Name: 검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: 학습하세요 아메바 및 포유류 세포에서 활성 산소 종(ROS)을 정량 및 정성 분석하는 방법을. 형광 현미경법과 플레이트 리더 기반 분석을 통해 산화 스트레스 관련 세포 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리는 도움과 이러한 프로토콜을 설정하는 조언 박사 부부 칼 - 하인츠 크라우스와 빈센트 JAQUET에 감사하고, 또한 자신의 기술 지원 NCCR의 바이오 이미징 플랫폼 및 박사 나빈 Gopaldass에서 크리스토프 바우어 제롬 Bosset 감사합니다. 연구는 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 ProDoc의 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 시각화 및 phagosomes를있는 ROS 생산의 질적 측정 OBG - 코팅 된 비드를 미리 준비한다. 비즈 코팅 절차 및 한천 오버레이 기술은 출판 참조 5,14에서 적응됩니다. <ol><li> 1.5 ML 튜브에 3.0 μm의 카르 실리카 비드 (약 1.8 × 10 9 구슬) 1 ㎖ 현탁액을 추가, 비즈 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 25 ㎎ / ㎖ 시안 아미드를 (공유 BSA를 prelabeled 바인딩 카르 실리카 비드를 활성화하는 방법)를 포함하는 PBS 1 ㎖에 구슬을 재현 탁, 15 분 동안 바퀴에 품어. </li><li> 커플 링 버퍼의 1 ㎖로 세척 배 빠른 스핀으로 (0.1 M 붕산 나트륨, 산도 8.0) (또는 5 초 동안 테이블 탑 미니 원심 분리기의 최대 속도로 원심 분리기 또는 테이블 톱 원심 분리기에서 1 분 2,000 XG에 원심 분리기)와 과량의 시안 아미드를 제거하는 텍싱. </li><li> C 500 μL로 세척 구슬을 혼합OxyBurst 그린 (OBG) H2HFF (디 하이드로-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;- hexafluorofluorescein)-BSA의 1 ㎎을 함유하는 버퍼를 oupling 표준 상한까지 고로 가스 수에서 질소 가스 튜브를 채우고, 어둠 속에서 실온에서 14 시간 (야간)의 바퀴에 품어. </li><li> 구슬이 (PBS에서 글리신 250 ㎜)의 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 담금질 버퍼를 제거하는 커플 링 버퍼로 두 번 반응 OBG를 제거하고 버퍼를 급냉 1 ㎖로 2 배 씻는다. </li><li> BSA에 활용하는 알렉사 형석 594 숙신 에스테르 50 μg을 함유하는 커플 링 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 모자를 씌우기 전에 질소 주입 튜브, 그리고 어둠 속에서 실온에서 1.5 시간 동안 바퀴에 품어. </li><li> 구슬이 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 세척 한 후, 구슬이 빠른 스핀과 반응을 중지 소용돌이로 교반하여 버퍼를 급냉 1 ㎖로 3 배 씻으십시오. </li><li> 마지막으로, 장기 저장을위한 V 지드 / w 10 %의 2 μL로 PBS 1 ㎖에 비드를 재현 탁. concentratio을 측정혈구 (보통 1 ~ 2 × 10 9 구슬 / ㎖)와 서스펜션에있는 구슬의 N은, 모자를 씌우는 전에 질소 튜브를 채우고, 어둠 속에서 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> OBG의 형광의 코팅 효율은 500 nm에서 여기를 이용한 방출 스펙트럼을 확인하여 시험 될 수있다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)의 존재하에 H 2 O 2에 의해 산화되면, 발광 피크 (538 NM)에서 산화 비드의 형광 강도는 nonoxidized 코팅 비드에 비해 11 ~ 12 배 높다. </li><li> 수확은 기하 급수적으로 광학적으로 투명한 플라스틱이나 유리 바닥에 3cm 접시에 세포의 밀도가 다른 접시, 밤새 그들을 성장, 10cm 페트리 접시에서 Dictyostelium의 세포를 성장. 실험에 대해 80 %의 합류 요리를 선택합니다. Dictyostelium의 세포 배양에 대한 자세한 프로토콜 15을 발표했습니다. </li><li> 하세요! loflo 매체 (LF 매체)로 배지를 교체, 알을 품다HL5C 배지의 세포 및 intraendosomal 형광도를 감소시키기 위하여 실험 전 2 시간. </li><li> 병행 10-15 기다려, 약 1 ㎜ 두께 한천 층을 형성하기 위해 평탄면 (x 10cm 10cm의 즉 유리판)에 한천을 넣어 LF 배지에 10 ml의 1.5 % 박토 한천 녹지 분 응고한다. 나중에 사용하기 위해 LF 매체에 2cm X 2cm 사각형과 장소에 한천 층을 잘라. </li><li> 한편, 회전하는 디스크 또는 넓은 필드 현미경을 준비하고 22 ° C의 환경 챔버의 온도를 설정하고이 실험에 대한 설정을 조정합니다. (토론에 추가 의견을 참조하십시오.) </li><li> 배양 2 시간 후, 3cm 접시로부터 LF 매체를 대기음하지만 세포 단일 층은 여전히​​ 매체의 박막에 의해 보호되어야한다. 1.5 × 10 7 구슬 / ㎖로 코팅 구슬을 희석하고, 세포 층에 10 μl를 추가합니다. </li><li> 하나 스퀘어 한천 장을 가지고, 과잉 액체를 배출하지만 계속 젖은 상태. 조심스럽게 일을 넣어전지 층의 위에 전자 한천 사각형. 그것은 세포에 누워 때 한천 광장을 이동하지 마십시오. 한천 오버레이함으로써 흡수를 향상 구슬과 세포 사이의 접촉을 증가시키는 데 사용하고, 또한 약간의 대물 초점면에 더 잘 유지, 세포를 압축한다. </li><li> , 접시에 뚜껑을 배치 현미경 스테이지에 배치하고 자동으로 적색, 녹색 및 위상 채널에서 사진을 찍고 2 시간 이상마다 1 분. </li><li> 선택 식균 작용의 전 과정을 포함하는 세포 사건에 초점을 맞 춥니 다. 최적화 된 3 채널 병합 및 전문 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 동영상으로 사진을 조립한다. 빨간색과 녹색 채널에서 선택한 각 구슬의 형광 강도를 정량화하고, 그린 / 레드의 비율은 세포의 동적 phagosomal ROS 생산을 반영합니다. </li></ol> 2. 세포 내 과산화물 생산의 정량 및 중간 처리량 측정 <ol><li> (을)를 수집NE 80 %의 합류 HL5C 배지 10 ㎖에 Dictyostelium의의 요리. 5 신중 분, 완전히 대기음 초과 매체 850 XG에 원심 분리기 Dictyostelium의 세포. SS6.4 버퍼에 재현 탁 세포 [소렌슨 버퍼에 0.12 M 소르비톨 (14.69 밀리미터 KH 2 PO 4, 6.27 mM의 나 2 HPO 4), pH를 6.4], 셀 카운트 및 6 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 희석 (토론에 추가 의견을 참조). </li><li> (토론에 추가 의견을 참조) 흰색 불투명 한 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 필요한 경우 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여에 DHE 재고 (DMSO 30 ㎜)로 희석 DHE의 SS6.4, 피펫 50 μl의 500 배 희석. DHE의 최종 농도는 30 μM이다. 반응이 즉시 시작됩니다. </li><li> 자극 또는 억제 특정 요구에 따라이 시점에서 추가, 또는 다른 시간 지점에서 할 수있다. </li><li> 엔드 포인트 &quot;최고 읽기 &amp; #을 사용하여(34) 522 nm/605 nm에서 형광 여기 / 방출과 형광 마이크로 플레이트 리더의 모드는, 22 ℃에서 1 시간, 중간 흔들림 5 초 / 분마다 2 분을 읽어 </li></ol> 3. 양적 및 세포 외의 높은 처리량 측정 H 2 O 2 생산 <ol><li> 2.1 및 2.2과 동일한 단계를 따릅니다. </li><li> SS6.4, 소용돌이 10 ㎖에 HRP 주식의 5 μL (증류수 100 U / ㎖)를 첨가하여 희석 한 HRP를 준비하거나 잘 혼합하고 나중에 사용하기 위해 얼음에 계속 튜브를 반전. 희석 된 HRP 솔루션은 0.05 U / ㎖에 있습니다. </li><li> 각각 AUR 재고 (DMSO 10 ㎜ AUR)와 6.25 μM의 최종 농도에 SS6.4 버퍼에 희석 한 HRP 솔루션, 0.005 U / ㎖를 혼합하여 AUR 반응 혼합물을 준비합니다. 예로서, 40 반응에, 반응 혼합물을 제조 희석 HRP의 400 μL와 AUR 스톡 용액 2.5 μL로 SS6.4 1600 μL를 혼합한다. </li><li> AUR 믹스의 50 μl를 추가합니다필요한 경우 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여에 진짜야. 지금 반응이 시작됩니다. </li><li> 자극 또는 억제 특정 요구에 따라이 시점에서 추가, 또는 다른 시간 지점에서 할 수있다. </li><li> 530 nm/590 nm에서 형광 여기 / 방출과 형광 마이크로 플레이트 리더의 종점 &quot;최고 읽기&quot;모드를 사용하여, 22 ℃에서 1 시간, 중간 흔들림 5 초 / 분마다 2 분을 읽어 </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전술 한 방법에 비해, OBG 분석법 동적 대신 세포 집단에서 보통 ROS 신호 측정, 단일 세포 수준에서 phagosomal ROS 생성의 과정을 시각화한다. 이러한 인구 평균 방법은 비동기 식균 작용에 의한 중요 정보를 모호하게하는 경향이있다. 우리는 성공적으로 Dictyostelium의에 DHE와 AUR 분석을 적용하고 프로토콜을 최적화. 가장 중요한 것은, 우리는이 두 가지 분석에 의해 측정 된 유형과 ROS의 세포 내 현지화를 지정했습니다. 이와 함께, Dictyostelium의에 대한 ROS 측정 프로토콜의 전체 집합은 선천성 면역, 세포 분화 및 세포 내 신호로 ROS와 관련된 세포 메커니즘을 연구하기 위해 유용하고 강력한 시스템을 제공합니다. OBG 분석의 경우, 코팅 된 비드의 제조는 실험의 성공에 중요하다. 때문에 포유류의 수용체 매개 식세포 이해의 복잡성N 전지, 입자는 섭취를 트리거 (예 : IgG를 포함)...

활성 산소 종 (ROS)는 같은 호스트 방어, 신호, 조직 개발 및 부상에 대한 응답뿐만 아니라 고혈압과 암과 같은 생물 학적 과정의 다양한 참여하고 있습니다. 잘 공부 phagosomal의 NADPH 산화 효소 기계는 호중구 &#39;phagosomes를 1 섭취 박테리아를 죽이고, 산화 버스트로 알려진 신속한 ROS 생성에 최선을 다하고 있습니다. 또한, 미토콘드리아 호흡 사슬의 부산물로서 전자의 누출은 이전에는 ROS의 규제 소스에 대한 책임을 져야하는 것으로 생각되었다. 그러나 최근에는 마우스 대 식세포 2 박테리아의 intraphagosomal 살인에 기여하는 중요한 메커니즘으로 확인되었다. 최근 몇 년 동안, 사회 아메바, Dictyostelium의는 타고난 면역 반응의 세포 고유의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력하고 인기있는 모델이되고 있습니다. 실제로, Dictyostelium의 인간 식세포는 molecula 보전의 놀라 울 정도로 높은 수준을 공유박테리아, 말림을 감지하고 3,4 살인에 대한 책임을 R의 기계. 단백질과 같은 NADPH 산화 효소, 카탈라제, 슈퍼 옥사이드 dismutases으로 ROS의 생산 해독 관련 효소의 동족체는, 인간과 Dictyostelium의 모두에서 찾을 수 있습니다. 최고의 공부 아메바으로, Dictyostelium의 포유 동물 모델 시스템에 대한 몇 가지 독특한 장점을 제공한다. 그들은 8-10 시간의 배가 시간으로, CO 2에 대한 필요없이 상온에서 성장한다. 그들은 쉽게 부착 또는 현탁액 문화로 유지 될 수있다. 또한, 자신의 완전한 염기 서열과 주석 반수체 게놈, 쉬운 유전자 조작 덕분에, Dictyostelium의 매우 매력적인 실험 모델 생물이되고있다. 이전의 연구에서, ROS에 의한 산화 후 형광을 방출 (이하 OxyBurst 녹색, OBG라고도 함) 형광의 다양한 염소와 불소 유도체, ROS의 기자로 사용되어왔다. 세포 투과 동부 표준시휴대 impermeant 덱스 트란 또는 단백질 결합 유도체는 ROS 세포를 측정하기 위해 사용되는 반면 erified 유도체, 세포질 ROS를 측정하는 데 사용된다. 특히, OBG BSA 코팅 된 비드 이미 포유류 세포 소재 phagosomal ROS의 생성을 검출하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 마이크로 플레이트 리더 기반 접근법은 단지 세포 집단에서 평균화 ROS 생성 커브를 줄 수있다. 본 프로토콜로, Dictyostelium의 전문 식세포, 최적화 실험 조건을 사용하여, 우리는 구슬에 어떤 opsonin 공역없이 안정적이고 효율적으로 식균 작용을 구하십시오. DHE는 ROS 생산 6-9를 검출하는 그러한 포유류 호중구 및 대 식세포 등 다양한 모델 시스템에 사용되어왔다. 한편, 방법 8,10의 민감도와 특이도를 통해 몇 가지 논쟁이있다. Amplex 레드, AUR을 측정하는 것이 더 적합하다 산도에 덜 민감의 형광 강도의 개선 된 버전으로nonneutral 또는 약산성 milieus에서 ROS. AUR은 최근 여러 포유류의 시스템 (11, 12)에 적용되어 있지만, 꽤 자주 약산성 성장 미디어를 필요로 nonmammalian 모델에서의 사용은 아직보고되지 않았습니다. 또한, 정량적 동적 사회적 아메바 Dictyostelium의에서 ROS 생산 및 국산화를 측정 할 수있는 게시 된 프로토콜이 없습니다. 프로토콜 제시된 세트의 목표는 다양한 ROS 및 현지화를 모니터링하기 쉽고 다양한 솔루션을 제공하고, 또한 ROS 관련 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. OBG 분석을 위해, 우리는 Dictyostelium의 세포로 OBG 코팅 구슬의 흡수 후 phagosomal의 ROS 생성의 전 과정을 모니터링하는 라이브 현미경을 사용하고, 박테리아의 intraphagosomal 살인의 메커니즘을 연구하기 위해 새로운 접근 방식을 제공했다. 우리는 세포 내 superox을 측정하기 위해, Dictyostelium의 매체 처리량 DHE와 AUR 분석를 최적화강력한 ROS 자극으로 LPS를 사용하여 각각 IDE 및 세포 H 2 O 2 생산. LPS 최근 포식 균 (13)를 향해 Dictyostelium의의 살균 활성을 증가 표시했다합니다. 또한, DEDTC 및 catalase의 치료는 명시 적으로 두 가지 방법이 구체적으로 다양한 종류와 Dictyostelium의에서 ROS의 세포 내 현지화를 측정하는 것을 확인했다. 마지막으로, OBG 분석은 상기 동물 세포의 식세포 수용체에 대한 리간드와 함께 비즈 opsonizing 의해, 어떤 접착 식세포 세포에 적용 할 수있다. 원칙적으로, DHE와 AUR 분석은 미세 조정 적절한 실험 조건에서 어떤 부착 또는 비 접착 세포에서 측정 할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylated silica beads</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C 매체</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo 매체</td><td></td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>디 하이드로 에티</td><td>듐 시그마</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>양 고추 냉이 과산화 효소</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td> <td>시그마</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>카탈라제</td><td>시그마</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>시안아미드</td><td>시그마</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>지방다당류</td><td>시그마</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-접시 35 mm, 높은</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>광학적으로 투명한 플라스틱으로 만든 바닥</td></tr><tr><td>MatTek 접시 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>바닥은 유리 커버슬립</td></tr><tr><td>홀 셀 카운터</td><td>Merck Millipore PHCC00000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>White 96 웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 리더</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

활성 산소 종 (ROS)는 동적으로 상호 전환 또는 하나 촉매 또는 자발적으로 제거하는 반응과 짧은 수명, 산소 함유 분자의 범위를 포함한다. 때문에 대부분의 ROS와 그 소스와 세포 내 현지화의 다양성의 짧은 제품 수명에 완전한 그림은 프로토콜의 조합을 사용하여주의 측정에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서, 우리는 OxyBurst 그린 (OBG)를 사용하여 세 가지 다른 프로토콜의 집합 코팅 구슬, 또는 dihydroethidium (DHE)를 제시하고 Amplex UltraRed (AUR)는 질적 및 양적 같은 Dictyostelium의 등 전문 식세포의 다양한 ROS를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 동적으로 단일 세포 수준에서 intraphagosomal ROS의 생성을 시각화하는 비즈 코팅 절차 및 사용 OBG 코팅 구슬과 라이브 현미경을 최적화. 우리는 E.에서 지질 다당류 (LPS)를 확인 Dictyostelium의에서 ROS의 생성을위한 자극제로 대장균. 또한, 우리는 거라고eveloped 실시간 정량적으로 각각 세포 내 과산화물 및 세포 H 2 O 2의 생산을 측정하기 위해 DHE와 AUR를 사용하여 중간 처리량 분석.

된 phagosomes에 ROS의 생성은 현미경 (파일 S1)에 의해 성적으로 동적으로 시각화 할 수 있습니다. 알렉사 형석 594에 의해 방출되는 적색 형광은 pH를 구분하고 OBG의 산화 녹색 채널의 형광을 증가하는 동안, phagosomal 환경에서 일정하게 유지된다. 체외의 방출 스펙트럼은 산화 nonoxidized OBG 코팅 비드 산화 후의 강도의 상당한 증가를 나타내는,도 1b에 비교된다. 라이브 이벤트의 시각화를 용이하게하기 위해, 두 채널이 흡수 1 분 이내에 야생형 AX2 세포에 의해 합병 식균 작용 동안 오렌지 적색에서 결과 색상 변경됩니다. 녹색 형광의 증가는의 phagosome에 가능 직접 ROS의 생성을 나타냅니다. 마이크로 플레이트 리더, 세포 내 과산화물의 매체 처리량 정량적 측정 세포 및 H를 사용하여 2 O 2 생산 Figu에 나타낸다각각 2C <st...

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

다음 실험의 전반적인 목적은 다양한 활성 산소종(ROS)과 그 위치를 모니터링할 수 있는 쉽고 다용도한 솔루션을 제공하여, ROS 관련 세포 기전에 대한 추가적인 통찰력을 제공하는 것입니다. 이는 세 가지 서로 다른 분석법을 수행함으로써 달성되며, 그중 첫 번째 방법은 RST green 또는 OB G 코팅 비즈와 라이브 현미경 관찰을 사용합니다. OB G fluorescein과 Alexa Fluor 594는 BSA를 통해 3µm silica 비즈 표면에 공유 결합되어 있습니다.OBG fluorescein의 형광 방출은 ROS에 의한 산화를 나타내며, Alexa Fluor 594의 신호는 비드를 국소화하고 형광 정량화를 위한 대조군 역할을 합니다. 두 번째 방법은 플레이트 리더 기반 분석에서 초과산화물 민감성 프로브인 dihydro ethidium 또는 DHE를 이용합니다. 초과산화물에 의한 산화 결과로 ethidium은 핵 및 미토콘드리아 DNA에 삽입될 수 있으며, 여기 및 방출 피크가 각각 522 nanometers와 605 nanometers로 이동합니다.AUM의 형광 강도는 슈퍼옥사이드 생성량에 비례하며, 이를 통해 세포 내 슈퍼옥사이드 생성량을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 세 번째 방법 또한 플레이트 리더 기반의 분석법입니다. 과산화수소 민감성 프로브인 plex ultra red 또는 a UR을 사용하여 세포 외 과산화수소 생성량을 정량적으로 측정합니다.UR OX의 형광 강도는 세포 외부에서 생성된 과산화수소의 양에 해당합니다. O-B-G-D-H-E 및 UR 분석을 바탕으로 동적인 ROS 생성의 국소화를 보여주는 결과가 도출됩니다. 플레이트 속도 기반 OB GSA와 같은 다른 기존 방법들에 비해 이 기술이 가지는 주요 장점은 단일 세포 수준에서 Al Roth 생성을 동적으로 시각화한다는 점입니다.세포 집단으로부터 미러링 및 평균화된 Roth 신호를 얻는 대신 사용합니다. 이러한 집단 평균화 방법은 비동기적 식세포 작용으로 인해 중요한 정보가 가려지는 경향이 있습니다. oxy, Burt Green 또는 OBG로 비드를 코딩하는 절차를 시작하려면, 3.0 micron 카르복실화 실리카 비드 현탁액 1 milliliter를 1.5 milliliter 튜브에 넣습니다.튜브를 원심 분리한 후 상층액을 빠르게 제거합니다. PBS 1 mL를 첨가하고 동일한 방식으로 볼텍싱합니다. PBS로 비드를 3회 세척합니다.세 번째 세척 후, 상층액을 제거하고 비드를 재현탁합니다. 25 mg/mL의 시안화물이 포함된 1 mL의 PBS(시안화물 용액은 사용 전 매번 새로 조제해야 함)에서 휠 로테이터를 이용하여 15분 동안 인큐베이션합니다. 이 과정을 통해 카르복실화 실리카 비드가 활성화되어 미리 라벨링된 BSA와 공유 결합하게 됩니다. 15분 후, 튜브를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.커플링 완충액 1 mL를 첨가하고, 퀵 스핀 및 볼텍싱을 통해 커플링 완충액으로 3회 세척하여 과량의 시안화물을 제거합니다. 세척된 비드를 1 mg의 OBGH two H-F-F-B-S-A가 포함된 커플링 완충액 500 µL와 혼합한 후, 표준 가스 캔의 질소 가스로 튜브를 채웁니다. 튜브의 캡을 닫고 암실 상태의 상온에서 휠 위에서 14시간 동안 배양합니다. 다음 날, 퀵 스핀 및 볼텍싱을 통해 1 mL의 퀀칭 완충액으로 비드를 2회 세척하여 반응하지 않은 OBG를 퀀칭시킨 후, 커플링 완충액으로 2회 세척하여 퀀칭 완충액을 제거합니다. 상층액을 제거한 후, BSA와 결합시키기 위해 50 µg의 LOR 594 cin a middle ester가 포함된 커플링 완충액 1 mL를 첨가합니다.튜브를 질소 캡으로 채우고 상온의 암실 내 휠 위에서 1.5시간 동안 배양합니다. 1.5시간의 배양이 끝나면, 1 mL의 퀀칭 버퍼로 비드를 세 번 세척하여 반응을 중지시킵니다. 이어서 1 mL의 PBS로 비드를 세 번 세척합니다.마지막으로 Ray, 10% w/v Azide 2 µL가 포함된 PBS 1 mL에 비즈를 현탁하여 장기 보관하십시오. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 현탁액 내 비즈의 농도를 측정하며, 이는 일반적으로 mL당 1~2 × 10⁹개의 비즈입니다.튜브를 질소 캡으로 밀봉하여 4°C 암소에 보관하십시오. 10 cm 페트리 접시에서 대수 성장기의 alium 세포를 수확하여 이 절차를 시작합니다. 광학적으로 투명한 플라스틱 또는 유리 바닥의 3 cm 접시에 서로 다른 밀도로 세포를 분주하고 다음 날 아침까지 밤새 배양합니다.실험에 사용할 약 80% 합류도(confluent)의 디쉬를 선택합니다. HL-5C 배지의 세포 외 및 세포 내 엔도좀 자동형광을 감소시키기 위해, 실험 전 배양액을 저유동(low flow) 또는 LF 배지로 교체하고 2시간 동안 배양합니다. LF 배지에서 1.5% BDO agar 10 milliliters를 녹인 후, 평평한 표면에 부어 약 1 millimeter 두께의 agar 층을 형성합니다.한천(agar)이 응고될 때까지 10분에서 15분 동안 기다립니다. 한천 층을 2x2 cm 크기의 정사각형으로 자른 후, 나중에 사용할 수 있도록 LF 배지에 넣어 둡니다. 광시야 현미경(widefield microscope)을 준비합니다.환경 챔버의 온도를 22 °C로 설정하고 실험에 필요한 세팅을 조정합니다. 2시간 동안 배양한 후, 3 cm 디쉬에서 LF 배지를 흡입하되 세포 단층이 얇은 배지 막으로 덮여 있도록 합니다. 이전에 준비한 OBG 코팅 비즈를 1.5 × 10⁷ beads/mL로 희석하여 세포층 위에 10 µL를 첨가합니다.정사각형 한 장의 한천 시트를 꺼내 여분의 액체를 제거하되, 한천이 젖은 상태를 유지하도록 합니다. 한천 사각형을 세포층 위에 조심스럽게 올립니다. 한천 오버레이는 비드와 세포 사이의 접촉을 증가시켜 섭취 효율을 높여줍니다.또한 이는 세포를 약간 압착하여 대물렌즈의 초점 평면에 더 잘 유지되도록 합니다. 실험의 성공을 위해 디쉬 위에 뚜껑을 덮으십시오. AGA 오버레이가 세포를 덮고 있을 때 이를 움직이지 마십시오. 또한 즉시 이미징 단계를 시작하는 것이 매우 중요합니다.다음으로, 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓고 적색, 녹색 및 위상 채널에서 2시간 또는 그 이상 동안 매분 자동으로 사진을 촬영합니다. ROS 생성을 측정하려면 식세포 작용의 전 과정이 포함된 세포 이벤트를 선택하여 초점을 맞춥니다. 전문 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 최적화된 세 채널을 병합하고 사진들을 모아 동영상을 제작합니다.적색 및 녹색 채널에서 선택된 각 비드의 형광 강도를 정량합니다. 적색과 녹색의 비율은 세포의 동적인 FOMO R os 생성을 반영합니다. 세포 내 superoxide 생성을 측정하려면, 먼저 80% confluence 상태의 alium 배양 접시를 10 mL의 HL five C 배지로 수집합니다. 다음으로 alium 세포를 850 ×g에서 5분 동안 원심 분리하고, 배지를 조심스럽게 완전히 흡입하여 제거합니다. 세포를 SS 6.4 버퍼에 재부유시킨 후, 세포 수를 측정하여 최종 밀도가 6 × 10⁶ cells/mL가 되도록 희석합니다.흰색 불투명 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 50 µL를 넣습니다. dihydro ethidium(DHE) 스톡 솔루션을 SS 6.4 버퍼로 500배 희석합니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석된 DHE 50 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. DHE의 최종 농도는 30 µM입니다.반응이 즉시 시작됩니다. 특정 필요에 따라 이 시점이나 다른 시점에 자극제 또는 억제제를 추가할 수 있습니다. 배지를 흔들어주며 22 °C에서 세포를 배양합니다.형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 1시간 동안 2분 간격으로 형광을 측정합니다. 형광 들뜸 파장은 522 nanometers, 방출 파장은 605 nanometers로 설정하고 endpoint top reading 모드를 사용하십시오. 이전 세그먼트에서 보여준 것과 같이 dium 세포가 담긴 96 well plate를 준비하여 이 절차를 시작하십시오.HRP 스톡 5 µL를 SS 6.4 버퍼 10 mL에 첨가하여 희석된 horse radish peroxidase(HRP)를 준비합니다. 튜브를 반전시켜 잘 혼합한 후 얼음 위에 보관합니다. 희석된 HRP 용액의 농도는 0.05 units/mL입니다.a UR 스톡과 희석된 HRP 용액을 SS 6.4 버퍼에 혼합하여 a UR의 최종 농도가 6.25 µM, HRP의 최종 농도가 0.005 units/mL가 되도록 plex ultra red 또는 a UR 반응 혼합물을 준비합니다. 각 웰에 a UR 혼합물 50 µL를 첨가합니다.반응이 즉시 시작됩니다. 특정 필요에 따라 이 시점 또는 다른 시점에 자극제나 억제제를 첨가할 수 있습니다. 22 °C에서 배지를 흔들어주며 세포를 배양합니다.형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 1시간 동안 2분 간격으로 형광을 측정합니다. 형광 들뜸 파장은 530 nanometers, 방출 파장은 590 nanometers로 설정하고 엔드포인트 상단 측정 모드를 사용하십시오. OB g fluorescein의 코팅 효율은 hydrogen peroxide와 HRP를 사용하여 코팅된 비드를 in vitro에서 산화시키고, 500 nanometers의 들뜸 파장을 이용해 방출 스펙트럼을 확인하여 테스트합니다.이 그래프에서 보듯, 산화된 비드는 비산화 비드와 비교하여 538 nanometers에서 유의미한 방출 피크를 보이며, 그 강도 비율은 최소 11배에서 12배에 달합니다. dium 세포의 phagosome 내 ROS 생성은 섭취 후 첫 1분 동안 6배 배율로 40분간 기록된 이 대표적인 타임랩스 영상에서 보듯 현미경을 통해 정성적 및 동적으로 시각화할 수 있습니다. phagocytosis에 의해 OBG fluoresce 코팅 비드의 형광이 빨간색에서 밝은 오렌지색으로 변했으며, 이는 ROS가 phagosome 내부에서 직접 생성되었을 가능성이 높음을 나타냅니다.세포 내 superoxide와 세포 외 hydrogen peroxide의 생성량은 각각 DHE 및 UR 분석법을 통해 정량적으로 측정됩니다. 이 두 분석법과 관련된 생화학적 반응의 요약이 제시되어 있습니다. DHE 분석법에서 superoxide는 superoxide dismutase(SOD)에 의해 hydrogen peroxide로 전환되며, hydrogen peroxide는 catalase에 의해 물과 산소로 전환됩니다.마이크로플레이트 리더는 세포 내 superoxide의 중간 처리량 정량 측정에 사용됩니다. 대표적인 실험 결과에 따르면, e coli 유래 LPSA lipopolysaccharide로 자극했을 때 AX two 세포의 동적인 superoxide 생성은 자극하지 않은 AX own 세포의 기저 수준 및 버퍼 내 반응 배경값보다 유의하게 높으며, 청색 형광의 감소와 적색 형광의 증가는 예상대로 역상관 관계를 보입니다.DHE 분석법으로 측정된 R os 생성 위치는 다음과 같은 결과로 확인되었습니다. 막 투과성 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 억제제인 D-E-D-T-C-A를 첨가하자 DHE 신호가 농도 의존적으로 증가했으며, 이는 D-E-D-T-C가 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 기질의 축적을 유발했음을 나타냅니다. 반면, 막 투과성 과산화수소 소거제인 IMP를 첨가했을 때는 A UR 분석법에서 슈퍼옥사이드 생성에 영향을 주지 않았습니다.마이크로플레이트 리더는 세포외 과산화수소 생성의 중간 처리량 정량 측정에 사용됩니다. 대표적인 실험 결과에 따르면, LPS로 자극했을 때 AX two 세포의 동적 과산화수소 생성은 자극하지 않은 AX own 세포의 기저 수준보다 유의하게 높았으며, 다양한 농도의 D-E-D-T-C 또는 카탈라아제를 처리했을 때 A UR 신호는 각각 세포 내 슈퍼옥사이드로부터의 과산화수소 생성 억제와 세포외 과산화수소의 고갈로 인해 농도 의존적으로 감소했습니다. D-E-D-T-C와 카탈라아제 처리를 통해 DHE 및 a UR 분석법이 ROS의 서로 다른 유형과 세포 내 국소 부위를 특이적으로 측정함을 명확히 확인했으며, 이 절차는 다음과 같습니다.손실 세대 측면에서 Dictal stallion이 서로 다른 박테리아 감염에 어떻게 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 병원성 또는 비병원성 박테리아 감염 중 Ross 생성을 모방하는 등의 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 또한 microbacteria marum과 같은 병원성 박테리아를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 BSL 2 조치와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

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