검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 반응성 산소 종 또는 ROS와 그 국소화를 모니터링하고 ROS 관련 세포 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있는 쉽고 다재다능한 솔루션을 제공하는 것입니다. 이는 세 가지 다른 분석을 수행하여 달성되며, 그 중 첫 번째는 RST 녹색 또는 OB G 코팅 비드와 라이브 현미경, ob g fluorescein 및 Alexa를 사용합니다. Fluor 594는 BSA를 통해 3미크론 시카 비드의 표면에 공유 결합됩니다.

OBG fluorescein의 형광 방출은 ROS에 의한 산화를 나타내며, Alexa Fluor 594의 신호는 비드의 국소화를 돕고 형광 정량화를 위한 제어 역할을 합니다. 두 번째 방법은 플레이트 리더 기반 분석에서 과산화물 민감성 프로브 디하이드로 에티듐 또는 DHE를 사용합니다. 과산화물에 의한 산화의 결과로, 에티듐은 핵 및 미토콘드리아 DNA에 삽입될 수 있으며 여기 및 방출 피크가 각각 522나노미터 및 605나노미터로 이동했습니다.

AUM의 형광 강도는 과산화물 생성량에 해당하며, 이를 통해 세포에서 세포 내 과산화물 생성을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 세 번째 방법은 플레이트 리더 기반 분석법입니다. 과산화수소 민감성 프로브 플렉스 울트라 레드 또는 UR은 세포 외 과산화수소 생산을 정량적으로 측정하는 데 사용됩니다.

UR OX의 형광 강도는 세포 외부에서 생성되는 과산화수소의 양에 해당합니다. O-B-G-D-H-E 및 UR 분석을 기반으로 동적 ROS 생성의 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 플레이트 레이트 기반 OB GSA와 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 Al Roth 생성을 동적으로 시각화한다는 것입니다.

세포 집단의 미러링 및 평균 Roth 신호 대신. 이러한 집단 평균화 방법은 비동기식 식세포작용(non synchronous phagocytosis)으로 인해 중요한 정보를 모호하게 만드는 경향이 있습니다. 옥시, Burt Green 또는 OBG로 비드를 코딩하는 절차를 시작하려면 1.0 미크론 카르복실화 실리카 비드의 현탁액 1ml를 1.5 ml 튜브에 추가합니다.

튜브를 빠르게 돌려 상층액을 제거합니다. 이런 식으로 1ml의 PBS와 와류를 추가하십시오. PBS로 구슬을 세 번 씻습니다.

세 번째 세척 후 상층액을 제거하고 비드를 다시 현탁시킵니다. 시안화물 밀리리터당 25밀리그램을 함유한 PBS 1밀리리터에서 시안화물 용액은 사용하기 전에 매번 새로 준비해야 하며 15분 동안 휠에서 배양해야 합니다. 이렇게 하면 카르복실화 실리카 비드가 활성화되어 15분 후에 사전 라벨링된 BSA에 공유 결합하고, 튜브를 원심 분리하고, 상층액을 제거합니다.

1 밀리리터의 커플 링 버퍼와 와류 세척을 빠른 스핀 및 와류로 커플 링 버퍼로 3 번 세척하여 과도한 시안화물을 제거하고, 세척 된 비드를 OBGH 2 H-F-F-B-S-A 1 밀리그램을 포함하는 커플 링 버퍼의 500 마이크로 리터와 혼합 한 다음 표준 가스 캔에서 질소 가스로 튜브를 채 웁니다. 다음 날 어둠 속에서 실온에서 14시간 동안 휠에 배양된 튜브를 캡핑한 후, 1ml의 담금질 완충액으로 비드를 빠르게 회전시키고 볼텍싱하여 비드를 두 번 세척하여 불반응성 OBG를 담금질한 다음 커플링 버퍼로 두 번 세척하여 담금질 완충액을 제거합니다. 상등액을 제거한 후, 50마이크로그램의 LOR 594 cin 중간 에스테르를 함유한 커플링 버퍼 1ml를 첨가하여 BSA에 접합합니다.

튜브에 질소 캡을 채우고 어두운 곳에서 실온에서 1.5시간 동안 휠에서 배양합니다. 1.5 시간의 배양이 끝나면 1 밀리리터의 담금질 완충액으로 비드를 세 번 세척하여 반응을 멈춥니다. 그런 다음 1밀리리터의 PBS로 구슬을 세 번 씻습니다.

마지막으로, Ray, 부피당 10% 중량의 2마이크로리터로 PBS 1밀리리터에 비드를 매달아 놓습니다. 장기 보관을 위한 Azide. 혈류 세포 분석기로 현탁액의 비드 농도를 측정하면 일반적으로 밀리리터당 10에서 9번째 비드의 1-2배입니다.

튜브에 질소 캡을 채우고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 10cm 페트리 접시 플레이트에서 기하급수적으로 성장하는 알루미늄 세포를 수확하여 이 절차를 시작합니다. 광학적으로 투명한 플라스틱 또는 유리 바닥이 있는 3cm 접시에 다양한 밀도의 세포를 넣고 다음 날 아침 밤새 성장시킵니다.

실험에 사용하기 위해 약 80% confluent인 요리를 선택합니다. 배양 배지를 저유량 또는 LF 배지로 교체하고 HL five C 배양 배지의 세포 외 및 엔도솜 내 자가형광을 줄이기 위해 실험 전 2시간 동안 배양합니다. LF 배지에 1.5 % BDO 한천 10 밀리리터를 녹이고 한천을 평평한 표면에 부어 약 1mm 두께의 한천 층을 형성합니다.

한천이 굳을 때까지 10-15분 동안 기다립니다. 한천 층을 2 x 2cm 정사각형으로 자르고 나중에 사용할 수 있도록 LF 매체에 놓습니다. 쓰다. 광시야 현미경을 수리합니다.

환경 챔버의 온도를 섭씨 22도로 설정하고 실험에 필요한 설정을 조정합니다. 2 시간의 배양 후, 3cm 접시에서 LF 배지를 흡입하되 세포 단층을 배지의 박막으로 덮은 상태로 둡니다. 이전에 준비된 OBG 코팅 비드를 1.5 곱하기 10으로 희석하여 밀리리터당 7번째 비드로 만들고 세포층에 10마이크로리터를 추가합니다.

정사각형 한천 시트 하나를 가져 와서 여분의 액체를 배출하되 한천을 젖은 상태로 유지하십시오. 한천 사각형을 세포층 위에 부드럽게 놓습니다. 한천 오버레이는 비드와 세포 사이의 접촉을 증가시켜 흡수를 향상시킵니다.

또한 세포를 약간 압축하여 대물렌즈의 초점면에 더 잘 유지합니다. 실험의 성공을 위해 접시에 뚜껑을 덮습니다. AGA 오버레이가 세포를 덮고 있을 때 움직이지 말고 이미징 단계를 즉시 시작하는 것이 중요합니다.

다음으로, 접시를 현미경 스테이지에 놓고 2시간 이상 동안 1분마다 빨간색, 녹색 및 위상 채널에서 자동으로 사진을 촬영합니다. ROS 생산을 측정하려면 식세포작용의 전체 과정을 포함하는 세포 이벤트를 선택하고 집중하십시오. 전문 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 최적화된 3개의 채널을 병합하고 사진을 동영상으로 조합합니다.

빨간색 및 녹색 채널에서 선택한 각 beads의 형광 강도를 정량화합니다. 빨간색과 녹색의 비율은 세포의 동적 FOMO R os 생산을 반영합니다. 세포 내 과산화물 생산을 측정하기 위해 먼저 10 밀리리터의 HL 5 C 매체 다음 원심 분리 알루미늄 세포에서 5 분 동안 850 배 G로 180 % 융합 접시의 알리움을 수집하고 SS 6.4 버퍼 카운트 셀에서 배지 재생 탁유 세포를 조심스럽게 완전히 흡인하고 최종 밀도 6 곱하기 10 밀리리터당 6 개의 세포로 희석합니다.

SS 6.4 완충액이 있는 흰색 불투명 96웰 플레이트 묽은 디하이드로 에티듐 또는 DHE 스톡의 각 웰에 50마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 희석된 DHE를 50마이크로리터의 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. DHE의 최종 농도는 30마이크로몰입니다.

반응이 즉시 시작됩니다. 자극 또는 억제제는 특정 필요에 따라 이 시점 또는 다른 시점에 추가될 수 있습니다. 섭씨 22도에서 중간 진탕으로 세포를 배양합니다.

형광 마이크로플레이트 리더기로 1시간 동안 2분마다 형광을 판독합니다. 522 나노미터에서 형광 여기와 605 나노미터에서 방출이 있는 엔드포인트 상단 판독 모드를 사용합니다. 이전 세그먼트에서 설명한 대로 dium cell이 있는 96웰 플레이트를 준비하여 이 절차를 시작합니다.

10ml의 SS 6.4 완충액에 5마이크로리터의 HRP 스톡을 첨가하여 희석된 무 과산화효소 또는 HRP를 준비합니다. 튜브를 뒤집어 잘 섞이고 얼음에 보관하십시오. 희석된 HRP 용액은 밀리리터당 0.05단위입니다.

UR 스톡과 희석된 HRP 용액을 SS 6.4 완충액에 최종 농도 6.25로 혼합하여 plex ultra red 또는 UR 반응 혼합물을 준비합니다. 마이크로몰 A UR 및 밀리리터당 0.005 단위. HRP는 각 웰에 50마이크로리터의 UR 혼합물을 추가합니다.

반응이 즉시 시작됩니다. 자극 또는 억제제는 특정 필요에 따라 이 시점 또는 다른 시점에 추가될 수 있습니다. 섭씨 22도에서 중간 진탕으로 세포를 배양합니다.

형광 마이크로플레이트 리더기로 1시간 동안 2분마다 형광을 판독합니다. 530나노미터에서 형광 여기와 590나노미터에서 방출이 있는 엔드포인트 상단 판독 모드를 사용합니다. OB g 플루오레세인의 코팅 효율은 과산화수소와 HRP를 사용하여 코팅된 비드를 in vitro에서 산화시키고 500나노미터에서 여기를 사용하여 방출 스펙트럼을 확인하여 테스트합니다.

이 그래프에서 볼 수 있듯이, 산화된 비드는 최소 11배에서 12배의 강도 비율을 가진 산화되지 않은 비드와 비교하여 538나노미터에서 상당한 방출 피크를 보여줍니다. dium 세포의 phagosomes에서 ROS의 생성은 uptick 후 1분 동안 6배 배율을 사용하여 40분 동안 기록된 이 대표적인 타임 랩스 동영상에서 볼 수 있듯이 현미경에 의해 정성적 및 동적으로 시각화할 수 있습니다. phagocytosis에 의해, OBG fluoresce coated beads의 형광이 빨간색에서 밝은 주황색으로 변화했는데, 이는 ROS가 phagosome 내부에서 직접 생성되었을 가능성이 있음을 나타냅니다.

세포 내 과산화물 및 세포 외 과산화수소 생산은 각각 DHE 및 UR 분석에 의해 정량적으로 측정됩니다. 이 두 가지 분석법과 관련된 생화학 반응의 요약이 표시됩니다. 과산화물은 과산화물 디스뮤타제 또는 SOD에 의해 과산화수소로 전환되고 과산화수소는 DHE 분석에서 카탈라아제에 의해 물과 산소로 전환됩니다.

마이크로플레이트 리더는 세포 내 과산화물의 중간 처리량 정량 측정에 사용됩니다. 대표적인 실험에 따르면 대장균의 LPSA 지질다당류로 자극했을 때 AX 두 세포의 동적 과산화물 생성은 자극되지 않은 AX 두 세포의 기저 수준보다 유의하게 높으며 완충액에서의 반응 배경, 청색 형광의 감소와 적색 형광의 증가는 반비례 관계가 있습니다. 예상대로.

DHE 분석법으로 측정된 OS 생산의 국소화는 다음과 같은 결과로 확인됩니다. D-E-D-T-C-A 멤브레인 투과성 과산화물 디스뮤타제 억제제의 추가는 용량 의존적 방식으로 DHE 신호를 증가시켰으며, 이는 D-E-D-T-C가 과산화물 디스뮤타제 기질의 축적을 유발했음을 나타냅니다. 대안적으로, 멤브레인 IMP 과산화수소 소광제의 첨가는 A UR 분석에서 과산화물 생성에 영향을 미치지 않았습니다.

마이크로플레이트 리더는 세포 외 과산화수소 생산의 중간 처리량 정량 측정에 사용됩니다. 대표적인 실험에 따르면 LPS로 자극 시 AX 두 세포로부터의 동적 과산화수소 생성은 자극되지 않은 AX 두 세포의 기저 수준보다 유의하게 높으며, 다양한 농도의 D-E-D-T-C 또는 카탈라아제로 처리했을 때 배경 반응, 세포 내 과산화물로부터의 과산화수소 생성 억제 및 세포 외 과산화수소의 고갈로 인해 A UR 신호가 용량 의존적 방식으로 감소하는 것으로 나타났습니다. D-E-D-T-C 및 카탈라아제를 사용한 치료는 DHE와 UR 분석이 이 절차에 따라 ROS Indicum의 다양한 유형과 세포 내 국소화를 특이적으로 측정한다는 것을 명시적으로 확인했습니다.

병원성 또는 비병원성 박테리아에 감염되는 동안 로스 생성을 미러링하는 것과 같은 다른 방법은 Dictal 종마가 손실 생성 측면에서 다른 박테리아 감염에 어떻게 반응하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 그리고 미생물 marum과 같은 병원성 박테리아와 함께 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 BSL과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.