을 선택하는 것이...

식물의 곰팡이 질병은 농업에 가장 저명한 위협 중 하나입니다. 세계 인구의 식량 수요로 인해 질병 저항이 개선된 작물을 개발할 필요성이 증가하고 있습니다. 식물 병원체는 작물 수확량6에부정적인 영향을 미치는 질병을 일으키는 현장에서 작물 식물을 자연적으로 감염시킵니다. 저항하는 식물을 식별하고 활용하면 저항을 개선하고 수율 손실을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다. 내성 품종은 옥수수, 밀, 쌀, 사탕수수를 포함한 많은 식물 종에서 식물 병원균으로 식물을 접종하고 저항하는 라인7을선택하여 확인되었습니다. 따라서 효율적인 접종 방법의 개발 및 사용은 많은 식물을 접종하고 저항을 위해 선별 할 수 있게 합니다. 딥 접종, 병원체 현탁액 배양배의 배관, 바늘 주입 접종8-11등 다양한 접종 방법이 사용되고 있다. 각 방법을 통해 병원균이 식물성 잎 사이에 안정적으로 도입되어야 하며 병원균의 형성을 통해 식물성전환증을 통해 식물성전환기(12,13)를보장해야 한다.
딥 접종 방법은 식물 묘목 을 병원체 현탁액 배양으로 잠급하는 것을 포함하며, 파이펫팅 방법은 병원균 세포 현탁액 배양을 식물 묘목의 소용돌이에 배치해야합니다. 그러나 두 가지 방법에 문제가 있습니다. 첫째, 두 가지 방법은 잎 표면에서 매우 가변적인 식물 조직으로 병원균의 자연적인 움직임에 의존한다. 대부분의 병원균은 식물 잎 표면에 장토 마개 또는 상처를 통해 자연적으로 식물에 들어갑니다. 그러나, 잎 표면에 스토마타 및/또는 상처를 통해 식물 잎 표면을 관통하는 병원체 기능에 상당한 가변성이 있다. 따라서 병원균 침투는 잠재적으로 일관되지 않은 데이터를 초래할 수 있는 접종 방법으로 제어할 수 없습니다. 둘째, 많은 수의 식물을 선별할 때, 묘목을 병원체 현탁액 배양으로 침수하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 스크리닝될 수 있는 식물의 수를 제한할 수 있다. 반대로, 본 원에 기재된 바늘 주입 접종 프로토콜은아프레소리아(14)의형성을 용이하게 하는 식물 잎 사이에 병원체 현탁액 배양을 전달한다. 병원체는 병원체 침투 문제를 제거하는 식물에 들어가기 위해 새로 개발 된 appressoria를 활용합니다. 또한, 바늘 주입 접종 프로토콜은 미국 신체 상해와 접종 된 옥수수와 테오신테 식물에 대한 표현형의 범위를 제공하고 좋은 감염을 입증한다. 표현형은 병원체 현탁액 배양에 가장 적합한 농도를 결정하기 위해 마커로서 사용될 수 있으며, 이는 상이한 실험 내부와 그 사이에 일관된 식물 표현형을 초래한다.
병원균 세포 현탁액 배양으로 식물 접종에 이어 식물은 전형적으로 내성 또는 취약한 표현형8-11,15를검출하기 위해 선별된다. 질병 등급 척도가 식물 표현형을 선별하고 분류하기 위해 광범위하게 사용되고 있지만, 분석중인 병원체에 따라 등급 척도가 다릅니다. 따라서, 미국 메이디및 옥수수 상호작용에 대한 질병 등급 척도 프로토콜 확립은 유사한 곰팡이 병원균(16)에 활용될 수 있다.
현재 일련의 프로토콜은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인의 미국 증시 세포 현탁액 배양 및 질병 내성 반응 스크리닝을 가진 바늘 주입 접종을 자세히 설명합니다. 본 프로토콜은 옥수수 식물로 의한 미국 수산화의 바늘 주입 접종에 국한되지 않지만 상대적으로 모든 곰팡이 병원균 및 식물 종에 활용 될 수있다. 따라서, 동일한 프로토콜에 있는 두 방법의 세부 사항을 포함하여 연구원은 직접 접종 및 검열을 위한 프로토콜을 이용하거나 관심있는 병원체 및 식물 종에 더 잘 맞추기 위하여 원래 프로토콜을 조작할 수 있게 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>식물</td><td></td><td></td>용 씨앗 <td>원래 십자가에서 수집</td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Conviron</td><td>PGR14 REACH-IN</td><td></td></tr><tr><td>심기 아파트</td><td>Hummert International</td><td>14-3385-2</td><td></td></tr><tr><td>토양 (소나무 껍질 3 부분, 펄라이트가있는 이탄 이끼 1 부분)</td> <td>Hummert International</td><td>10-1059-2</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>실험실 Conoco</td><td>70875372</td><td></td></tr><tr><td>병원체(U. maydis) 또는 관심</td><td></td><td></td> 곰팡이 병원체의 글리세롤 <td>스톡은 원래 배양에서 성장했습니다</td></tr><tr><td>. 멸균 루프</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17356A</td><td></td></tr><tr><td>감자 포도당 한천(PDA) 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>R454311</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터는 30 &deg로 설정되었습니다. C</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650F</td><td></td></tr><tr><td>멸균 이쑤시개</td><td>Walmart</td><td></td><td>Walmart에서 구입하고 오토클레이브로 살균</td></tr><tr><td>감자 포도당 육수(PDB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1008617</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터-셰이커는 30°C로 설정; C</td><td>뉴 브런즈윅</td><td>14-278-179</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>4001000</td><td></td></tr><tr><td>U. maydis&nbsp; 세포 현탁 배양 (1 x 106 cells/ml)</td><td></td><td></td><td>방법에 설명 된대로 글리세롤 스톡에서 성장</td></tr><tr><td>3 ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> 309606.457 <td></td></tr><tr><td>mm x 1.3 cm 피하 주사 바늘</td><td>Kendall 브랜드</td><td>8881250321</td><td></td></tr></tbody></table>

옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

옥수수는 전 세계적으로 주요 시리얼 작물입니다. 그러나, 바이오 트로피크 병원체에 대한 감수성은 생산성을 높이기 위한 주요 제약조건이다. U. maydis는 옥수수에 옥수수 smut의 생물 영양 곰팡이 병원균 및 인과 에이전트입니다. 이 질병은 미국에서 매년 약 10억 달러의 상당한 수율 손실을 담당하고 있으며 작물 회전, 살균제 적용 및 종자 치료를 포함한여러 가지 방법은 현재 옥수수 smut2를제어하는 데 사용됩니다. 그러나, 호스트 저항은 옥수수 smut를 관리 하기 위한 유일한 실용적인 방법. 옥수수, 밀, 쌀 등 농작물 식물의 식별은 다양한 생영양 병원균에 내성이 있는 것으로 매년3-5%감소한다. 따라서 식물 잎 사이에 병원균을 효율적이고 재현적으로 전달하는 병원균 접종 방법의 사용은 미국 의 질비에내성이 있는 옥수수 선의 신속한 식별을 용이하게 할 것이다. 바와 같이, 미국 메이디스에내성이 있는 옥수수 라인을 들여쓰기위한 첫 번째 단계, 바늘 주입 접종 방법 및 저항 반응 스크리닝 방법은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인을 접종하고 내성 식물을 선택하기 위해 이용되었다.
옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인, 약 700 식물로 구성, 심어졌다, 미국 maydis의변형으로 접종, 저항을 위해 선별. 접종 및 스크리닝 방법은 성공적으로 미국 maydis에저항하는 3개의 테오신트 라인을 확인했습니다. 여기에 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인에 대한 상세한 바늘 주입 접종 및 저항 반응 스크리닝 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 바늘 주입 접종이 식물 잎 사이에 미국 maydis를 효율적으로 전달할 수 있는 농업에서 귀중한 도구이며, 현재 질병 내성을 위해 번식 프로그램에서 결합하고 테스트할 수 있는 미국 산염에 내성이 있는 식물 라인을 제공했음을 보여줍니다.

성공적인 바늘 주입 접종은 미국 신체 상해 (실험)로 접종 된 식물의 표현형을 시각화하여 결정 될 수있다. 실험 식물의 대다수는 미국 수지 감염에 취약했다. 민감성 식물은 검은 색 텔리오스포레스(그림3D 및 3E, 표 2)를가진 줄기 및 기저 담즙 형성에 의해 입증된 매우 심각한 질병 발달을 보였다. 몇몇 식물은 질병의 엄격 때문에 접종 후에 죽었습니다. 미국 메이디에 저항했던 3개의 옥수수 x 테오신테 내성 라인이 확인되었다. 미국 의 질증에저항하는 식물의 경우, 경미한 클로로시스, 안토시 아닌 생산 또는 경미한 잎 담즙 형성에 의해 성공적인 접종을 입증하였다. (그림3A-C 및 표 2).
실험용 식물에 대해 관찰된 표현형이 접종의 결과였는지 확인하기 위해, 실험 ...

생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다. 상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

이 절차의 전체적인 목표는 바늘 주입법을 통해 USTA Lago maus 세포 현탁 배양액을 접종하고, maze tete와 maze teosinte 교배 내성 라인의 질병 저항성 반응 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 접종 및 스크리닝을 위한 식물 라인을 선택함으로써 달성됩니다. 그다음, 실험군 및 대조군 바늘 주입 접종 실험을 위한 종자를 심습니다.10일 후, U로 제작된 세포 현탁액을 각 식물의 줄기에 주입합니다. 마지막으로, 실험군과 대조군 식물의 저항성 반응을 비교합니다. 최종적으로, you.Mais를 접종한 식물의 표현형을 시각화함으로써 바늘 주입 접종이 성공적으로 이루어졌음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 병원체를 잎 사이에 직접 전달한다는 것입니다. 이를 통해 병원체의 침투 문제를 해결할 수 있습니다. 우선, 여기에 표시된 것과 같이 접종 및 스크리닝을 위한 식물 라인을 선택합니다. 본 연구에서는 실험 및 대조군 니들 주입 접종 실험을 위해 2종의 옥수수 라인, 5종의 테오신테 라인, 그리고 U Mais에 대한 저항성이 특성화되지 않은 40종의 옥수수-테오신테 교배 라인을 사용하였습니다.각 식물 라인의 종자 4개를 손가락으로 흙 속에 약 0.5인치 깊이로 밀어 넣고 흙으로 가볍게 덮어 작은 플랫에 심습니다. 그런 다음 식물을 성장 챔버에 넣고 종자가 충분히 젖을 때까지 물을 주되, 물을 준 후에도 종자가 흙 아래에 그대로 유지되도록 합니다. 주간 및 야간 온도는 각각 28°C와 20°C로, 광주기와 암주기는 각각 14시간과 10시간으로 설정하여 식물을 재배합니다.그리고 캐노피 상단에서 초당 제곱미터당 약 500 micromolar의 광합성 유효 방사량을 유지합니다. 낮과 밤의 상대 습도를 각각 약 70%와 90%로 유지하고, 모든 식물을 동일한 생장 챔버에 두어 실험 전반에 걸쳐 일관된 생장 환경을 유지합니다. 씨앗을 심은 지 8일 후에, 멸균 루프를 사용하여 냉동 글리세롤 스톡으로부터 *H. uis*를 감자 덱스트로스 배지 또는 PDA 플레이트에 스트리킹하고, 30 °C에서 2일 동안 배양하며, 층류 후드 내에서 적절히 생장하고 있는지 정기적으로 모니터링합니다.멸균된 이쑤시개를 사용하여 각 균주당 단일 콜로니를 선택하고, 이를 3 mL의 PD 배지가 담긴 튜브에 넣습니다. 배양액을 30 °C, 200 RPM에서 2일 동안 배양하며 주기적으로 성장을 확인합니다. 다음으로, 배양액의 OD 600을 측정하여 OD 1.0까지 성장했는지 확인합니다.물을 사용하여 배양액의 최종 부피를 30 milliliters로 맞추고, 최종 농도가 milliliter당 1 million cells가 되도록 희석합니다. 이러한 농도의 병원성 세포 현탁액은 식물에 일관되게 양호한 감염을 유도합니다. 그 후, 접종 전에 준비한 두 가지 균주의 현탁액을 동일한 부피로 혼합합니다.세포 현탁액을 3 mL 주사기에 채우기 전, 대조군 주사기에 물을 채워 식물에 가해지는 손상을 최소화하면서 주입할 수 있도록 합니다. 각 주사기 끝에 0.457 mm x 1.3 cm 저압 주사바늘을 부착합니다. 식물을 성장 챔버에서 꺼내어 토양 경계선 바로 윗부분에 90도 각도로 주입합니다.U-마우스(U maus)의 바늘을 실험 식물의 줄기 중간 부분에 도달할 때까지 조심스럽게 삽입하십시오. 세포 현탁액 약 100 µL를 주입하십시오. 주입된 액체는 줄기를 통과하여 식물의 소용돌이 형태로 이동하며 가시적으로 나타납니다.주사기가 빌 때까지 추가 실험 식물에 계속 주입하십시오. 그런 다음, 바늘에 묻은 식물 조직을 세척하기 위해 주사기에 물을 채우고, 모든 식물에 주입이 완료될 때까지 주사기를 다시 채우십시오. 대조군 식물에도 이와 동일한 방식으로 물 주사기를 사용하여 주입하십시오.주입이 완료되면, 식물을 매일 성장 챔버로 다시 옮겨 놓습니다. 토양에만 물을 주고, 병원균의 발달 및 식물의 저항성 반응을 확인합니다.1에서 5까지의 저항성 반응 등급을 사용하여 접종 후 7, 10, 14, 21일(DPI)에 각 식물의 저항성 반응을 척도화하고 점수를 매겨 기록하십시오. 등급 척도의 수치는 질병의 심각도가 증가함에 따라 높아집니다. 예를 들어, A1C에서 1 또는 2의 저항성 반응은 저항성을 나타냅니다.저항성 반응 등급이 3, 4 또는 5인 경우는 감수성임을 나타냅니다. 실험군 식물과 대조군 식물의 저항성 반응을 비교하고, A1C 저항성 반응 등급이 1 또는 2인 실험군 식물을 선정하십시오. 이 식물들은 matis에 대해 저항성이 있는 것으로 간주됩니다.본 실험에서는 부식토를 접종한 대부분의 식물이 감염에 취약한 것으로 나타났습니다. 식물들은 검은색 여름포자가 형성된 줄기 및 기부 혹 형성을 통해 심각한 질병 발달 양상을 보였습니다. 질병의 심각성으로 인해 접종 후 일부 식물들은 고사하였습니다.이와 대조적으로, 대조군 식물들은 매우 깨끗했으며 식물의 어느 부분에서도 병원균 발달이 나타나지 않았는데, 이는 실험군 식물에서 나타난 병원균 발달이 U Mais의 세 가지 Mais Teosinte 교잡 공격계로 바늘 주입 접종을 수행했기 때문임을 나타냅니다. U Mais에 저항성을 가진 라인들이 확인되었으며, 경미한 경화 현상, 시아닌 생성 또는 미세한 잎 혹 형성으로 성공적인 접종이 검증되었습니다. 이 기술은 재현성 있게 매우 효율적인 방식으로 수행될 수 있습니다. 이는 다량의 식물을 접종하고 표현형 분석을 하는 데 도움이 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

여기, 우리 식물 병원 체와 식물 독성 테스트 프로토콜을 제시 Magnaporthe grisea. 이 보고서 균 분리의 pathotypes의 대규모 검열을 하 고 분자 번 식 하는 동안 식물의 저항 메커니즘을 이해 하기 위한 훌륭한 시작 지점으로 제공.

식물 감염 테스트: 스프레이 식물 병원 체 Magnaporthe Grisea 와 상처-중재 접종

이 작품 옥수수 조직의 세 가지 유형으로 옥수수 단백질 분 비의 원래의 장소에 배달에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 스트레인의 복제에 대해 설명 합니다.

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜.  우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.

Aspergillus flavus 성장 및 유전자 변형 옥수수 표현 Lablab purpureus L.에서에서 α-아 밀라 아 제 억제제에서 아플 라 톡 신 생산의 억제

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

이것은 최소한의 시약과 일반적인 실험실 장비(기본 스마트폰 포함)를 사용하는 보리 잎 덮개 분석의 간단한 프로토콜입니다. 그 목적은 첨단 현미경 장비를 사용하지 않고 실험실에서 모세포 질환의 초기 감염 과정을 시각화하는 것입니다.

기본 현미경과 스마트폰을 사용하여 보리(Hordeum vulgare)에 벼 돌풍병(Magnaporthe oryzae)의 초기 감염 부위 시각화

이 원고는 곰팡이 식물 병원체와의 옥수수 상호 작용에 대한 재현 가능한 세포학적, 생리학적, 분자적 연구를 위해 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용하는 최적화된 접종 프로토콜을 자세히 설명합니다. 잎 덮개는 고정되지 않은 조직에서 살아있는 식물과 곰팡이 사이의 세포 상호 작용을 실시간으로 관찰할 수 있도록 합니다.

곰팡이 잎 옥수수 병원체에 의한 감염의 살아있는 세포 이미징을 위한 분리된 옥수수 덮개

저서 거대 무척추 동물을 사용하는 신속한 생물 평가 프로토콜은 종종 수질을 모니터링하고 평가하는 데 사용됩니다. 효율적인 프로토콜에는 Chironomidae surface-floating pupal exuviae(SFPE)의 수집이 포함됩니다. 여기에서는 현장 수집, 실험실 처리, 슬라이드 장착 및 Chironomidae SFPE의 식별 기술에 대해 설명합니다.

Chironomidae (파리목)의 사용 표면 부동 물 기관에 대한 신속한 생물학적 평가 프로토콜로 번데기 Exuviae을

반추 동물의 메탄 배출량을 측정하는 데 사용되는 기술의 정확성과 정밀도는 온실 가스 완화 노력의 성공에 매우 중요합니다. 이 원고는 반추 동물의 호흡에서 나오는 메탄과 이산화탄소 질량 플럭스를 모니터링하는 자동화 시스템의 원리와 작동을 설명합니다.

자동화 시스템 (GreenFeed)의 사용 반추 동물의 장내 메탄과 이산화탄소 배출량을 모니터링하려면

배우세요 바늘 주입법을 이용해 옥수수와 테오신테에 우스틸라고 성 실증을 접종하고 병해 저항성을 선별하는 방법을. 이 기술은 정확한 병원체 전달로 식물-병원체 상호작용 연구에 효과적입니다.

옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

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